杜露平,侯立婷,于曉明,程海衛(wèi),鄭其升,陳瑾*

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物免疫工程研究所/江蘇省國(guó)家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心/江蘇省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 南京 210014;2.江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 揚(yáng)州 225009)

口蹄疫(FMD)發(fā)病急,傳播速度快,對(duì)畜牧業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失,世界衛(wèi)生組織將其列為A類烈性傳染病,我國(guó)將其列為一類傳染病,同時(shí)將其列入強(qiáng)制免疫計(jì)劃。目前口蹄疫免疫接種主要使用滅活疫苗。報(bào)道稱,育肥豬首免后40 d抗體水平基本消失,因此需首免后1個(gè)月進(jìn)行加強(qiáng)免疫,種豬1年則需進(jìn)行3～4次免疫[1],多次免疫無(wú)法保障動(dòng)物福利,且提高了養(yǎng)殖成本。本研究室結(jié)合畜牧業(yè)實(shí)際需求,研制出一種免疫增強(qiáng)劑CVC1302,其與口蹄疫滅活疫苗配伍使用,單劑量免疫豬只即可檢測(cè)到顯著增強(qiáng)的高水平液相阻斷抗體,且高水平抗體持續(xù)至少6個(gè)月[2]。

濾泡輔助性T細(xì)胞(follicular helper T cells,TFH)是一種定位于淋巴結(jié)濾泡區(qū)的CD4+T細(xì)胞亞群,是體液免疫的重要調(diào)控細(xì)胞亞群,輔助B細(xì)胞建立生發(fā)中心(germinal center,GC)[3]。在GC,B細(xì)胞在增殖的同時(shí)伴隨體細(xì)胞高頻突變,通過(guò)親和力篩選產(chǎn)生高親和力抗體和長(zhǎng)效體液免疫。CVC1302由Toll樣受體和NOD樣受體激動(dòng)劑復(fù)配組成,其主要成分為單磷酰脂質(zhì)A、胞壁酰二肽和β-葡聚糖。前期研究發(fā)現(xiàn),CVC1302可通過(guò)促進(jìn)TFH細(xì)胞分化介導(dǎo)FMD滅活疫苗誘導(dǎo)的GC應(yīng)答,產(chǎn)生分泌高親和力抗體的長(zhǎng)壽漿細(xì)胞(long-lived plasma cells,LLPC),為機(jī)體提供長(zhǎng)效體液免疫應(yīng)答[4]。然而,由于缺少針對(duì)口蹄疫病毒(FMDV)全病毒的特異性熒光抗體,使前期試驗(yàn)僅局限于定性分析。本研究以NP-OVA作為模式抗原,對(duì)CVC1302促進(jìn)TFH細(xì)胞、抗原NP特異性GC B細(xì)胞、漿母細(xì)胞、LLPC分化進(jìn)行定量分析,以解析CVC1302輔助抗原誘導(dǎo)小鼠機(jī)體產(chǎn)生長(zhǎng)效體液免疫應(yīng)答的機(jī)制,為新型免疫增強(qiáng)劑及FMDV疫苗的研制提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

6周齡BALB/c雌性小鼠購(gòu)自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心;NP-OVA、NP15-BSA、NP1-BSA和NP-Biotion購(gòu)自美國(guó)Bioscience Technologies公司;單磷酰脂質(zhì)A(MPLA)購(gòu)自北京邦定生物醫(yī)學(xué)公司;胞壁酰二肽(MDP)購(gòu)自上海瀚泓科技有限公司;β-葡聚糖購(gòu)自河北克隆多生物科技有限公司;佐劑ISA206購(gòu)自上海Seppic賽彼科特殊化學(xué)品有限公司;熒光抗體(anti-CD4 PE-Vio770、anti-CXCR5 FITC、anti-PD-1 APC、anti-B220 FITC、anti-B220 APC、anti-GL-7 PE、anti-GL-7 PE-Vio770、anti-CD138 PE、anti-CD38 PE-Vio770)、Streptavidin-FITC、DAPI和胞內(nèi)因子染色試劑盒及凋亡檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司;Trizol試劑和qPCR mix購(gòu)自上海皓嘉科技發(fā)展有限公司;Hank’s平衡液及DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 疫苗制備免疫增強(qiáng)劑CVC1302依據(jù)專利(ZL 201310042983.0)配制,MPLA、MDP和β-葡聚糖按照一定比例溶于蒸餾水中,與NP-OVA按照體積比1∶50混合后得到水相。先將ISA206與水相分別放置于室溫下約30 min,再將ISA206放入乳化罐中,在200 r·min-1攪拌過(guò)程中將水相溶液倒入乳化罐中,攪拌均勻,隨后2 000 r·min-1攪拌10 min,獲得疫苗NP-CVC1302,其中水相與ISA206的體積比為1∶1,最終每100 μL疫苗中含有50 μg NP-OVA、1 μL CVC1302。

