李靜浩，孫光偉，白 森，馬俊桃，楊艷華，孫敬國，陳振國*

（1.河南農(nóng)業(yè)大學 煙草學院，河南 鄭州 450002；2.湖北省煙草科學研究院，湖北 武漢 430030；3.廣西中煙工業(yè)有限責任公司，廣西 南寧 530001）

煙葉耐烤性是煙葉重要烘烤特性之一，指煙葉在變黃、定色期對環(huán)境的耐受程度，耐烤性好的煙葉表現(xiàn)為容易定色、烤后黑糟雜色煙葉少［1］。因此，明確煙葉耐烤性的判斷指標對烘烤工藝的設計以及煙葉烤后質(zhì)量的提升具有重要意義。煙葉耐烤性與其營養(yǎng)積累、成熟過程密切相關，例如鮮干比大于9.0的煙葉往往難以定色［2］，成熟過程較為緩慢的煙葉大多耐烤性較好，落黃衰老較快的煙葉耐烤性一般較差［3］。成熟度也是影響煙葉耐烤性的主要因素，成熟度適宜煙葉的超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）等保護酶活性較高，多酚氧化酶（PPO）活性較低，在烘烤過程中不易發(fā)生棕色化反應［4］。由于大田期的管理措施不當，煙葉因氣候等因素影響產(chǎn)生的黑暴煙，以及感染病毒病、葉斑病等的煙葉，往往也會因為PPO活性較高而表現(xiàn)出較差的耐烤性［5］。通過大量的基礎研究，研究人員們提出了以變褐時間［6］、變褐指數(shù)［7］、PPO活性等指標來判斷煙葉的耐烤性，制定出相關行業(yè)標準［8］，也揭示出耐烤性差的煙葉容易在烘烤過程中因酶促棕色化反應而發(fā)生褐變。而PPO作為煙葉酶促棕色化反應的關鍵酶，其活性與煙葉耐烤性之間存在密切關聯(lián)［9-10］。但是PPO能否與多酚類物質(zhì)接觸并發(fā)生反應受到煙葉細胞膜完整性、含水率等多個因素影響［9，11］。組織電導率常作為衡量細胞膜透性的重要指標，廣泛應用于種子活力測定和植物抗逆性研究［12-14］。植物組織電導率，相比于丙二醛（MDA）等反映細胞膜透性的指標而言，具有檢測快速、低成本的特點，烤煙在烘烤過程中的細胞膜完整性可通過測定電導率來動態(tài)監(jiān)測。本研究對2個品種烤煙的烘烤特性及其在烘烤過程中的生理生化指標變化進行測定，分析電導率與其余生理生化指標間的關聯(lián)，探究了煙葉組織電導率與其耐烤性的關系。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗于2019~2020年在湖北省煙草科學研究院利川柏楊實驗基地進行，供試品種為云煙87和K326，土壤為沙壤土，有機質(zhì)為2.32%、pH值為5.77、速效氮90.00 mg/kg、有效磷58.63 mg/kg、速效鉀125.00 mg/kg。依照優(yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程進行大田管理。

1.2 試驗方法

按照宮長榮等［1］正常采收云煙87和K326適熟煙葉，進行烘烤特性試驗和烘烤試驗。烘烤特性試驗在常溫下進行，每隔24 h觀察煙葉顏色變化情況，并取樣測定電導率；烘烤試驗采用小型電烤箱依照當?shù)爻Ｒ?guī)烘烤工藝進行掛桿烘烤，分別于烤前和烤后關鍵溫度點（鮮樣、38、40、42、44、48、54℃）末期取樣，切去葉尖和基部各1/3區(qū)域，留中部用于對相關指標的測定。

1.3 測定項目及方法

烘烤特性測定方法［8］：煙葉采收后，2個品種煙葉各選取素質(zhì)相近的15片，每12 h觀察1次，記錄2個品種煙葉的變黃、變褐程度，并計算變黃指數(shù)（YI）、變褐指數(shù)（BI）。

式（1）中，n為觀察記錄次數(shù)，Y為煙葉平均變黃比例，YI值越小，說明此煙葉易烤性越好；YI值越大，說明該煙葉易烤性越差。

式（2）中，n 為觀察記錄次數(shù)，B為煙葉平均變褐比例，BI值越小，說明此煙葉耐烤性越好；BI值越大，說明該煙葉耐烤性越差。

電導率測定方法［15］：使用8 mm孔徑打孔器，在煙葉主脈兩側(cè)的葉尖、葉中、葉基對稱取0.1 g葉片組織（避開支脈），在裝有10 mL雙蒸水的試管中浸泡3 h，使用GTCON30型便攜式電導率儀測定浸出液電導率，將試管置于100 ℃水浴鍋中10 min，冷卻至室溫后，測定絕對電導率，然后計算相對電導率。計算見公式（3）。

SOD、POD、CAT、PPO活性和MDA含量采用南京建成生物工程研究所試劑盒測定。

煙葉烤后依照國標對煙葉進行分級，并稱重計算不同色組煙葉比例［16］。

1.4 統(tǒng)計處理

使用Excel 2003軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計及作圖，采用SPSS 22.0進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 烘烤過程中煙葉電導率與MDA含量的變化

