溫 靖 李 丹 郭 婷 武春霞 周雅坪 田廣原 羅玉霞 郝永清*

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院/農(nóng)業(yè)部動物疾病臨床診療技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特 010010；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)生態(tài)與農(nóng)業(yè)氣象中心，呼和浩特 010052；3.阿拉善左旗農(nóng)牧區(qū)生態(tài)管理綜合行政執(zhí)法局，內(nèi)蒙古 巴彥浩特 75300)

牛支原體(Mycoplasmabovis)從1960年被發(fā)現(xiàn)至今逐漸成為對中國乃至世界養(yǎng)牛業(yè)造成巨大損失的動物性病原體。雖然目前仍沒有被列入重大疫病的名單，但是已經(jīng)引起越來越多的重視。許多報(bào)道已經(jīng)證明牛支原體病呈現(xiàn)世界性分布。由于抗生素的廣泛使用，肺炎球菌、金黃色葡萄球菌等病原體得到了很大程度的控制。M.bovis對抗生素不敏感，臨床診療過程中發(fā)現(xiàn)，M.bovis逐步成為引起犢牛肺炎的重要病原體。除此之外，M.bovis也可引起關(guān)節(jié)炎、乳腺炎、結(jié)膜炎和中耳炎[1]。據(jù)估測每年1/4到1/3的呼吸系統(tǒng)相關(guān)疾病可能與M.bovis感染有關(guān)[1]。

2008年，中國首次從犢牛肺臟中分離到M.bovis[2]。雖然已有一些關(guān)于M.bovis流行和爆發(fā)的報(bào)道，但國內(nèi)尚無長期持續(xù)性、大規(guī)模監(jiān)測M.bovis流行情況的研究。目前，關(guān)于M.bovis流行情況的相關(guān)研究多采用肺臟分離細(xì)菌或血清學(xué)方法進(jìn)行檢測[3-6]。雖然從病死犢牛肺臟中分離M.bovis，能夠明確診斷M.bovis的感染情況，但從犢牛肺臟中分離M.bovis需要對犢牛進(jìn)行剖檢，難以在養(yǎng)殖場中大規(guī)模開展。另外由于采樣個(gè)數(shù)較少，無法對M.bovis在整體牛群中流行情況進(jìn)行精確評估。血清學(xué)方法相對前者雖然較為簡便，但是由于M.bovis存在表面抗原變異，由急性感染轉(zhuǎn)為慢性感染后血液中抗體水平下降，難以檢測，易出現(xiàn)漏診[7-8]。上述兩種方法，均不能對無癥狀犢?；驍y帶M.bovis的牛群散毒情況進(jìn)行整體評價(jià)。因此，尋找一簡單易行的評估方法是很有必要的。

犢牛支原體肺炎的發(fā)病高峰在1～4月齡[1-2，10]，這個(gè)階段犢牛的免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育完全，M.bovis在鼻腔內(nèi)定植可下行引發(fā)牛支原體肺炎。處于感染急性期和恢復(fù)期的病牛是M.bovis重要的傳染源，M.bovis在犢牛呼吸系統(tǒng)定植后的2～6 d后開始通過上呼吸道和鼻腔排出M.bovis。感染M.bovis的病牛淚液、鼻腔分泌物、陰道分泌物、乳汁和精液均有可能攜帶M.bovis[10-15]。鼻腔是M.bovis定植的最主要的場所，鼻腔分泌物是最重要的M.bovis傳播介質(zhì)[5,8，10]。關(guān)于M.bovis在上呼吸道定植和排出的相關(guān)研究較少[16]。雖然M.bovis的定植并不直接導(dǎo)致動物發(fā)病，但在免疫力下降，通風(fēng)換氣不良，其他呼吸道病原微生物入侵等條件下，定植在鼻腔中的M.bovis可下行至肺臟，引發(fā)犢牛肺炎[11-12]。因此，通過鼻腔檢測并評估M.bovis傳播風(fēng)險(xiǎn)是可行的，為預(yù)防包括牛支原體肺炎、牛支原體乳房炎和牛支原關(guān)節(jié)炎的爆發(fā)吹響警報(bào)[3,5,17-18]，該方法也更容易被養(yǎng)殖戶接受。因此，本研究針對中國六大區(qū)域的奶牛場的0～80日齡無癥狀犢牛通過采集鼻腔拭子進(jìn)行了M.bovis流行情況調(diào)查，并分析M.bovis陽性率的時(shí)空分布規(guī)律，M.bovis陽性率與犢牛日齡的相關(guān)性，對中國奶牛養(yǎng)殖地區(qū)預(yù)防和控制牛支原體相關(guān)疾病的發(fā)生具有指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 樣本采集與來源

