張競(jìng)丹，孫平平，張 佳，張 磊，呂文霞，馬 強(qiáng)，李正男*

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古中加農(nóng)業(yè)生物科技有限公司，內(nèi)蒙古 烏蘭察布 011800）

馬鈴薯（Solanum tuberosumL.）是世界主要的糧食作物，2020 年中國(guó)馬鈴薯種植面積約465.61萬hm2，產(chǎn)量約1 798.3 萬t，栽培面積約占全球的27%，總產(chǎn)量約占世界總產(chǎn)量的25%[1]；內(nèi)蒙古自治區(qū)是中國(guó)馬鈴薯重點(diǎn)產(chǎn)區(qū)，2020 年種植面積為27.74 萬hm2，產(chǎn)量高達(dá)124.2 萬t。由于馬鈴薯種植面積的逐年增加，倒茬等農(nóng)耕措施目前已經(jīng)很難實(shí)現(xiàn)，所以土傳性病害的發(fā)生逐年加重，特別是馬鈴薯黑脛病呈現(xiàn)逐年增長(zhǎng)的趨勢(shì)。

馬鈴薯黑脛病是對(duì)馬鈴薯種植有嚴(yán)重危害的病害，該病害對(duì)中國(guó)各地區(qū)的馬鈴薯種植都有極大影響，危害較輕的地區(qū)地塊發(fā)病率在2%~5%，在危害較嚴(yán)重的區(qū)域，地塊發(fā)病率最高達(dá)到了50%，給中國(guó)馬鈴薯種植業(yè)造成了巨大的損失[2]。目前所知的馬鈴薯黑脛病的主要病原菌有黑腐果膠桿菌（Pectobacterium atroseptica）、胡蘿卜軟腐果膠桿菌巴西亞種[3（]P. carotovorumsubsp.brasiliensis）、胡蘿卜軟腐果膠桿菌胡蘿卜亞種[4（]P. carotovorumsubsp.carotovorum）以及菊果膠桿菌[5（]P.chrysanthemi）。對(duì)內(nèi)蒙古自治區(qū)馬鈴薯黑脛病病原菌的研究較少。李克萊[6]與王旭等[7]在內(nèi)蒙古自治區(qū)呼和浩特市區(qū)和多倫地區(qū)發(fā)現(xiàn)了由P. atroseptica引起的馬鈴薯黑脛?。惶锲G麗等[8]在內(nèi)蒙古自治區(qū)錫林郭勒盟發(fā)現(xiàn)由P. carotovorumsubsp.brasiliensis單一侵染引起的馬鈴薯黑脛病。帶菌種薯是馬鈴薯黑脛病傳播的主要途徑，病原菌可以通過傷口直接侵染[9]，還可以通過灌溉水、昆蟲、土壤等其他田間物質(zhì)傳播[10,11]。感病植株的帶病種薯最先發(fā)病，由匍匐莖傳至莖基部使其變黑，嚴(yán)重時(shí)呈水漬狀腐爛，逐漸擴(kuò)展到莖上部；使得養(yǎng)分和水分無法傳導(dǎo)至葉片，引起葉片出現(xiàn)卷曲皺縮、褪綠黃化等現(xiàn)象；最終莖稈腐爛，植株全部枯死[12-14]。

