白藜蘆醇對銀屑病細胞生長的影響及其作用機制的探討*

2022-05-20 12:16:30韓烏日罕郭果香麗麗閆靜茹張婷郝玉琴

中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志 2022年9期

韓烏日罕，郭果香，麗麗，閆靜茹，張婷，郝玉琴

（1.包頭市第四醫(yī)院皮膚科，內(nèi)蒙古包頭 014000；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院皮膚科，內(nèi)蒙古包頭 014000；3.北京大學(xué)第三醫(yī)院皮膚科，北京 100191）

銀屑病是被世界衛(wèi)生組織確定為主要的全球健康問題的少數(shù)非傳染性疾病之一[1]，是一種常見的免疫介導(dǎo)的以角質(zhì)形成細胞過度增殖和異常分化及炎癥細胞浸潤為主要特征的慢性炎癥性皮膚病，全球發(fā)病率為2%～3%[2-3]。其典型臨床表現(xiàn)為鱗屑性紅斑或斑塊，主要累及肘部、膝蓋及頭皮，亦可廣泛分布[1]。銀屑病病因復(fù)雜，機制不明，并且病程遷延不愈，容易反復(fù)，治療困難，常罹患終身[4]。隨著對銀屑病的深入研究，發(fā)現(xiàn)絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）信號通路在銀屑病角質(zhì)形成細胞的增殖過程和炎癥反應(yīng)中均發(fā)揮一定的作用[5-7]。

白藜蘆醇是一種多酚類化合物，存在于多種植物中，具有抗癌、抗菌、抗炎、抗氧化等多種生物學(xué)活性[8-10]。其中抗炎和抗腫瘤作用可通過調(diào)控P38/MAPK 通路或細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular regulated protein kinases, ERK）/MAPK 通路發(fā)揮作用[11-12]。有研究[13-14]發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可以降低銀屑病皮損的炎癥程度，還可導(dǎo)致人永生化角質(zhì)形成細胞（HaCaT）的凋亡。雖然白藜蘆醇可通過調(diào)控MAPK通路抑制細胞異常增殖和炎癥反應(yīng)，并且對銀屑病也有抑制作用，但白藜蘆醇是否可通過調(diào)控MAPK通路起到抗銀屑病的作用尚未見相關(guān)報道。

很多研究[15-17]都采用HaCaT 細胞株作為銀屑病的研究模型。本研究采用角質(zhì)細胞生長因子（keratinocyte growth factor, KGF）刺激HaCaT 細胞過度增殖，模擬銀屑病角質(zhì)形成細胞的過度增殖狀態(tài)，復(fù)制銀屑病細胞模型，分別觀察不同濃度的白藜蘆醇對HaCaT 細胞株增殖及凋亡的影響，檢測Caspase-3、p-ERK1/2、p-P38 蛋白表達，探討白藜蘆醇對銀屑病細胞生長的影響及其作用機制，為白藜蘆醇臨床治療銀屑病提供理論和實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑與儀器

HaCaT 細胞株（湖南豐暉生物科技有限公司）。KGF（MCE 中國公司），白藜蘆醇、順式視黃酸（維A 酸）、二甲基亞砜DMSO（美國Sigma 公司），DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]，胰酶、抗生素（美國GenView 公司），MTT（上海生物工程有限公司），Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒（美國BioLegend 公司），生理鹽水（湖南科倫有限公司），Caspase-3 抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）；p-ERK1/2 抗體（武漢Abclonal 公司），p-P38 抗體（美國Cell Signaling Technology 公司），RIPA 裂解液（強）、BCA蛋白定量試劑盒、ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒（廣州碧云天生物技術(shù)有限公司），彩色預(yù)染蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)（10～170 kD）[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]，PVDF 膜（美國Merck Millipore 公司）。二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱、臺式高速大容量冷凍離心機[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]，倒置顯微鏡[奧林巴斯（中國）有限公司]，離心機（湖南平凡科技有限公司），超凈工作臺（華宇凈化設(shè)備有限公司），酶標(biāo)儀（北京德泉興業(yè)商貿(mào)有限公司），流式細胞儀[貝克曼庫爾特商貿(mào)（中國）有限公司]，電泳儀電源、雙垂直電泳儀、轉(zhuǎn)印電泳儀（槽）（北京六一生物科技有限公司），水平脫色搖床（海門市其林貝爾儀器制造有限公司），化學(xué)發(fā)光儀（上海勤翔科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 HaCaT細胞培養(yǎng)及銀屑病模型復(fù)制