2013—2019年，全國6個(gè)區(qū)域，西南區(qū)以重慶市、四川省、云南省為代表；華南區(qū)以廣東省為代表；華東區(qū)以江蘇省、安徽省、山東省為代表；華中區(qū)以河北省和山西省為代表；華北區(qū)以內(nèi)蒙古自治區(qū)為代表；西北區(qū)以甘肅省、新疆維吾爾族自治區(qū)為代表。隨機(jī)對這些區(qū)域內(nèi)存欄奶牛數(shù)在5 000頭以上的集約化養(yǎng)殖牧場的0～80日齡無癥狀犢牛進(jìn)行鼻拭子采樣。2013—2019年，上述地區(qū)不同牧場每年連續(xù)收集3個(gè)月的鼻拭子樣品，每個(gè)月采樣15份，3個(gè)月共收集45份。最終收集鼻拭子樣品1 878份。

1.2 主要試劑

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：PPLO肉湯粉21 g，0.4%酚紅2.5 mL，25%酵母浸液10 mL，充分溶解定容至800 mL，用1 mol/L NaOH調(diào)pH至7.6～7.8，121 ℃ 滅菌15 min，4 ℃可保存2周。

完全培養(yǎng)基：基礎(chǔ)培養(yǎng)基使用時(shí)加入200 mL的滅活馬血清、終濃度為100 U/mL的青霉素以及終質(zhì)量濃度為1 g/L的丙酮酸鈉。配制固體培養(yǎng)基時(shí)，高壓前再加入10 g瓊脂粉，滅菌后溫度降至50 ℃時(shí)再加入后續(xù)的添加劑。

1.3 鼻拭子樣品的收集

采用一次性無菌棉簽深入鼻腔10 cm深度進(jìn)行采樣，采集的樣品置-20 ℃冰箱凍存，集中全程冷鏈運(yùn)輸，在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行細(xì)菌分離和PCR鑒定。

1.4 牛支原體的分離培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行牛支原體分離培養(yǎng)方法參照文獻(xiàn)[10]，將拭子在支原體液體完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h，然后均勻涂布支原體完全培養(yǎng)基平板。所有的培養(yǎng)物均在37 ℃的5% CO2條件下培養(yǎng)。如果連續(xù)培養(yǎng)10 d沒有觀察到典型的牛支原體菌落生長，則為陰性。觀察到典型油煎蛋樣牛支原體菌落，挑單菌落接種到液體培養(yǎng)基中增菌培養(yǎng)。

1.5 M.bovis的PCR鑒定

培養(yǎng)結(jié)束后離心收集菌體沉淀，用牛支原體DNA提取試劑盒(購于BIOMIGA公司)提取基因組進(jìn)行PCR鑒定，使用美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)M.bovis標(biāo)準(zhǔn)菌株P(guān)G45(保藏號25523)作為陽性對照。無菌水作為陰性對照。引物設(shè)計(jì)參照Pinnow等[19]M.bovis基因序列特異性引物(PpSM5-1，5’-CCAGCTCACCCTTATACATGA-GCGC-3’；PpSM5-2，5’-TGACTCACCAATTA-GACCGACTATTTCAC-3’)。

PCR反應(yīng)總體系為25 μL：模板3 μL、2×Taq Master Mix 12.5 μL、對應(yīng)上下游引物各0.5 μL、ddH2O 8.5 μL。經(jīng)優(yōu)化后PCR擴(kuò)增條件為95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，退火1 min；72 ℃延伸1 min，共32個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃條件下保存，電泳觀察結(jié)果。

