王賀鵬,郁紅禮,2,3,吳皓,2,3,謝雨薇,陶興寶,曾平,程硯秋,王彩霞,劉冰冰,張萍

(1.南京中醫(yī)藥大學藥學院,江蘇 南京 210023;2.江蘇省中藥炮制重點實驗室,江蘇 南京 210023;3.國家教育部中藥炮制規(guī)范化及標準化工程研究中心,江蘇 南京 210023;4.中國食品藥品檢定研究院,北京 100050)

天南星為天南星科植物天南星Arisaemaerubescens(Wall.) Schott、異葉天南星ArisaemaheterophyllumBl.或東北天南星ArisaemaamurenseMaxim的干燥塊莖。天南星生品有毒,具有強烈的刺激性毒性,誤服會導致劇烈的唇舌刺痛感、流涎、口舌腫脹、咽喉疼痛等[1],因此臨床多用炮制品。

《中國藥典》2020年版天南星質(zhì)量標準缺少毒性控制指標。課題組前期研究發(fā)現(xiàn),天南星中含有的具有特殊結(jié)構(gòu)的針晶復合物是其主要的刺激性毒性成分,該針晶復合物是由草酸鈣針晶及凝集素蛋白共同構(gòu)成[2-5]。針對目前天南星毒性成分控制研究的不足,結(jié)合本課題組前期的研究成果,本研究采用HPLC法對35批不同產(chǎn)地、不同批次天南星樣品炮制前后針晶含量進行分析測定,采用Western blot法對32批天南星炮制前后凝集素蛋白進行檢測,并建立相應限度標準,以期為天南星毒性控制指標的建立提供參考。

1 材料

Waters 2695型高效液相色譜儀(美國Waters公司),包括Waters 2489 UV檢測器及Waters Empower Pro色譜工作站。高速離心機(美國Thermo公司)；BP211D電子天平(德國Sartorius公司)。HWS-26電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科學儀器有限公司)。Milli-Q純水儀(美國Millipore公司)。凝膠成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司);高速冷凍離心機(美國Thermo公司)。

草酸基準試劑(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，貨號：O111918)、磷酸(AR,上海麥克林生化科技有限公司，貨號：P816337)、鹽酸(AR,上海凌峰化學試劑有限公司,貨號：20200715);SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(碧云天生物科技有限公司,貨號：P0015L);過硫酸銨(上海阿拉丁生化科技股份有限公司,貨號：A112450);30%丙烯酰胺(北京索萊寶科技有限公司,貨號：A1010);Tris-HCl(南京翼飛雪生物科技有限公司,貨號：YT0065,YT1010);TEMED(美國Sigma公司,貨號：#STBF7873V);標準蛋白Marker(美國Thermo公司,貨號：#26616);PVDF膜(美國Sigma公司,貨號：IPVH00010);ECL化學發(fā)光液(美國Millipore公司,貨號：WBKLS0500);兔源天南星凝集素抗體(金斯瑞生物科技有限公司制備);山羊抗兔IgG二抗(H+L)(南京翼飛雪生物科技有限公司,貨號：YFSA02);天南星凝集素蛋白(AEL,實驗室自制,電泳純)。

生品天南星分別購于安徽鑫泰藥業(yè)有限公司、保和堂(亳州)制藥有限公司、四川新荷花中藥飲片股份有限公司等企業(yè),經(jīng)南京中醫(yī)藥大學劉訓紅教授鑒定為天南星科植物天南星的干燥塊莖,各項檢查均符合《中國藥典》2020年版規(guī)定。制天南星均為上述生品按照《中國藥典》2020年版炮制方法在實驗室自制。樣品信息見表1。

表1 天南星樣品信息Table 1 Information of Arisaematis Rhizoma samples

2 方法與結(jié)果

2.1 制天南星的制備

按照《中國藥典》2020年版規(guī)定[6],取凈天南星,按大小分別用水浸泡,每日換水2～3次,如起白沫時,換水后加白礬(每100 kg天南星,加白礬2 kg),泡1 d后,再進行換水,至切開口嘗微有麻舌感時取出。將生姜片、白礬粉置鍋內(nèi)加適量水煮沸后,倒入天南星共煮至無干心時取出,除去姜片,晾至四至六成干,切薄片,干燥。每100 kg天南星,用生姜、白礬各12.5 kg。

