韓龍,譚登,萬仕煒,方彭華,黃桂成,閔文

(南京中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院,江蘇 南京 210023)

絕經后骨質疏松癥屬中醫(yī)“骨痿”范疇,最新《絕經后骨質疏松癥(骨痿)中醫(yī)藥診療指南》概括其有3個基本證型,分別是脾腎陽虛證、肝腎陰虛證和腎虛血瘀證,且臨床以肝腎陰虛型最為多見[1]。二至丸作為平補肝腎之陰的經典方劑,應用范圍較廣,臨床療效好[2]。近年來大量研究顯示,二至丸能通過降低絕經后骨質疏松癥骨組織中RANKL/OPG比率,抑制骨質流失,增強骨強度,促進骨重建,改善骨質疏松[3-6]。

骨組織代謝與脂肪組織代謝水平關系密切,脂肪組織分泌脂肪因子如瘦素、脂聯素、趨化素等,調節(jié)骨穩(wěn)態(tài)[7-8]。另外,體脂含量與骨量成負相關,脂肪組織代謝紊亂能通過激活NF-κB/RANKL炎癥信號通路增強破骨細胞活性,加快骨吸收過程,從而引起機體骨量減少[9-10]。

前期研究表明,二至丸能夠改善絕經后骨質疏松骨重建過程,而其對骨重建影響是否與脂肪組織糖代謝有關尚不清楚。因此,本研究探討二至丸對絕經后骨質疏松大鼠脂肪組織糖代謝影響及機制。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級雌性SD大鼠56只,6～8月齡,體質量300～360 g,購自南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖場，動物許可證號:SCXK(蘇)2017-0001。動物飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學動物實驗中心,飼養(yǎng)溫度20～22 ℃,自由進食、飲水。實驗經南京中醫(yī)藥大學倫理委員會批準,批準號:201910A024。

1.2 藥物與制備

取500 g女貞子(四川綿陽市,批號:18121111),將其粉碎成粗粉狀,采用10倍量70%乙醇回流提取2次,每次1 h,合并2次提取液,減壓濃縮回收乙醇,濃縮至500 mL(即生藥1 g·mL-1),-20 ℃儲藏備用。取500 g墨旱蓮(安徽亳州,批號:190301),采用10倍量水回流提取2次,每次1 h,合并2次提取液,減壓濃縮回收水,濃縮至500 mL(即生藥1 g·mL-1),-20 ℃儲藏備用。臨用前取同體積女貞子、墨旱蓮粗提液混合均勻,得二至丸粗提液。阿侖膦酸鈉片(廣東彼迪藥業(yè),批號:20180901),規(guī)格:每片10 mg,溶解濃度:0.2 g·L-1;氟化鈉(羅恩試劑,批號:R015014),規(guī)格:25 g,溶解濃度:1 g·L-1。

1.3 儀器與試劑

小動物雙能X線儀(MEDIX 90，Medlnk),實時定量PCR分析儀(Applied Biosystems 7500，ABI),凝膠成像系統(tǒng)(ImageQuant LAS 4000mini，Cytiva),電子天平(ATY124，島津),Western blot電泳槽(VE-180，天能),多功能酶標儀(Enspire，PerkinElmer),高速冷凍離心機(Centrifuge 5430R，Eppendorf)。

大鼠胰島素ELISA試劑盒(上海酶聯,批號:12/2019),RIPA裂解液(北京康為世紀,批號:CW2333S),BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天,批號:P0010),RNA逆轉錄試劑盒(南京諾唯贊,批號:R223-01),PCR擴增試劑盒(上海翊圣,批號:11202ES08),SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(碧云天,批號:P0012A),PVDF膜(Immobilon-PSQ,批號:R9DA19786),Glut4一抗(Proteintech,批號:66846-1-Ig),PGC-1α一抗(Proteintech,批號:66369-1-Ig),Sirt1一抗(Proteintech,批號:13161-1-AP),α-Tublin一抗(Proteintech,批號:11224-1-AP)。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.4 模型制備及干預方法