1.6 數(shù)據(jù)分析

對不同地區(qū)犢牛M.bovis陽性率的分析采用多重t檢驗(yàn)。對不同年份，犢牛M.bovis陽性率的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用One-way ANOVA。對于不同季節(jié)，M.bovis陽性的分析采用非配對t檢驗(yàn)。判斷相同年份不同季節(jié)，同一地點(diǎn)不同季節(jié)，M.bovis的陽性率的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用Two-way ANOVA。采用Two-tailed分析判斷犢牛M.bovis陽性率與日齡相關(guān)性。當(dāng)P<0.05時(shí)，表示顯著性差異，當(dāng)P>0.05時(shí)，表示無顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 部分樣品的M.bovis PCR檢測

用M.bovis特異性引物PCR 檢測犢牛鼻拭子DNA，結(jié)果所示612份鼻拭子樣品均擴(kuò)增出約442 bp大小的片段，與預(yù)期擴(kuò)增片段相符(圖1)。不同來源犢牛鼻拭子M.bovisPCR 檢測結(jié)果見表2，陽性檢出率為9.8%～54.1%。從上述的612份陽性病料中共分離得到83株易于在實(shí)驗(yàn)室長期培養(yǎng)的牛支原體。

M，DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL2 000；1～19，鼻拭子樣品1～19；20，M.bovis標(biāo)準(zhǔn)菌株P(guān)G45；21，空白對照。M， DL2 000 DNA Marker; 1-19, Nasal samples 1-19; 20, M.bovis standard strain PG45; 21, Blank control.圖1 犢牛部分鼻拭子樣品中牛支原體PCR檢測Fig.1 PCR detection of of Mycoplasma bovis in nasal swab samples of calves

2.2 2013—2019年全國奶牛養(yǎng)殖六大地區(qū)犢牛M.bovis陽性率及其時(shí)空分布規(guī)律

全國奶牛養(yǎng)殖六大地區(qū)犢牛M.bovis陽性率檢測結(jié)果見表2。2013—2019年，M.bovis陽性率平均值由高到低分別是西北區(qū)(38.7%)、華東區(qū)(35.6%)、華北區(qū)(33.6%)、華中區(qū)(30.8%)、華南區(qū)(29.9%)和西南區(qū)(27.1%)(圖2 (a))。中國奶牛養(yǎng)殖地區(qū)M.bovis陽性率在30%～40%波動。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，六大奶牛養(yǎng)殖地區(qū)M.bovis陽性率不具有顯著性差異(P>0.05)。

(a)M.bovis陽性率的空間分布；(b)M.bovis陽性率的時(shí)間分布；(c)M.bovis陽性率的季節(jié)性分布；(d)季節(jié)和年份雙因素對M.bovis陽性率的影響；(e)地區(qū)和季節(jié)雙因素對M.bovis陽性率的影響。(a) Spatial distribution of M.bovis positive rate; (b)Time distribution of M.bovis positive rate; (c) Distribution of M.bovis positive rate in different seasons; (d) Effects of seasons and years on the positive rate of M.bovis; (e) Effects of regions and seasons on the positive rate of M.bovis.圖2 2013—2019年中國六大奶牛養(yǎng)殖地區(qū)M.bovis陽性率時(shí)空分布Fig.2 Time and space distribution of positive rate of M.bovis in six major dairy farm areas from 2013 to 2019 in China

全國奶牛養(yǎng)殖地區(qū)犢牛M.bovis陽性率2013—2019年陽性率平均值為32.6%(圖2 (b))。2013—2015年，M.bovis陽性率維持在40%以上，2013—2015年M.bovis陽性率平均值由高到低分別為2014年(48.6%)、2015年(48.1%)、2013年(47.0%)。2013—2015年M.bovis陽性率平均值為47.9%，三年間M.bovis陽性率無顯著性差異。2016—2019年M.bovis陽性率下降，在20%～30%波動，由高到低分別為2019年(26.5%)、2017年(20.9%)、2016年(20.4%)、2018(16.7%)。2016—2019年M.bovis陽性率平均值為21.1%，四年間M.bovis陽性率無顯著性差異。2013—2015年M.bovis陽性率顯著高于2016—2019年(P<0.05)。表明M.bovis陽性率波動可能存在一定的周期性，需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