HaCaT 細胞貼壁培養(yǎng)于含10% 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中，置于37℃、飽和濕度、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每1～2 天換液1 次，細胞單層貼壁生長，待長滿瓶底時，用0.25%胰蛋白酶消化液消化成單個細胞，取對數(shù)生長期的細胞準(zhǔn)備實驗。

取對數(shù)生長期、生長狀態(tài)良好的HaCaT 細胞，以10×104個/孔細胞接種到6 孔板中，每孔體積2 500 μL。第2 天，將6 孔板中細胞培養(yǎng)基更換為含有不同濃度KGF （0 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、40 ng/mL）的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。在誘導(dǎo)第3 天時為每組細胞換液，繼續(xù)添加相應(yīng)濃度的KGF。用顯微鏡觀察加藥后0 h、12 h、1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d 的HaCaT 細胞形態(tài)及增殖情況，并拍照。

1.3 MTT 法檢測不同濃度KGF 組HaCaT 細胞的增殖

取對數(shù)生長期、生長狀態(tài)良好的HaCaT 細胞，以7 000 個/孔細胞接種到96 孔板，每孔體積100 μL。第2 天，將細胞分成5 組，每組3 個復(fù)孔，更換含有0 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、40 ng/mL 濃度KGF 的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)12 h、24 h、48 h。每孔加20 μL MTT 溶液（5 mg/mL），在37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，小心吸棄孔內(nèi)上清液，每孔加150 μL DMSO，振蕩10 min，測定并記錄酶聯(lián)免疫檢測儀490 nm 波長處各孔的光密度（OD）值，以時間為橫坐標(biāo)，OD 值為縱坐標(biāo)繪制細胞生長曲線。

1.4 MTT 法檢測不同濃度白藜蘆醇組HaCaT 細胞的增殖

取對數(shù)生長期，生長狀態(tài)良好的HaCaT 細胞，以8 000個/孔細胞接種到96孔板中，每孔體積100 μL。第2 天，將細胞分成5 組，每組3 個復(fù)孔，更換含有0 μmol/L、0.5 μmol/L、1.0 μmol/L、2.0 μmol/L、4.0 μmol/L濃度白藜蘆醇的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每孔加20 μL MTT 溶液（5 mg/mL），在37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，小心吸棄孔內(nèi)上清液，每孔加150 μL DMSO，振蕩10 min，測定并記錄酶聯(lián)免疫檢測儀490 nm 波長處各孔的OD 值，計算細胞存活率及半抑制濃度（IC50）。細胞存活率=（實驗組OD值/空白對照組OD 值）×100%。

1.5 MTT法檢測各組銀屑病模型細胞的增殖

取對數(shù)生長期、生長狀態(tài)良好的HaCaT 細胞，以8 000個/孔細胞接種到96孔板中，每孔體積100 μL。第2 天，以40 ng/mL KGF 處理細胞24 h。第3 天，棄原培養(yǎng)基，將細胞分成陰性對照組（30 μg/L 生理鹽水），2.5 μmol/L、5.0 μmol/L、7.5 μmol/L 白藜蘆醇組，陽性對照組（5.0 μg/mL 維A 酸）及空白對照組（未加任何藥物）6 組，每組3 個復(fù)孔，更換相應(yīng)培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h、72 h，每孔加20 μL MTT 溶液（5 mg/mL），在37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，小心吸棄孔內(nèi)上清液，每孔加150 μL DMSO，振蕩10 min，測定并記錄酶聯(lián)免疫檢測儀490 nm 波長處各孔的OD 值。以時間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)繪制細胞生長曲線。