馬鈴薯黑脛病防控治療的最佳方法是培育馬鈴薯高抗品種。中國(guó)目前很少有針對(duì)于馬鈴薯黑脛病的抗性品種篩選方面的研究，宋揚(yáng)等[15]參照Lapwood等[16]的方法并改進(jìn)后成功測(cè)試了美國(guó)緬因州的24份馬鈴薯品種對(duì)黑脛病菌Dickeya dianthicolaME30和P.wasabiaeWPP163的抗性，認(rèn)為‘Ranger Russet’和‘Sangre’2 個(gè)品種對(duì)2 種病原菌均具有良好的抗性能力。王立春等[17]采用將腐爛區(qū)域進(jìn)行分級(jí)抗性評(píng)定的方法對(duì)來自不同國(guó)家及地區(qū)的40個(gè)馬鈴薯品種進(jìn)行評(píng)價(jià)和篩選，結(jié)果表明歐美地區(qū)馬鈴薯品種呈高抗，國(guó)內(nèi)品種抗性水平主要集中在中感及中抗上。但是，對(duì)內(nèi)蒙古自治區(qū)馬鈴薯品種的抗性篩選尚未見報(bào)道。因此，本試驗(yàn)對(duì)在內(nèi)蒙古自治區(qū)各地區(qū)采集的馬鈴薯品種的抗性進(jìn)行評(píng)價(jià)，期望篩選出對(duì)馬鈴薯黑脛病具有抗性的品種，為馬鈴薯高質(zhì)量生產(chǎn)做出貢獻(xiàn)。

1 材料與方法

1.1 供試病原菌

馬鈴薯黑脛病病原菌P. atrosepticumTDHJ7，由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝作物病害病原生物學(xué)及綜合防控實(shí)驗(yàn)室分離自內(nèi)蒙古自治區(qū)武川縣表現(xiàn)顯著黑脛病癥狀的‘費(fèi)烏瑞它’馬鈴薯莖基部，純化菌株置于20%甘油中，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 供試馬鈴薯品種

馬鈴薯品種為‘V7’‘英尼維特’‘費(fèi)烏瑞它’‘大西洋’‘冀張薯 12 號(hào)’‘夏坡蒂’‘布爾斑克’‘中加7 號(hào)’和‘中加2 號(hào)’，由內(nèi)蒙古中加農(nóng)業(yè)生物科技有限公司提供。

1.3 供試試劑

LBA 固體培養(yǎng)基：10 g 胰蛋白胨，10 g NaCl，5 g酵母提取物，20 g瓊脂粉，1 000 mL去離子水。

LB液體培養(yǎng)基：不含瓊脂粉，其余與LBA相同。

1.4 馬鈴薯塊莖抗性評(píng)價(jià)

1.4.1 菌懸液的制備

取 100 μL 在-80℃環(huán)境下保存的 TDHJ7 涂在LBA 固體培養(yǎng)基上，28℃復(fù)壯48 h。挑取單菌落接種于100 mL 高溫滅菌過的LB 液體培養(yǎng)基中，28℃、180 r/min 培養(yǎng)48 h，將菌懸液濃度調(diào)至106cfu/mL。

1.4.2 塊莖接種

選取無病無傷的9 個(gè)供試馬鈴薯品種，于1%次氯酸鈉溶液中浸泡5 min，達(dá)到消毒的目的，無菌水清洗3次后晾干備用。將馬鈴薯切成寬2 cm的厚片，并依次在馬鈴薯切片中央用無菌打孔器打一個(gè)直徑 4 mm × 深 2 mm 的圓孔，加入 10 μL 菌懸液，每個(gè)品種重復(fù)3次，以接種等量無菌水的薯塊作為對(duì)照組。將浸滿去離子水的滅菌濾紙鋪入滅菌培養(yǎng)皿中，蓋上皿蓋確保濕度。置于恒溫25℃的黑暗培養(yǎng)箱培養(yǎng)36 h后，調(diào)查其發(fā)病情況。

1.4.3 發(fā)病情況調(diào)查

參照Lapwood 等[16]的方法測(cè)量腐爛區(qū)域的病斑直徑，沿接種點(diǎn)縱切，測(cè)量薯塊縱切面接種點(diǎn)以下腐爛區(qū)域的深度和寬度（mm），以其乘積的值的平均數(shù)代表腐爛區(qū)域的切面面積，切片面積/100 得到腐爛程度（cm2）。對(duì)品種間進(jìn)行抗性分級(jí)，分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)為：腐爛區(qū)域切面面積數(shù)值為0~1 時(shí)馬鈴薯品種抗病類型為高抗（HR）；1~2 時(shí)為抗?。≧）；2~3 時(shí)為中抗（MR）；3~4 時(shí)為中感（MS）；≥4時(shí)為高感（HS）。