通過研究不同季節(jié)M.bovis流行情況發(fā)現(xiàn)，冬春季節(jié)(10～次年3月)M.bovis陽性率(33.9%)平均值略高于夏秋季節(jié)(4～9月)(31.3%)，但差異不顯著(P>0.05)(圖2(c))。針對季節(jié)和年份因素對M.bovis陽性率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，2019年冬春季節(jié)(34.6%)和夏秋季節(jié)M.bovis陽性率(22.5%)存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，其余年份不同季節(jié)M.bovis陽性率不存在顯著性差異(圖2(d))。除華南地區(qū)冬春季節(jié)與夏秋季節(jié)，M.bovis陽性率存在顯著性差異外(P<0.05)，參與調(diào)查的華東、華北、西北、西南和華中地區(qū)，冬春季節(jié)和夏秋季節(jié)均不存在顯著性差異(P>0.05)(圖2(e))。

2.3 不同日齡犢牛與犢牛群中M.bovis陽性率的相關(guān)性分析

按照日齡對犢牛進(jìn)行分組，分為0～20、20～40、40～60和60～80日齡組。對M.bovis流行情況進(jìn)行研究，Two-tailed法分析發(fā)現(xiàn)M.bovis陽性率與犢牛日齡具有顯著性關(guān)聯(lián)(P<0.01)。其中0～20日齡組，M.bovis陽性率為7.4%。20～40日齡組，M.bovis陽性率為25.4%。40～60日齡組，M.bovis陽性率43.2%。60～80日齡組，M.bovis陽性率為54.5%(表3)。犢牛鼻腔中M.bovis陽性率與日齡呈線性正相關(guān)(Y=0.795 5X-7.175，R2=0.99)。表明隨著犢牛日齡的增加，犢牛生活范圍的擴(kuò)大，接觸、定植和感染牛支原體的風(fēng)險(xiǎn)增加。

表3 不同日齡組犢牛M.bovis陽性率分析Table 3 Analysis of positive rate of M.bovis in calves of different age groups

3 討 論

病原學(xué)和血清學(xué)方法均已證明M.bovis目前在世界上和中國范圍均廣泛流行。Brice等[20]在早期研究中發(fā)現(xiàn)荷蘭等國家的育肥牛場中M.bovis流行率高達(dá)20%以上，而僅有極少一部分牛是完全健康的。英國被檢測的養(yǎng)殖場中，50%的場區(qū)有感染M.bovis的情況，被感染的牛群表現(xiàn)出生長性能下降等特點(diǎn)[20]。歐洲每年約有25%～33%的犢牛肺炎是由M.bovis引起的[20-21]。美國每年單個(gè)牛場M.bovis流行率甚至高達(dá)70%，M.bovis引起的牛呼吸道疾病和乳腺炎對美國造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[22]。日本流行率相對較低，只有平均4.8%的牧場發(fā)現(xiàn)存在M.bovis感染[23]。比利時(shí)的流行率也相對較低，檢測的200個(gè)牧場中只有3個(gè)牧場發(fā)現(xiàn)M.bovis感染[24]。李巖等[25]在2013年對新疆地區(qū)15個(gè)規(guī)?；膛鲋信Ｖгw的感染情況調(diào)查發(fā)現(xiàn)437份血清中牛支原體抗體陽性率為40.0%；44份肺臟、關(guān)節(jié)液、鼻腔黏液樣本中牛支原體陽性率為40.9%。謝建華等[26]從2008年到2013年持續(xù)對重慶地區(qū)牛支原體感染情況檢測發(fā)現(xiàn)，血清中抗體陽性率在40.3%～75.0%。其中奶牛養(yǎng)殖場(61.8%)高于規(guī)?；馀?51.3%)高于散養(yǎng)戶(44.7%)。郭澍強(qiáng)等[27]對銀川地區(qū)12個(gè)規(guī)模化牛場的230份奶牛血清進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)牛群平均陽性率為26.5%，牛場陽性率為100%。上述的研究結(jié)果表明牛支原體在中國規(guī)?；鲋械牧餍惺制毡?。