1.6 流式細胞術(shù)檢測各組銀屑病模型細胞的凋亡

1.7 Western blotting 檢測各組銀屑病模型細胞p-ERK1/2、p-P38、Caspase-3蛋白的相對表達量

取對數(shù)生長期、生長狀態(tài)良好的HaCaT 細胞，以2.5×105個/孔細胞接種到6 孔板中，每孔體積2 500 μL。第2 天，以40 ng/mL 的KGF 處理細胞24 h。第3 天，棄原培養(yǎng)基，將細胞分成陰性對照組（30 μg/L生理鹽水），2.5 μmol/L、5.0 μmol/L、7.5 μmol/L 白藜蘆醇組，陽性對照組（5 μg/mL 維A 酸）及空白對照組（未加任何藥物）6 組，每組3 個復(fù)孔，更換相應(yīng)培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)72 h。用細胞裂解液抽提各組細胞總蛋白，按BCA 試劑盒說明書操作步驟測定總蛋白含量后分裝，置入-80℃冰箱冷凍待用。分別取50 μg 各組蛋白，煮沸10 min 變性后，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離，電泳結(jié)束后，通過電轉(zhuǎn)移法將蛋白質(zhì)從SDS-PAGE 凝膠轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。硝酸纖維素膜在含5%BSA-PBST 中室溫輕搖60 min，分別加入Caspase-3（1∶1 000 稀釋）、p-ERK1/2（1∶500 稀釋）、p-P38（1∶500 稀釋）抗體，4℃孵育過夜，次日取出PVDF 膜，PBST 充分漂洗（6 min×5 次），加入1∶5 000 稀釋的過氧化物酶標(biāo)記的抗兔IgG，室溫孵育60 min，PBST 充分漂洗（6 min×5 次）后，化學(xué)熒光法顯色，利用Image J 灰度分析軟件做半定量分析測定Caspase-3、p-ERK1/2、p-P38 蛋白的相對表達量。GAPDH 為內(nèi)參。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用Graphad 軟件及SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用單因素方差分析或重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，兩兩比較用Tukey′s 檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 KGF對HaCaT細胞生長的影響

倒置顯微鏡觀察結(jié)果顯示，12 h、1 d、2 d，KGF各濃度組分別與0 ng/mL 組比較，細胞增殖明顯，細胞數(shù)量增多，密度增大，細胞呈圓形、長梭形，較密集分布（見圖1）。3 d、4 d、5 d、6 d、7 d，KGF 各濃度組分別與0 ng/mL 組比較，細胞增殖不明顯，細胞數(shù)量增多不顯著，密度小，呈較分散分布。

圖1 不同濃度KGF組HaCaT細胞的增殖情況（倒置顯微鏡×100倍）

2.2 不同KGF濃度組HaCaT細胞的OD值比較

不同KGF 濃度組HaCaT 細胞0 h、12 h、24 h、48 h的OD 值比較，采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，結(jié)果：①不同時間點的OD 值有差異（F=4 733.148，P=0.000）；②不同KGF濃度組的OD 值有差異（F=64.967，P=0.000），40 ng/mL KGF 組的OD 值高于其他濃度組（P＜0.05）；③不同KGF 濃度組OD 值的變化趨勢有差異（P=44.627，P=0.000），40 ng/mL KGF 組的OD 值從24 h 開始明顯高于其他濃度組（P＜0.05）（見表1和圖2）。以上結(jié)果表明，濃度為40 ng/mL 的KGF 從24 h 開始對HaCaT 細胞有明顯的增殖促進作用。本研究采用40 ng/mL KGF 處理HaCaT 細胞24 h 復(fù)制銀屑病模型。

圖2 不同KGF濃度組HaCaT細胞0 h、12 h、24 h和48 h的細胞生長曲線

表1 不同KGF濃度組HaCaT細胞0 h、12 h、24 h、48 h的OD值比較（±s）

組別0 ng/mL KGF組5 ng/mL KGF組10 ng/mL KGF組20 ng/mL KGF組40 ng/mL KGF組0 h 0.363±0.011 0.361±0.009 0.362±0.009 0.366±0.011 0.367±0.005 12 h 0.498±0.016 0.505±0.014 0.514±0.012 0.529±0.007 0.530±0.03 24 h 0.567±0.008 0.573±0.012 0.579±0.007 0.584±0.011 0.657±0.018 48 h 0.733±0.011 0.753±0.009 0.754±0.002 0.753±0.008 0.867±0.019

2.3 白藜蘆醇對HaCaT細胞增殖能力的影響

MTT 法檢測結(jié)果顯示，0 μmol/L、0.5 μmol/L、1.0 μmol/L、2.0 μmol/L、4.0 μmol/L 白藜蘆醇作用HaCaT 細胞24 h 后的OD 值分別為（0.82±0.007）、（0.72±0.027）、（0.64±0.002）、（0.61±0.006）及（0.52±0.010），各組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=1 009.343，P=0.000），白藜蘆醇濃度升高OD 值降低；進一步兩兩比較，各組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。0 μmol/L、0.5 μmol/L、1.0 μmol/L、2.0 μmol/L、4.0 μmol/L 白藜蘆醇作用HaCaT 細胞24 h 后的細胞存活率分別為（100±0.000）%、（87±0.015）%、（79±0.006）%、（74±0.011）%、（63±0.016）%，見圖3。白藜蘆醇的IC50 為5.3 μmol/L，故下一步實驗的白藜蘆醇低濃度為2.5 μmol/L、中濃度為5.0 μmol/L、高濃度為7.5 μmol/L。