1.2.2 小鼠免疫試驗(yàn)將6周齡BALB/c雌性小鼠21只隨機(jī)均分為3組,分別于后腿肌肉接種ISA206,NP 或者NP-CVC1302,每只100 μL。利用NP1-BSA或NP15-BSA包被的ELISA板分別檢測(cè)小鼠免疫后7、14、42、90、120和150 d血清中總NP(NP1)及高親和力NP(NP15)特異性抗體水平及免疫后42 d血清中NP1特異性IgG1和IgG2a分型抗體水平。

將6周齡BALB/c雌性小鼠9只隨機(jī)均分為3組,分別于后腿肌肉接種ISA206、NP或者NP-CVC1302,每只100 μL。于免疫后14 d收集腹股溝淋巴結(jié),制備單個(gè)淋巴細(xì)胞,利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)TFH細(xì)胞、NP+GC B細(xì)胞、NP+漿母細(xì)胞分化水平;利用間接免疫熒光法檢測(cè)GC數(shù)目。

將6周齡BALB/c雌性小鼠9只隨機(jī)均分為3組,分別于后腿肌肉接種ISA206、NP或者NP-CVC1302,每只100 μL。于免疫后14 d收集骨髓液,制備單個(gè)淋巴細(xì)胞,利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)NP+LLPC分化水平。

1.2.3 ELISA檢測(cè)小鼠NP特異性抗體和分型抗體水平參照文獻(xiàn)[5-6],利用NP1-BSA或NP15-BSA包被的ELISA板分別檢測(cè)小鼠免疫后7、14、42、90、120和150 d血清中NP特異性抗體水平及免疫后42 d血清中NP特異性IgG1和IgG2a分型抗體水平。

1.2.4 間接免疫熒光法觀察GC數(shù)目免疫后14 d,取小鼠腹股溝淋巴結(jié),縱向剖開并用PBS徹底清洗,之后用4%多聚甲醛室溫固定1～4 h,冷凍切片機(jī)(CM1950,德國(guó)徠卡公司)將淋巴結(jié)切成10 μm厚度的切片,再將其置于防脫載玻片上,用PBS清洗以去除多余的部分,用含5% FBS的PBS封閉30 min后,加anti-B220 FITC、GL-7 PE、DAPI染色,用激光共聚焦顯微鏡(美國(guó)鉑金埃爾默公司)觀察[7]。

1.2.5 小鼠腹股溝淋巴結(jié)及骨髓單個(gè)淋巴細(xì)胞制備免疫后14 d分別收集小鼠腹股溝淋巴結(jié),用含100 U·mL-1青霉素、100 U·mL-1鏈霉素的預(yù)冷PBS緩沖液沖洗4～6次,用眼科剪將其剪成約1 mm3的碎塊,隨后利用Medimachine系統(tǒng)(美國(guó)BD公司)制備單個(gè)淋巴細(xì)胞[8]。