1.5 溫室盆栽條件下馬鈴薯品種的抗性測(cè)定

1.5.1 馬鈴薯種植與接種

盆栽測(cè)定試驗(yàn)于2021 年7 月在內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝作物病害病原生物學(xué)及綜合防控實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。每個(gè)品種選擇形態(tài)完好，無明顯傷病的馬鈴薯，從芽眼附近把馬鈴薯切開，每個(gè)馬鈴薯切為3塊，切開的薯塊傷口愈合48 h 后種植在容積4 L、裝有無菌的細(xì)沙與腐殖土等量混勻的盆中，16 h光照/8 h 黑暗條件下培養(yǎng)，濕度在70%左右，溫度控制在25℃。待馬鈴薯植株長(zhǎng)出高約7~8 cm（種植后10 d），將10 μL 106cfu/mL 的菌懸液注射到馬鈴薯植株的莖基部。每個(gè)品種設(shè)定6 盆重復(fù)，以注射等量無菌水的馬鈴薯植株作為對(duì)照組，并采用隨機(jī)區(qū)組方式排列盆栽。

1.5.2 病害調(diào)查及評(píng)價(jià)

接種病原菌后觀察2、4、6、8、10、12、14和21 d 的發(fā)病情況，測(cè)量發(fā)病馬鈴薯莖基部的病斑直徑，并記錄發(fā)病植株數(shù)，發(fā)病株數(shù)與總株數(shù)的比值得到發(fā)病率；隨著病斑直徑的擴(kuò)展，有植株枯死的現(xiàn)象，計(jì)算枯死率，枯死后的植株病斑直徑按照10 cm計(jì)算。

另外參照宋揚(yáng)等[15]的方法，以接種點(diǎn)為中心測(cè)定上下各5 cm 范圍內(nèi)的發(fā)病面積占調(diào)查面積的比率，并對(duì)馬鈴薯進(jìn)行抗性評(píng)價(jià)。調(diào)查范圍內(nèi)無病害發(fā)生時(shí)，其抗病等級(jí)為0；0＜發(fā)病面積≤25%時(shí)抗病等級(jí)為1；25%＜發(fā)病面積≤50%時(shí)抗病等級(jí)為2；50%＜發(fā)病面積≤75%時(shí)抗病等級(jí)為3；75%＜發(fā)病面積≤100%時(shí)抗病等級(jí)為4。

計(jì)算21 d 的抗病等級(jí)平均值，以抗病等級(jí)平均值評(píng)價(jià)抗病性：當(dāng)0≤抗病等級(jí)平均值＜1時(shí)抗病類型為高抗（HR）；當(dāng)1≤抗病等級(jí)平均值＜2 時(shí)為抗病（R）；當(dāng)2≤抗病等級(jí)平均值＜3 時(shí)為中抗（MR）；當(dāng)3≤抗病等級(jí)平均值＜4 時(shí)為中感（MS）；當(dāng)抗病等級(jí)平均值=4時(shí)為高感（HS）。

2 結(jié)果與分析

2.1 離體條件下馬鈴薯塊莖對(duì)P. atrosepticum TDHJ7的抗性評(píng)價(jià)