圖3 不同濃度白藜蘆醇作用HaCaT細胞24 h后的細胞存活率

2.4 白藜蘆醇對銀屑病模型細胞增殖能力的影響

空白對照組、陰性對照組、2.5 μmol/L 白藜蘆醇組、5.0 μmol/L 白藜蘆醇組、7.5 μmol/L 白藜蘆醇組、陽性對照組銀屑病模型細胞24 h、48 h、72 h 的OD值比較，采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，結(jié)果：①不同時間點的OD 值有差異（F=690.102，P=0.000）；②各組的OD 值有差異（F=58.750，P=0.000）；③各

2.5 白藜蘆醇對銀屑病模型細胞凋亡的影響

空白對照組、陰性對照組、2.5 μmol/L 白藜蘆醇組、5.0 μmol/L 白藜蘆醇組、7.5 μmol/L 白藜蘆醇組、陽性對照組銀屑病模型細胞的凋亡率分別為（4.16±1.47）% 、（5.12±1.53）% 、（10.58±1.34）% 、組OD 值的變化趨勢有差異（F=8.474，P=0.000）；進一步兩兩比較，5.0 μmol/L 白藜蘆醇組、7.5 μmol/L 白藜蘆醇組和陽性對照組48 h 和72 h 的OD值低于陰性對照組（P＜0.05）。見表2和圖4。（20.17±1.99）%、（29.43±1.10）%、（30.65±1.96）%，各組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=109.200，P=0.000），進一步兩兩比較，5.0 μmol/L 白藜蘆醇組、7.5 μmol/L 白藜蘆醇組和陽性對照組細胞凋亡率高于陰性對照組（P＜0.05）。見圖5。

表2 各組銀屑病模型細胞24 h、48 h和72 h的OD值比較（±s）

注：?與陰性對照組比較，P ＜0.05。

組別空白對照組陰性對照組2.5 μmol/L白藜蘆醇組5.0 μmol/L白藜蘆醇組7.5 μmol/L白藜蘆醇組陽性對照組72 h 1.485±0.061 1.616±0.077 1.299±0.042 1.161±0.101?1.083±0.042?1.011±0.094?24 h 0.678±0.099 0.638±0.039 0.516±0.011 0.585±0.028 0.555±0.028 0.481±0.012 48 h 1.157±0.058 1.278±0.064 1.017±0.066 0.895±0.029?0.867±0.030?0.852±0.048?

圖4 各組銀屑病模型細胞24 h、48 h和72 h的生長曲線

圖5 各組銀屑病模型細胞凋亡的流式細胞圖

2.6 各組銀屑病模型細胞p-ERK1/2、p-P38、Caspase-3蛋白相對表達量的比較

空白對照組、陰性對照組、2.5 μmol/L 白藜蘆醇組、5.0 μmol/L 白藜蘆醇組、7.5 μmol/L 白藜蘆醇組、陽性對照組銀屑病模型細胞Caspase-3、p-ERK1/2、p-P38 蛋白相對表達量的比較，采用單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；進一步兩兩比較，5.0 μmol/L 白藜蘆醇組、7.5 μmol/L 白藜蘆醇組、陽性對照組與陰性對照組和空白對照組比較，Caspase-3蛋白相對表達量升高（P＜0.05），p-ERK1/2、p-P38 蛋白相對表達量降低（P＜0.05）。見圖6和表3。

圖6 各組銀屑病模型細胞Caspase-3、p-ERK1/2、p-P38蛋白表達

表3 各組銀屑病模型細胞Caspase-3、p-ERK1/2、p-P38蛋白相對表達量的比較（±s）

注：①與陰性對照組比較，P ＜0.05；②與空白對照組比較，P ＜0.05。

p-P38 0.99±0.087 0.78±0.050 0.78±0.062 0.38±0.742①②0.17±0.038①②0.18±0.050①②62.954 0.000組別空白對照組陰性對照組2.5 μmol/L白藜蘆醇組5.0 μmol/L白藜蘆醇組7.5 μmol/L白藜蘆醇組陽性對照組F 值P 值Caspase-3 0.26±0.040 0.31±0.054 0.43±0.125 0.67±0.043①②0.77±0.039①②0.70±0.035①②23.077 0.001 p-ERK1/2 0.85±0.028 0.81±0.033 0.64±0.042 0.43±0.038①②0.31±0.054①②0.44±0.032①②64.844 0.000