免疫后42 d收集小鼠后腿脛骨和腓骨,利用無(wú)菌PBS緩沖液沖洗獲得骨髓沖洗液,200 r·min-1離心 5 min,棄上清液后加入紅細(xì)胞裂解液重懸細(xì)胞,洗滌細(xì)胞2次,經(jīng)70 μm過(guò)濾后的濾液于200 r·min-1離心5 min,棄上清液后加入DMEM重懸,制備得到單個(gè)淋巴細(xì)胞懸液[9-10]。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)GC應(yīng)答水平為分析CVC1302對(duì)GC應(yīng)答的影響,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)TFH細(xì)胞、NP+GC B細(xì)胞和NP+漿母細(xì)胞分化水平。各取制備的小鼠腹股溝淋巴結(jié)單個(gè)淋巴細(xì)胞1×106mL-1細(xì)胞于3支1.5 mL無(wú)菌離心管中,1支利用anti-CD4 PE-Vio770、anti-CXCR5 FITC、anti-PD-1 APC進(jìn)行染色,利用BD Accuri C6流式細(xì)胞儀檢測(cè)TFH細(xì)胞(CD4+CXCR5+PD-1+)數(shù);1支利用胞內(nèi)細(xì)胞因子染色試劑盒對(duì)細(xì)胞進(jìn)行破膜固定,然后利用anti-B220 FITC、anti-GL-7 PE-Vio770、NP-Biotion、Streptavidin-FITC進(jìn)行染色,再用BD Accuri C6流式細(xì)胞儀檢測(cè)NP+GC B細(xì)胞(NP+B220+GL-7+CD38+)數(shù);1支利用胞內(nèi)細(xì)胞因子染色試劑盒對(duì)細(xì)胞進(jìn)行破膜固定,隨后用anti-B220 APC、anti-CD38 PE-Vio770、NP-Biotion、Streptavidin-FITC進(jìn)行染色,再用BD Accuri C6流式細(xì)胞儀檢測(cè)NP+漿母細(xì)胞(NP+B220+CD38+)數(shù)目,進(jìn)而分析小鼠腹股溝淋巴結(jié)GC應(yīng)答水平。

1.2.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)骨髓NP+LLPC分化水平取制備的小鼠骨髓單個(gè)淋巴細(xì)胞1×106mL-1于1支1.5 mL無(wú)菌離心管中,利用胞內(nèi)細(xì)胞因子染色試劑盒對(duì)細(xì)胞進(jìn)行破膜固定,隨后利用anti-B220 APC、anti-CD138 PE、NP-Biotion、Streptavidin-FITC進(jìn)行染色,再利用BD Accuri C6流式細(xì)胞儀檢測(cè)NP+LLPC(NP+B220+CD138+)數(shù),進(jìn)而分析小鼠骨髓NP+LLPC分化水平。

1.2.8 相對(duì)定量PCR(qPCR)檢測(cè)抗凋亡轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄水平免疫后42 d,制備小鼠骨髓淋巴細(xì)胞,取相同數(shù)目的淋巴細(xì)胞提取RNA[11]。利用表1中的引物經(jīng)qPCR[12]檢測(cè)骨髓淋巴細(xì)胞抗凋亡轉(zhuǎn)錄因子Mcl-1、Bcl-2、BCMA和BAFF的轉(zhuǎn)錄水平。

表1 本試驗(yàn)用引物對(duì)序列Table 1 Sequences of primers used in the experiments

1.3 數(shù)據(jù)處理與差異性分析

利用Graph Prism 8.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析。采用ANOVA分析各組之間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 CVC1302對(duì)小鼠NP特異性抗體及分型抗體水平的影響

利用NP-BSA包被的ELISA平板分別檢測(cè)免疫后7、14、42、90、120和150 d小鼠NP特異性抗體及分型抗體滴度。結(jié)果顯示:免疫后7 d,NP和NP-CVC1302組小鼠血清中總NP(NP1)及高親和力NP(NP15)特異性抗體滴度差異均顯著(P<0.05),其余時(shí)間點(diǎn),NP-CVC1302組小鼠血清中NP1或NP15抗體滴度均顯著高于NP組小鼠(P<0.001),各檢測(cè)時(shí)間點(diǎn),ISA206組小鼠血清中NP1或NP15抗體滴度均為所有組最低值(圖1-A);免疫后42 d,NP-CVC1302組小鼠NP15/NP1比值顯著高于NP組(P<0.01,圖1-B),且 NP-CVC1302 組小鼠NP1抗體的IgG1及IgG2a分型抗體均顯著高于NP組(P<0.01,P<0.001,圖1-C)。上述結(jié)果表明,CVC1302不僅可以使免疫小鼠獲得長(zhǎng)達(dá)5個(gè)月的體液免疫應(yīng)答,且抗體親和力得到顯著提高,同時(shí)分型抗體滴度也顯著提升。

圖1 免疫小鼠NP特異性抗體及分型抗體的檢測(cè)結(jié)果Fig.1 NP-specific antibody titers in mice following vaccinated with NP-CVC1302 A.總NP(NP1)及高親和力NP(NP15)特異性抗體滴度;B. 免后42 d,NP1和NP15特異性抗體滴度及NP15/NP1特異性抗體滴度比值;C. 免后42 d,NP1特異性IgG1及IgG2a分型抗體滴度。 *P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。A. Total NP(NP1)and high affinity NP(NP15)specific antibody titers;B. At 42 days post immunization(dpi),NP1 and NP15 specific antibody titers,and the ratio of NP15/NP1 specific antibody titers;C. At 42 dpi,NP1 specific antibody IgG1 and IgG2a titers. *P<0.05,**P<0.01,***P<0.001.