M.bovis可以引起乳房炎、肺炎和關(guān)節(jié)炎等疾病。目前，對M.bovis引起犢牛肺炎的調(diào)查多集中在某一牧場爆發(fā)犢牛肺炎后，通過對死亡病牛進(jìn)行剖檢，分離造成犢牛肺炎的病原或通過收集血清后利用免疫學(xué)方法檢測抗牛支原體抗體，得到關(guān)于M.bovis在牧場中流行情況的數(shù)據(jù)。對比前兩種方法，在牛鼻腔拭子或犢牛鼻液中分離、鑒定M.bovis，簡便易行，可操作性強(qiáng)，易于被養(yǎng)殖戶接受，可以在牧場中大面積推廣。

本研究表明，2013—2019年M.bovis在中國集約化牧場長期流行。2013—2015年M.bovis陽性率無顯著性差異，平均值顯著高于2016—2019年M.bovis陽性率，提示M.bovis的傳播和流行可能存在一定的周期性。2016—2019年M.bovis陽性率相對較低，可能與2013—2015年M.bovis流行期間，大量病畜淘汰和死亡，其余家畜均獲得免疫有關(guān)。我國M.bovis感染情況高于日本和比利時(shí)等國，感染水平接近歐洲和美國。由于2020年新冠肺炎疫情影響，人員的流動和生物制品的運(yùn)輸受到影響，本實(shí)驗(yàn)室未收集到2020年牧場的送檢樣品。M.bovis在中國集約化牧場流行情況的長期監(jiān)測受到了中斷。摸清M.bovis傳播和流行的周期性特點(diǎn)需要長期的、持續(xù)的進(jìn)行M.bovis流行情況監(jiān)測。本實(shí)驗(yàn)室會繼續(xù)監(jiān)測中國奶牛養(yǎng)殖地區(qū)M.bovis流行情況，為M.bovis的傳播和流行的規(guī)律性研究提供數(shù)據(jù)支持。

從空間上，六大奶牛養(yǎng)殖地區(qū)M.bovis陽性率無顯著性差別。雖然不同季節(jié)，M.bovis陽性率差異不顯著，冬春季節(jié)M.bovis平均陽性率略高于夏秋季節(jié)。推斷可能與低溫有利于M.bovis在奶牛養(yǎng)殖場飼養(yǎng)環(huán)境中存活有關(guān)[28]。目前尚無媒介昆蟲機(jī)械性攜帶M.bovis有利于其傳播的報(bào)道。統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果也證實(shí)除華南地區(qū)以外，同一地區(qū)不同季節(jié)，M.bovis平均陽性率差異不顯著。研究試圖分析牧場中M.bovis陽性率與當(dāng)?shù)販囟群蜐穸鹊年P(guān)系，尚未發(fā)現(xiàn)任何統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的結(jié)果。由于參與流行病學(xué)調(diào)查的牧場多為半開放圈舍，犢牛舍中的溫度、濕度常年波動范圍變化不大。故未將溫度、濕度分析結(jié)果列出。

M.bovis為條件致病菌，長期定植于犢牛的上呼吸道中。M.bovis在牛群中陽性率隨著日齡的增長而升高，在7～10 d中，M.bovis陽性率為1%以下，到80日齡時(shí)，M.bovis陽性率為60%～80%，總體陽性率32.6%。隨著日齡的增長，犢牛的活動范圍變大，接觸M.bovis污染的水、飼料、器具和其他患病動物的機(jī)會增加，可能是陽性率增加的主要原因，且該結(jié)果與Soehnlen等[18]研究結(jié)果相同。

4 結(jié) 論

從2013—2019年，我國六大奶牛養(yǎng)殖地區(qū)犢牛鼻腔中M.bovis陽性率為9.8%～54.1%。不同地區(qū)，陽性率不同，但不具有顯著性差異。其中2013—2015年M.bovis流行情況較為嚴(yán)重，陽性率顯著高于2016—2019年。另外，不同季節(jié)M.bovis陽性率差異不顯著，且M.bovis陽性率與犢牛日齡呈正相關(guān)。