56只大鼠適應性飼養(yǎng)1周后,按隨機數字表法將其分為假手術組(n=16)和手術組(n=40)。采用20%烏拉坦按照5 mL·kg-1腹腔注射麻醉大鼠,麻醉完全后,用碘伏擦拭皮膚消毒。于肋弓下2橫指,脊柱旁開1 cm處備毛,之后用手術剪在備毛處切開皮膚,切口長約1.5 cm。切開肌層,用鑷子夾起白色脂肪團,觀察到菜花樣即為卵巢組織。輕輕將卵巢捏起,用眼科鑷分離出卵巢,用細線結扎輸卵管和血管,切除卵巢,對側處理相同,然后小心逐層縫合。將假手術組大鼠切除與卵巢大小相仿的一塊脂肪,其余處理同手術組。造模結束后,各組大鼠均腹腔注射青霉素鈉,每日5萬U,注射3 d。造模8周后,隨機抽取手術組與假手術組各8只大鼠,采用雙能X線檢測其股骨下端及椎體骨密度,以驗證造模是否成功。造模成功后,剩余假手術組8只和手術組32只,將手術組剩余大鼠隨機分為模型組、阿侖膦酸鈉組、氟化鈉組、二至丸組,各組均8只。按5 mL·kg-1生理鹽水予假手術及模型組灌胃,依據成人與大鼠體表面積比等效劑量折算,二至丸組給予1.6 g·kg-1藥物水提液,阿侖膦酸鈉組1 mg·kg-1,氟化鈉組5 mg·kg-1。灌胃8周,每日1次。

1.5 檢測指標和方法

測量各組大鼠體質量,觀察其毛發(fā)、攝食、活動及精神狀態(tài)等。給藥8周后,各組大鼠禁食12 h,采用20%烏拉坦(5 mL·kg-1)腹腔注射,麻醉所有大鼠。麻醉后,暴露大鼠腹主動脈,使用10 mL負壓采血管采血,標記及記錄,室溫靜置1～2 h后,3 500 r·min-1離心15 min,將血清轉移至新離心管中,-80 ℃貯存?zhèn)溆谩Ｈ〕龃笫髢扰K脂肪,稱質量后轉入離心管中;后剝離出大鼠腰椎,剔除周圍肌肉、韌帶等,各組織標記后轉入-80 ℃冰箱凍存。

1.5.1 骨密度檢測 采用雙能X線檢測假手術組與手術組大鼠骨密度(BMD)。

1.5.2 各組大鼠血糖比較 給藥末周,對各組大鼠進行糖耐量試驗(GTT)。GTT:禁食12 h后,用三諾血糖儀量取大鼠空腹血糖(FBG)并記錄;接著腹腔注射50%葡萄糖溶液(2.5 g·kg-1)并記錄時間,隨后分別測得15、30、60、120 min時間點血糖值并記錄。計算糖耐量曲線面積(AUC):AUC=[(FBG+BG30 min)×15/60+(BG30 min+BG60 min)×15/60+(BG60 min+BG120 min)×30/60]。

1.5.3 ELISA法檢測血清胰島素含量 根據ELISA試劑盒說明書進行檢測。

1.5.4 qPCR法檢測脂肪Glut4、PGC-1α和Sirt1 mRNA表達 精確稱取約0.1 g脂肪組織,加入1 mL Trizol裂解液,按照說明書逐步提取RNA。用酶標板檢測所提RNA樣品濃度。RNA純度在1.8～2.1視為所提RNA純度良好,符合實驗要求。取1 μg總RNA,采用兩步法逆轉錄為cDNA,體系為20 μL。實時定量PCR擴增條件:95 ℃ 15 min,95 ℃ 30 s,60 ℃ 35 s,40個循環(huán),以β-actin為內參。擴增結束后,數據以2-ΔΔCt來分析。