2.2 草酸鈣含量測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱為Megres C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相為0.5%H3PO4水溶液,柱溫25 ℃,流速0.8 mL·min-1,檢測波長220 nm,進樣量10 μL。色譜圖見圖1。

注：A.草酸對照品;B.天南星;C.制天南星圖1 對照品及天南星生制品HPLC圖Fig.1 HPLC of reference substance and raw Arisaematis Rhizoma

2.2.2 供試品溶液的制備 取生天南星和制天南星飲片粉末(過4號篩)約0.5 g,精密稱定,置10 mL離心管中,加入5 mL純水搖勻,置60 ℃水浴20 min,離心,棄上清,重復上述操作1次。殘渣加鹽酸(體積比1∶1)溶液1 mL,加純水5 mL,置70 ℃水浴30 min,離心取上清液,定容至10 mL,即得。

2.2.3 對照品溶液的配制 取草酸對照品適量,精密稱定,置10 mL容量瓶中,加水定容至刻度,制得1 mL含2 mg的對照品溶液。

2.2.4 線性關系考察 將“2.2.3”項下草酸對照品溶液逐級稀釋,制得濃度為0.1、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mg·mL-1的對照品溶液,按“2.2.1”項下色譜條件進行測定。以峰面積為縱坐標(Y),對照品含量為橫坐標(X),繪制標準曲線并進行線性回歸,回歸方程Y=2 799 996.27X-191 224.79,相關系數(shù)0.999 5,表明草酸在0.1～2.0 mg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關系。

2.2.5 精密度試驗 精密吸取對照品溶液,連續(xù)進樣6次,每次進樣10 μL,測定峰面積,RSD為0.38%,表明儀器精密度良好。

2.2.6 重復性試驗 取同一批樣品粉末,按照“2.2.2”項下方法平行制備6份供試品溶液,所得供試品溶液分別進樣10 μL,測定峰面積,RSD為0.65%,表明該方法重復性較好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗 取同一份供試品溶液,分別于0、2、6、12、24、48、72 h進樣10 μL,測定峰面積,RSD為2.33%,表明供試品溶液在72 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.8 加樣回收試驗 精密稱取已測定含量的樣品粉末6份，各約0.25 g,按照2.3項下方法制備供試品溶液,在加入1 mL鹽酸時,分別加入適量草酸對照品。取供試品溶液10 μL進樣,測定峰面積,計算加樣回收率。見表2。

表2 加樣回收率測定(n=6)Table 2 Results of recovery test(n=6)

2.2.9 樣品含量測定 取各批次炮制前后的天南星樣品按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液,進樣量10 μL,測定草酸峰面積,計算草酸含量并轉(zhuǎn)換為草酸鈣的含量,各批次生天南星中草酸鈣最高含量為2.33%,最低含量為0.78%,平均含量為1.43%;各批次制天南星中草酸鈣最高含量為0.98%,最低含量0.29%,平均含量0.60%;草酸鈣含量的降幅為25.6%～78.3%,表明炮制后天南星中毒性物質(zhì)草酸鈣的含量顯著下降。見表3。

表3 天南星中草酸鈣含量(n=2)Table 3 Content of calcium oxalate in Arisaematis Rhizoma (n=2)

2.3 凝集素蛋白檢測

2.3.1 對照品溶液制備 取天南星凝集素(AEL),加水配制成初始濃度20 μg·mL-1,并逐級稀釋,得到濃度分別為13.33、8.89、5.93、3.95 μg·mL-1的樣品,分別加入凝膠電泳上樣緩沖液,于100 ℃水浴10 min,即得系列濃度的天南星凝集素蛋白對照品溶液。

2.3.2 供試品溶液制備 取生天南星和制天南星粉末(過4號篩)1 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加水100 mL,稱定質(zhì)量,振搖2 h,再稱定質(zhì)量,用水補足減失的質(zhì)量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液與凝膠電泳上樣緩沖液按4∶1體積比混勻,置水浴中加熱5 min,冷卻至室溫,得到供試品溶液。