2.2 CVC1302對(duì)小鼠腹股溝淋巴結(jié)GC應(yīng)答的影響

小鼠免疫后14 d,取腹股溝淋巴結(jié),利用激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)小鼠腹股溝淋巴結(jié)GC數(shù)。結(jié)果(圖2)顯示,免疫后14 d,NP-CVC1302組小鼠單個(gè)腹股溝淋巴結(jié)中GC數(shù)(紅色箭頭)平均值約為6,而NP組小鼠單個(gè)腹股溝淋巴結(jié)GC數(shù)平均值約為2,2組之間差異極顯著(P<0.01)。

圖2 免疫后14 d小鼠腹股溝淋巴結(jié)生發(fā)中心(GC)數(shù)檢測(cè)結(jié)果Fig.2 The number of germinal center(GC)in inguinal lymph nodes of mice at 14 dpi following vaccinated with NP-CVC1302

免疫后14 d,取腹股溝淋巴結(jié),制備單個(gè)淋巴細(xì)胞,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)TFH、NP+GC B細(xì)胞和NP+漿母細(xì)胞比例。結(jié)果(圖3)顯示:免疫后14 d,NP-CVC1302組小鼠腹股溝淋巴結(jié)中TFH占CD4+T細(xì)胞比例極顯著高于NP組(P<0.01),NP+GC B細(xì)胞比例及NP+漿母細(xì)胞比例也顯著高于NP組小鼠(P<0.01,P<0.05)。

圖3 免疫后14 d小鼠腹股溝淋巴結(jié)TFH細(xì)胞、NP+GC B細(xì)胞、NP+ 漿母細(xì)胞分化水平的檢測(cè)結(jié)果Fig.3 The differentiation levels of TFH,NP+ GC B cells and NP+ plasma blasts in draining lymph nodes of mice at 14 dpi following vaccinated with NP-CVC1302

2.3 CVC1302對(duì)小鼠骨髓LLPC分化水平的影響

小鼠免疫后42 d收集骨髓沖洗液,制備單個(gè)淋巴細(xì)胞,熒光抗體染色后流式細(xì)胞儀檢測(cè)LLPC分化水平情況。免疫后42 d,小鼠總NP抗體水平最高,因此檢測(cè)該時(shí)間點(diǎn)的NP+LLPC分化水平,以分析CVC1302對(duì)誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生長(zhǎng)效體液免疫應(yīng)答的影響。結(jié)果(圖4)顯示,免疫后42 d,NP-CVC1302組小鼠骨髓NP+LLPC比例顯著高于NP組小鼠(P<0.01)。此結(jié)果表明CVC1302可以促進(jìn)NP+LLPC分化,為機(jī)體提供長(zhǎng)效體液免疫應(yīng)答。

圖4 免疫后42 d小鼠骨髓NP+長(zhǎng)壽漿細(xì)胞(LLPC) 分化水平的檢測(cè)結(jié)果Fig.4 The differentiation levels of NP+ long-lived plasma cells(LLPC)in bone marrow of mice at 42 dpi following vaccinated with NP-CVC1302

圖5 免疫后42 d小鼠骨髓淋巴細(xì)胞抗凋亡 轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄水平Fig.5 The levels of anti-apoptotic transcription factors of lymphocyte in bone marrow of mice at 42 dpi following vaccinated with KV-CVC1302