1.5.5 Western blot法檢測脂肪Glut4、PGC-1α和Sirt1蛋白表達 用分析天平精確稱取0.1 g脂肪組織,用眼科剪將組織剪碎后,放入預冷的勻漿器中,按0.1 g·mL-1加入蛋白裂解液,后勻漿30次左右,直至大塊組織不見或形成一層薄膜。將所得液體倒入預冷1.5 mL離心管中,劇烈震蕩,冰上靜置5 min。之后按照12 000 r·min-1離心5 min,吸上清即為脂肪蛋白。采用BCA法測定蛋白濃度。依據蛋白濃度計算煮樣濃度,之后在10%分離膠中加入40 μg蛋白樣品。待電泳結束,將對應分子量的蛋白條帶轉移(300 mA,100 min)到PVDF膜上;用脫脂奶粉室溫封閉1 h;之后一抗4 ℃過夜,次日孵育二抗1.5 h。待洗滌干凈后,通過ECL超敏發(fā)光液曝光并且使用Image J軟件定量分析。

2 結果

2.1 大鼠一般狀態(tài)比較

給藥前,與假手術組相比,模型組大鼠毛發(fā)、飲食飲水、活動及精神狀態(tài)均無明顯差異。給藥8周后,與模型組比較,各給藥組大鼠毛發(fā)、飲食飲水、活動及精神狀態(tài)均無明顯異常。

2.2 給藥前后各組大鼠體質量及內臟脂肪質量比較

與假手術組相比,給藥前后模型組大鼠體質量均明顯增加(P<0.05);與模型組相比,各給藥組大鼠體質量均無明顯變化(P>0.05)。與給藥前相比,給藥后各組大鼠體質量均無明顯改變(P>0.05)。給藥結束后,與假手術組相比,模型組大鼠內臟脂肪質量顯著增加(P<0.01);與模型組相比,各給藥組大鼠內臟脂肪質量無明顯變化(P>0.05)。見圖1。

注:Sham.假手術組；Model.模型組；AL.阿侖膦酸鈉組；NAF.氟化鈉組；Erzhiwan.二至丸組。與假手術組相比，#P<0.05,##P<0.01。

2.3 二至丸對大鼠骨密度的影響

與假手術組相比,模型組大鼠骨密度顯著低于假手術組(P<0.01)。與模型組相比，阿侖膦酸鈉組、氟化鈉組與二至丸組骨密度均顯著增加(P<0.01)。見圖2。

2.4 二至丸對大鼠FBG、GTT和AUC指數的影響

與假手術組相比,模型組大鼠FBG、AUC指數顯著增加(P<0.01)。與模型組相比,各給藥組大鼠FBG無明顯變化(P>0.05),而阿侖膦酸鈉組AUC指數明顯減少(P<0.05),氟化鈉組和二至丸組AUC指數顯著減少(P<0.01)。見圖3。

注:Sham.假手術組；Model.模型組；AL.阿侖膦酸鈉組；NAF.氟化鈉組；Erzhiwan.二至丸組。與假手術組相比，##P<0.01;與模型組相比，**P<0.01。圖2 二至丸對大鼠骨密度的影響Fig. 2 Effect of Erzhiwan on bone density in rats

注:Sham.假手術組；Model.模型組;AL.阿侖膦酸鈉組;NAF.氟化鈉組;Erzhiwan.二至丸組。與假手術組相比，##P<0.01;與模型組相比，*P<0.05,**P<0.01。圖3 二至丸對大鼠FBG、GTT和AUC指數的影響Fig. 3 Effects of Erzhiwan on FBG, GTT and AUC in rats

2.5 二至丸對大鼠血清胰島素水平的影響

與假手術組比較,模型組大鼠血清胰島素水平明顯升高(P<0.05)。與模型組比較,氟化鈉組血清胰島素水平顯著降低(P<0.01),二至丸組血清胰島素水平明顯降低(P<0.05)。見圖4。

注:Sham.假手術組；Model.模型組；AL.阿侖膦酸鈉組；NAF.氟化鈉組；Erzhiwan.二至丸組。與假手術組相比，#P<0.05;與模型組相比，*P<0.05,**P<0.01。圖4 二至丸對大鼠血清胰島素水平的影響Fig. 4 Effect of Erzhiwan on serum insulin in rats

2.6 二至丸對大鼠脂肪組織Glut4、PGC-1α、Sirt1 mRNA表達的影響

與假手術組相比,模型組大鼠Glut4、PGC-1α mRNA表達顯著減少(P<0.01),Sirt1 mRNA表達明顯減少(P<0.05);與模型組相比,二至丸組Glut4、PGC-1α、Sirt1 mRNA表達均顯著增加(P<0.01)。見圖5。