3 討論

MAPK 家族有4 個亞家族，包括ERK、c-Jun 氨基末端激酶（JNK）、P38 和ERK5，參與細胞的增殖、分化、基因表達和細胞凋亡過程[18-19]。其中ERK1/2 和P38 在細胞增殖或炎癥因子的表達中發(fā)揮作用。ERK1/2 的磷酸化會導(dǎo)致細胞周期蛋白D1 的轉(zhuǎn)錄激活，周期蛋白依賴性激酶（CDK）抑制劑P27 的降解以及P90 核糖體S6 激酶（P90RSK）的激活，并通過靶向基因表達來促進細胞增殖、存活和轉(zhuǎn)移[20]。P38的激活可降低腫瘤抑制因子microRNA-200b 的表達，促進乳腺癌癌細胞的異常增殖[21]?？梢?，MAPK信號通路的激活參與了腫瘤細胞的異常增殖。

白藜蘆醇能夠抑制癌細胞的增殖，并誘導(dǎo)各種類型癌細胞的細胞周期停滯和凋亡[22]。研究表明，白藜蘆醇的抗腫瘤活性可通過調(diào)控P38/MAPK 或ERK/MAPK 發(fā)揮作用。在胰腺癌[23]、結(jié)腸癌[24]、肺癌[25]中，白藜蘆醇可抑制P38/MAPK 或ERK/MAPK 通路抑制腫瘤細胞。在抗炎方面，有研究[26]發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇可通過抑制MAPK 信號通路中P38 和ERK 的磷酸化使促炎細胞因子——腫瘤壞死因子-α（TNFα）和白細胞介素-1（IL-1）等的表達降低，從而抑制炎癥反應(yīng)。MAPK 通路是白藜蘆醇發(fā)揮其生物學(xué)活性重要的信號傳導(dǎo)通路。

目前，HaCaT 細胞是體外建立銀屑病模型最常用的細胞，具有傳代特征穩(wěn)定，增殖和分化與角質(zhì)形成細胞相似的特征。KGF 是促角質(zhì)形成細胞增殖的最強因子，目前，國內(nèi)多位學(xué)者[15-17]都采用HaCaT細胞復(fù)制銀屑病模型，顯微鏡下細胞數(shù)量增多，密度增大，細胞呈圓形、長梭形，細胞增殖明顯，此狀態(tài)模擬銀屑病病理生理改變。本研究首先通過不同濃度的KGF 誘導(dǎo)HaCaT 細胞，選擇最佳刺激濃度及最佳刺激時間，即濃度為40 ng/mL 的KGF 刺激24 h 后，HaCaT 細胞增殖明顯，模擬銀屑病角質(zhì)形成細胞異常增殖情況，復(fù)制銀屑病細胞模型。

半抑制濃度或半抑制率，即IC50，是某種藥物誘導(dǎo)細胞凋亡50%時的濃度。在進行體外實驗設(shè)定實驗藥物濃度時，一般先計算出該藥物的IC50值，后根據(jù)IC50 值確定給藥濃度，即IC50 值分布在濃度點的中間。本研究先用不同濃度的白藜蘆醇刺激HaCaT 細胞，計算出的IC50 為5.3 μmol/L，并根據(jù)該結(jié)果設(shè)定下一步實驗的白藜蘆醇濃度，即低濃度為2.5 μmol/L、中濃度為5.0 μmol/L、高濃度為7.5 μmol/L。然后，分別用2.5 μmol/L、5.0 μmol/L、7.5 μmol/L 的白藜蘆醇，以及5.0 μmol/L 維A 酸干預(yù)銀屑病模型細胞。MTT 法及流式細胞術(shù)檢測細胞增殖及凋亡，結(jié)果顯示，白藜蘆醇可抑制KGF 的促細胞增殖效應(yīng)，促進銀屑病模型細胞凋亡。Western blotting 結(jié)果顯示，使用白藜蘆醇作用于銀屑病模型細胞，其Caspase-3 蛋白表達升高，而p-ERK1/2 和p-P38 蛋白表達降低。由此推測，白藜蘆醇可能通過抑制ERK/MAPK 通路和/或P38/MAPK 通路發(fā)揮作用，抑制銀屑病模型細胞的增殖并促進其凋亡。

綜上所述，白藜蘆醇可抑制銀屑病模型細胞的增殖并促進其凋亡，其可能通過抑制ERK/MAPK 通路和/或P38/MAPK 通路發(fā)揮作用，具體作用機制還有待更深入的研究。