2.4 CVC1302對(duì)抗凋亡轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄水平的影響

小鼠免疫后42 d收集骨髓沖洗液,制備單個(gè)淋巴細(xì)胞,取相同數(shù)目的淋巴細(xì)胞利用TRIzol試劑提取RNA,并利用qPCR檢測(cè)各組小鼠骨髓淋巴細(xì)胞Mcl-1、Bcl-2、BCMA和BAFFmRNA轉(zhuǎn)錄水平。從圖5可見:NP-CVC1302組小鼠骨髓淋巴細(xì)胞Mcl-1、Bcl-2、BCMA和BAFFmRNA相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平分別為2.93、4.69、6.54和6.16,NP組小鼠4種基因的轉(zhuǎn)錄水平分別為0.97、1.17、1.04和1.13,2組之間差異均顯著(P<0.05,P<0.001)。上述結(jié)果表明,CVC1302可以促進(jìn)骨髓處LLPC的抗凋亡轉(zhuǎn)錄因子Mcl-1、Bcl-2、BCMA和BAFFmRNA 的高水平轉(zhuǎn)錄,進(jìn)而延長(zhǎng)LLPC的壽命。

3 討論

機(jī)體接種FMD疫苗后,其產(chǎn)生的抗體水平與機(jī)體抵抗病毒能力具有直接相關(guān)性[12-13]。免疫增強(qiáng)劑CVC1302是由Toll樣受體和NOD樣受體激動(dòng)劑組成,其可以顯著提高免疫小鼠和豬的體液免疫應(yīng)答,抗體持續(xù)期可長(zhǎng)達(dá)6個(gè)月[2,11]。因此,探究CVC1302提高機(jī)體抗體水平的免疫機(jī)制對(duì)免疫增強(qiáng)劑及FMD疫苗的研制,具有一定的指導(dǎo)意義。

機(jī)體啟動(dòng)免疫應(yīng)答后,活化的抗原特異性B細(xì)胞有兩種命運(yùn),一種是分化為短壽漿細(xì)胞,分泌低親和力抗體;一種是啟動(dòng)GC應(yīng)答[14],分化為高親和力的記憶性B細(xì)胞[15]和LLPC,分泌高親和力抗體[16-18],LLPC遷移至骨髓,持續(xù)分泌抗體[19-20]。因此,明確LLPC產(chǎn)生的免疫機(jī)制是研制可以誘導(dǎo)持續(xù)保護(hù)性體液免疫力疫苗的關(guān)鍵要素。

前期對(duì)小鼠免疫試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),CVC1302可通過(guò)促進(jìn)TFH細(xì)胞分化,進(jìn)而對(duì)GC B細(xì)胞進(jìn)行正向選擇,促進(jìn)其分化為漿母細(xì)胞,進(jìn)而隨血液進(jìn)入骨髓,轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)LPC,持續(xù)分泌抗體為機(jī)體提供免疫保護(hù)力,但研究?jī)H局限于分析FMDV-CVC1302與FMDV兩組小鼠之間數(shù)據(jù)的差異,無(wú)法對(duì)抗原特異性GC B細(xì)胞、漿母細(xì)胞乃至LLPC進(jìn)行測(cè)定[4]。本研究以NP為模式抗原,借助NP-PE抗體檢測(cè)NP+GC B細(xì)胞、NP+漿母細(xì)胞和NP+LLPC,定量分析免疫增強(qiáng)劑CVC1302輔助抗原誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生長(zhǎng)效體液免疫應(yīng)答的機(jī)制,為新型免疫增強(qiáng)劑的研制提供理論基礎(chǔ)及研究方向。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示,免疫增強(qiáng)劑CVC1302可于小鼠腹股溝淋巴結(jié)處增強(qiáng)模式抗原NP誘導(dǎo)的TFH細(xì)胞分化及GC應(yīng)答(GC數(shù)及NP+GC B細(xì)胞比例顯著增多),進(jìn)而TFH細(xì)胞對(duì)NP+GC B細(xì)胞進(jìn)行正向選擇,高親和力的NP+GC B細(xì)胞轉(zhuǎn)化為NP+漿母細(xì)胞,隨著血流進(jìn)入骨髓,轉(zhuǎn)變?yōu)镹P+LLPC,通過(guò)抗凋亡轉(zhuǎn)錄因子Mcl-1、Bcl-2、BCMA和BAFFmRNA的高水平轉(zhuǎn)錄,使其半衰期延長(zhǎng)[21-23],持續(xù)分泌高親和力NP+抗體,為機(jī)體提供體液免疫保護(hù)。

本研究利用NP作為模式抗原,研究免疫增強(qiáng)劑CVC1302誘導(dǎo)LLPC產(chǎn)生的免疫機(jī)制,為后續(xù)新型免疫增強(qiáng)劑的研制提供研究思路及方向。