注:Sham.假手術組；Model.模型組；AL.阿侖膦酸鈉組；NAF.氟化鈉組；Erzhiwan.二至丸組。與假手術組相比，#P<0.05,##P<0.01;與模型組相比，*P<0.05,**P<0.01。圖5 二至丸對大鼠脂肪Glut4、PGC-1α、Sirt1 mRNA表達的影響Fig. 5 Effects of Erzhiwan on mRNA expression of Glut4, PGC-1α and Sirt1 in rat adipose tissue

2.7 二至丸對大鼠脂肪組織Glut4、PGC-1α、Sirt1蛋白表達的影響

與假手術組相比,模型組大鼠脂肪組織Glut4、Sirt1蛋白水平明顯減少(P<0.05),PGC-1α蛋白水平顯著減少(P<0.01);與模型組相比,二至丸組Glut4、PGC-1α、Sirt1蛋白水平均明顯增加(P<0.05)。見圖6。

注:Sham.假手術組；Model.模型組；AL.阿侖膦酸鈉組；NAF.氟化鈉組；Erzhiwan.二至丸組。與假手術組相比，#P<0.05,##P<0.01;與模型組相比，*P<0.05,**P<0.01。圖6 二至丸對大鼠脂肪組織Glut4、PGC-1α、Sirt1蛋白表達的影響Fig. 6 Effects of Erzhiwan on proteins expression of Glut4, PGC-1α and Sirt1 in rat adipose tissue

3 討論

脂肪組織代謝紊亂與骨質疏松之間的關系緊密。女性在絕經前后體脂率與骨密度呈正相關,腹部脂肪過多,易引起骨量下降[11]。絕經后婦女常出現骨質疏松同時伴有肥胖發(fā)生[12]。二至丸作為平補肝腎的經典方劑,臨床常應用于肝腎不足等證。研究發(fā)現,二至丸對絕經后骨質疏松骨重建過程有明顯改善作用,而其對絕經后骨質疏松干預作用是否與改善機體脂肪糖代謝有關到目前為止尚不清楚。

雌激素能夠抑制脂肪合成代謝過程。相反,雌激素缺乏能導致脂肪的過度積累[13]。另外,雌激素缺乏會導致對破骨細胞的抑制減弱,增加破骨細胞的活性及數目,進而加快骨吸收過程[14]。本研究結果與前期研究一致,切除卵巢后的大鼠體質量明顯增加,骨密度顯著下降[15]。另外,模型大鼠內臟脂肪、血清胰島素、FBG含量均明顯增加,糖耐量水平顯著下降,提示模型大鼠體內存在明顯的胰島素抵抗。本研究表明,二至丸能夠降低絕經后骨質疏松模型大鼠的高血糖、高胰島素,增加糖耐量,提示二至丸具有胰島素增敏效應,降低胰島素抵抗。

Sirt1、PGC-1α和Glut4是反映脂肪組織葡萄糖攝取和能量代謝的主要指標,其中Sirt1能夠激活PGC-1α,促進Glut4表達,導致脂肪細胞葡萄糖攝入增加和線粒體氧化磷酸化水平顯著升高,提高機體能量代謝水平。本研究結果顯示,絕經后骨質疏松模型大鼠脂肪組織的Glut4、PGC-1α以及Sirt1蛋白及基因表達均顯著減少,提示該模型脂肪組織糖代謝顯著下降,引起脂肪組織代謝紊亂,可能影響骨代謝過程。通過二至丸干預后,脂肪組織中Sirt1、PGC-1α、Glut4基因和蛋白水平均顯著增加,骨密度顯著增加,表明二至丸能夠通過上調Sirt1、PGC-1α、Glut4水平,提高大鼠脂肪組織糖代謝水平和骨密度。因此,二至丸改善絕經后骨質疏松骨重建過程可能與激活Sirt1/PGC-1α/Glut4、改善絕經后骨質疏松癥狀態(tài)下脂肪組織糖代謝紊亂有關,進一步詳細機制仍有待探究。