2.3.3 Western blot法測定 取上述對照品溶液及供試品溶液均上樣5 μL,分離膠的濃度為15%,濃縮膠的濃度為5%，進行電泳(100 V,2 h)。電泳完成后采用濕轉(zhuǎn)法將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上(恒壓100 V,45 min),置5%BSA溶液中封閉2 h,TBST溶液洗滌膜5次,每次10 min,加入兔源天南星凝集素的抗血清(稀釋倍數(shù)1∶1 000),于4 ℃孵育過夜?；厥湛寡?將膜用TBST溶液洗滌5次,每次10 min,加山羊抗兔抗體,室溫孵育2 h。回收抗體,膜用TBST溶液洗滌5次。化學發(fā)光液按比例配制,吸取適量覆蓋膜表面約1 min,凝膠成像系統(tǒng)拍攝。圖2結(jié)果表明,經(jīng)過炮制,天南星均檢測不到凝集素蛋白條帶。

2.3.4 Western blot法測定結(jié)果 對32批天南星炮制前后凝集素蛋白進行檢測,結(jié)果表明生天南星經(jīng)過炮制,未檢測到相應條帶。以44.5 ng天南星凝集素蛋白灰度值為參照,計算其它各樣品相對含量。具體結(jié)果見圖2。

注:與生品相比,圖2 天南星凝集素蛋白檢測結(jié)果Fig.2 Lectin protein detection in Arisaematis Rhizoma

3 討論

課題組前期大量研究結(jié)果表明,天南星的刺激性毒性是由其所含特殊晶型的針晶復合物引起,且該針晶復合物是由草酸鈣針晶及凝集素蛋白共同構(gòu)成。本研究對天南星炮制前后草酸鈣針晶及凝集素蛋白進行測定。結(jié)果表明,經(jīng)過炮制的天南星中草酸鈣針晶含量顯著降低,凝集素蛋白未檢測到條帶。課題組前期研究成果表明，炮制過程中白礬及加熱等因素可使凝集素蛋白變性和降解,使草酸鈣針晶分解破壞,從而使凝集素蛋白及草酸鈣針晶含量降低[7-9],本研究進一步證明了毒性成分草酸鈣針晶及凝集素蛋白含量的降低是天南星炮制解毒的機制之一。本文針晶的檢測方法是以不溶性草酸鈣含量作為指標。

HPLC結(jié)果顯示,生天南星草酸鈣含量最高為2.33%,最低為0.78%,平均含量為1.43%,說明不同產(chǎn)地不同批次天南星草酸鈣含量存在較大差異。制天南星草酸鈣含量最高為0.98%,最低為0.29%,平均含量為0.60%。炮制后草酸鈣含量最高降幅78.3%,最低降幅25.6%,平均降幅為55.4%。結(jié)果可見,即使炮制降低了草酸鈣的含量,但由于某些批次生品中本身草酸鈣含量高,炮制后仍然有較高含量,這與炮制后粉末中仍然可見草酸鈣針晶但針晶結(jié)構(gòu)發(fā)生溶蝕的結(jié)果一致[10]。不同批次炮制后草酸鈣含量降幅差異較大,也是由不同批次生品天南星的草酸鈣含量差異大導致,如生品草酸鈣含量相對較高者一般炮制后降幅較高;此外,《中國藥典》中關于炮制工藝的控制僅有“口嘗微有麻舌感”“內(nèi)無干心”等主觀經(jīng)驗性評價,加之大小個頭不均導致各批次間炮制程度略有差異也有關系。但從結(jié)果可見,炮制后草酸鈣含量顯著降低。Western blot結(jié)果表明,生天南星經(jīng)過炮制均未檢測到凝集素蛋白條帶。提示生天南星經(jīng)過炮制后,內(nèi)源性毒性成分草酸鈣針晶和凝集素蛋白含量均顯著降低。

本研究通過多批次天南星樣品炮制前后毒性物質(zhì)含量變化測定,總結(jié)了內(nèi)源性毒性物質(zhì)含量變化規(guī)律。建立的天南星草酸鈣含量測定方法及凝集素蛋白檢測方法簡便可行,可用于天南星毒性控制。以草酸鈣的含量作為毒性控制指標,適用于原料來源穩(wěn)定(產(chǎn)地、生長年限穩(wěn)定)樣品的質(zhì)量控制。綜合本文研究結(jié)果,以凝集素蛋白限度作為天南星毒性控制指標更為穩(wěn)定可靠,建議制天南星不得檢出凝集素蛋白。本文的研究也為后續(xù)ELISA試劑盒的開發(fā)提供依據(jù)。