對(duì)9 個(gè)品種的馬鈴薯塊莖接種病原菌P. atrosepticumTDHJ7 后36 h 的發(fā)病情況進(jìn)行調(diào)查評(píng)價(jià)（圖1）?！甐7’與‘英尼維特’2個(gè)品種的病斑寬度分別為10.06 和19.71 mm，深度分別為10.77和9.37 mm，腐爛程度分別為1.08 和1.85 cm2，評(píng)定為抗性品種；表現(xiàn)為中抗（MR）的品種有‘大西洋’‘夏坡蒂’和‘中加7 號(hào)’，抗性品種占所測(cè)試馬鈴薯品種的55.56%。表現(xiàn)為中感（MS）的馬鈴薯品種有‘冀張薯12 號(hào)’與‘布爾斑克’，‘費(fèi)烏瑞它’和‘中加2 號(hào)’2 個(gè)品種接種后薯塊的病斑寬度為38.61 和37.45 mm，病斑深度為13.23 和13.15 mm，腐爛程度均大于4 cm2，為高感品種（HS）（表1）。

表1 離體塊莖接種法測(cè)定9個(gè)馬鈴薯品種對(duì)P.atrosepticum TDHJ7的抗性評(píng)價(jià)Table 1 Resistance evaluation of nine potato varieties to P.atrosepticum TDHJ7 using tuber inoculation

圖1 離體塊莖法測(cè)定9個(gè)馬鈴薯品種接種P.atrosepticum TDHJ7后的病斑Figure 1 Disease symptoms of nine potato varieties inoculated with P.atrosepticum TDHJ7 using in vitro tuber inoculation method

2.2 溫室盆栽條件下9個(gè)馬鈴薯品種對(duì)P.atrosepticum TDHJ7的抗性評(píng)價(jià)

溫室盆栽條件測(cè)定9 個(gè)馬鈴薯品種接種病原菌P. atrosepticumTDHJ7 后21 d 內(nèi)的發(fā)病情況（圖2~4）。隨著接種天數(shù)的增加，9 個(gè)馬鈴薯品種的病斑直徑與枯死率逐漸升高，并表現(xiàn)出相似的趨勢(shì)。在注射接種6 d 時(shí)‘費(fèi)烏瑞它’的病斑直徑和枯死率顯著增加，病斑直徑達(dá)65.8 mm，枯死率為45.5%，明顯高于其他品種，并在測(cè)定期間均明顯高于其他品種，在21 d 時(shí)的病斑直徑達(dá)到87.82 mm，枯死率為81.82%。‘中加2 號(hào)’馬鈴薯在接種后6 d內(nèi)的病斑直徑和枯死率明顯增加，隨后病斑直徑與枯死率增長(zhǎng)緩慢，在21 d 時(shí)病斑直徑與枯死率均低于‘夏坡蒂’‘中加7 號(hào)’與‘布爾斑克’?！笪餮蟆?2 d 內(nèi)的枯死率一直為0，接種后14 d開始有枯死，21 d的枯死率為5%。

圖2 盆栽注射法測(cè)定9個(gè)馬鈴薯品種對(duì)P.atrosepticum TDHJ7的發(fā)病情況Figure 2 Disease symptoms of nine potted potato varieties inoculated with P.atrosepticum TDHJ7 using injection inoculation method

根據(jù)盆栽注射接種21 d 后的發(fā)病情況對(duì)9 個(gè)馬鈴薯品種的抗病性進(jìn)行評(píng)價(jià)（表2）。在測(cè)試的9個(gè)品種中，‘英尼維特’‘冀張薯12號(hào)’與‘V7’的抗病等級(jí)均小于2，為抗性品種；‘費(fèi)烏瑞它’的抗病等級(jí)為3.64，為中感品種，其他5 個(gè)品種均為中抗品種。

表2 溫室盆栽注射法測(cè)定9個(gè)馬鈴薯品種對(duì)P.atrosepticum TDHJ7的抗性評(píng)價(jià)Table 2 Resistance evaluation of nine potted potato varieties to P.atrosepticum TDHJ7 by injection inoculation method in greenhouse

圖3 溫室盆栽條件下9個(gè)馬鈴薯品種病斑直徑變化Figure 3 Disease diameter of nine potted potato varieties in greenhouse

圖4 溫室盆栽條件下9個(gè)馬鈴薯品種枯死率變化Figure 4 Death ratio of nine potted potato varieties in greenhouse

3 討 論

種植抗病品種可以極大的解決農(nóng)藥等高殘留化學(xué)物質(zhì)的使用，是病害防控中最有效的植保措施之一。通過抗病資源的篩查，可為抗病育種提供基礎(chǔ)的抗性數(shù)據(jù)，為抗性新品種的培育提供優(yōu)良種質(zhì)。病害在發(fā)生過程中受到病原、環(huán)境、寄主之間的相互影響，因此，對(duì)于一個(gè)病害的防控應(yīng)是因地制宜的依據(jù)種植地的情況開展。中國(guó)對(duì)馬鈴薯黑脛病抗性品種的篩選研究較少，僅見宋揚(yáng)等[15]比較了美國(guó)緬因州的24 份馬鈴薯品種的抗黑脛病能力，王立春等[17]對(duì)不同國(guó)家和地區(qū)的40個(gè)品種進(jìn)行篩選，而內(nèi)蒙古自治區(qū)作為中國(guó)馬鈴薯的重要產(chǎn)區(qū)之一，黑脛病發(fā)生逐年加重，但是內(nèi)蒙古自治區(qū)主要馬鈴薯栽培品種對(duì)抗黑脛病能力未見報(bào)道。本研究評(píng)價(jià)的9 個(gè)馬鈴薯品種是目前內(nèi)蒙古自治區(qū)種植較為廣泛的品種，所用病原菌分離自內(nèi)蒙古自治區(qū)馬鈴薯的主栽區(qū)，因此本研究開展的抗性評(píng)價(jià)，對(duì)內(nèi)蒙古自治區(qū)馬鈴薯生產(chǎn)以及黑脛病防控具有指導(dǎo)意義。

馬鈴薯黑脛病菌在馬鈴薯生長(zhǎng)的不同時(shí)期侵染會(huì)引起不同的癥狀和不同程度的危害[13]，如苗期侵染，可以造成植株死亡，甚至導(dǎo)致絕收；生長(zhǎng)中期侵染主要造成減產(chǎn)；生長(zhǎng)后期侵染就會(huì)危害塊莖，導(dǎo)致商品性下降。因此為了全面評(píng)價(jià)9個(gè)馬鈴薯品種對(duì)黑脛病的抗性，采用了離體馬鈴薯塊莖接種、活體馬鈴薯盆栽植株接種兩種方式對(duì)其抗性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，這樣更能全面地評(píng)價(jià)9 個(gè)馬鈴薯品種對(duì)黑脛病的抗性[15]，以確保無論在生產(chǎn)階段的任何時(shí)期侵染均可以將產(chǎn)量損失降低到最低。

本試驗(yàn)通過對(duì)在內(nèi)蒙古自治區(qū)廣泛種植的9個(gè)馬鈴薯品種的黑脛病抗性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，篩選出了在離體條件下對(duì)馬鈴薯黑脛病具有良好抗性的品種有‘英尼維特’‘V7’；在溫室盆栽條件下對(duì)馬鈴薯黑脛病具有良好抗性的品種有‘英尼維特’‘冀張薯 12 號(hào)’‘V7’。綜合評(píng)價(jià)，‘V7’‘英尼維特’這2 個(gè)品種是極有發(fā)展?jié)摿Φ目剐云贩N。隨著內(nèi)蒙古自治區(qū)馬鈴薯種植面積的增加，通過倒茬等農(nóng)藝措施實(shí)現(xiàn)土傳病害的防控已經(jīng)難以實(shí)現(xiàn)，合理的水分管控、抗性品種種植及栽培過程中土壤益生微生物群落的恢復(fù)是下一步研究的重點(diǎn)，以期為馬鈴薯的安全生產(chǎn)提供指導(dǎo)。