由圖1可知，烘烤過程對煙葉來說也是一種逆境，在逆境狀態(tài)下，煙葉細胞膜透性逐漸增大，電解質(zhì)外滲，致使電導率升高。2種煙葉烘烤過程中浸出液電導率變化趨勢相同，在烘烤過程中大致呈“S”型曲線上升。2個品種鮮煙葉的浸出液電導率、絕對電導率相似，而K326煙葉的相對電導率略高于云煙87。隨著烘烤進行，2個品種煙葉的浸出液電導率在42~44 ℃之間增長幅度最大，K326煙葉的相對電導率從烘烤開始至40 ℃的增幅明顯大于云煙87，云煙87煙葉的相對電導率則在40~44 ℃期間出現(xiàn)較大增長。并且K326烤中各階段的浸出液電導率、相對電導率總是高于云煙87，但是在38、40 ℃時云煙87的絕對電導率較高。

圖1 烘烤過程中煙葉電導率與MDA含量的變化

丙二醛（MDA）是細胞膜脂過氧化的產(chǎn)物之一，其含量與電導率可反映細胞膜受損程度和細胞衰老程度。K326鮮樣的丙二醛（MAD）含量稍低與云煙87，但是在烘烤過程中K326的丙二醛含量及上升速度高于云煙87，即K326在烘烤過程中細胞膜脂過氧化速度快于云煙87。尤其是在40~42℃階段，K326的浸出液電導率、丙二醛含量升高速度均高于云煙87。

2.2 烘烤過程中耐烤性相關酶活性的變化

由圖2可知，2種煙葉在烘烤過程中SOD、POD、CAT這3種抗氧化酶活性變化大致表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢。SOD是清除活性氧的關鍵酶，其可將多種活性氧歧化為H2O2，云煙87的SOD活性高峰在38 ℃，而K326則出現(xiàn)在42℃，并且K326的SOD活性下降較快。POD、CAT可催化H2O2分解為對細胞無害的物質(zhì)，其中K326的POD活性總體要高于云煙87，并且其活性高峰出現(xiàn)在40 ℃，而云煙87的POD活性高峰則出現(xiàn)在42 ℃，在48 ℃之后，2種煙葉的POD活性均快速下降。云煙87的CAT活性呈現(xiàn)先下降后上升再下降的規(guī)律，并且這2種煙葉的活性高峰均出現(xiàn)在42 ℃。

圖2 烘烤過程中煙葉SOD、POD、CAT和PPO活性的變化

煙葉的PPO被認為是一種與煙葉自身耐烤性密切相關的酶，正是由于煙葉中多酚類物質(zhì)被PPO氧化為醌類，進而轉(zhuǎn)化為黑色素才造成了煙葉褐變，使煙葉表現(xiàn)出較差的耐烤性。2種煙葉烘烤過程中的PPO活性差異較大，K326的PPO活性一直要高于云煙87。并且K326煙葉的PPO活性呈現(xiàn)先下降后上升再下降的趨勢，在40 ℃時PPO的活性最高；云煙87的PPO活性則呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢，38 ℃時的活性最高。

2.3 煙葉耐烤性比較

由圖3、表1可知，在烘烤特性試驗下，2個品種煙葉的變黃變褐規(guī)律相似，變黃速率均為先快后慢，前24 h變黃最快；變褐速率均為先慢后快再減緩。但云煙87的變黃速度相對較快，變黃時間為60 h；K326變黃相對緩慢，變黃時間為84 h；云煙87、K326的變褐指數(shù)分別為0.72、1.36，而且K326在變黃未達十成的時候就已經(jīng)開始變褐。云煙87相比K326延遲大約12 h才開始出現(xiàn)褐變現(xiàn)象，在褐變開始之后的48 h內(nèi)，云煙87褐變速度較慢，且K326的烤后雜色煙葉比例較高，說明云煙87的耐烤性較好，K326的耐烤性較差。

表1 2種煙葉的變褐指數(shù)與烤后外觀質(zhì)量

圖3 2種煙葉變黃、變褐程度比較

2.4 烘烤過程中各生理指標間的相關性分析

由表2可知，2種煙葉的浸出液電導率、絕對電導率、相對電導率之間存在顯著或極顯著的正相關關系，并且這3種電導率指標與MDA也呈極顯著的正相關。在云煙87煙葉中，3種電導率指標與SOD、POD、CAT、PPO活性的相關性不顯著，但SOD活性與PPO活性呈現(xiàn)顯著正相關性。在K326煙葉中，滲出液電導率、絕對電導率與PPO活性極顯著負相關。

表2 2個品種煙葉烘烤過程中各生理指標間的相關性

3 討論

隨著烘烤的進行，煙葉的丙二醛含量呈現(xiàn)上升趨勢，而丙二醛作為細胞膜脂過氧化的主要產(chǎn)物，其含量的上升說明煙葉細胞膜正在分解［17-19］，從而致使煙葉細胞內(nèi)含物質(zhì)外滲，電導率升高，即電導率指標在煙葉烘烤過程中可以反映煙葉細胞膜的完整性。本試驗研究結(jié)果表明，38、40 ℃時K326的相對電導率、滲出液電導率、MDA含量大于云煙87，而絕對電導率小于云煙87，說明滲出液電導率、相對電導率反映煙葉細胞的完整性更為合適；云煙87相比于K326變黃更快，在變黃前、中期色素降解量較大，所以煙葉絕對電導率在一定程度上可能反映了煙葉細胞內(nèi)物質(zhì)的分解和衰老程度［15］。

國內(nèi)外一些學者的研究結(jié)果表明，POD與PPO是引起植物組織褐變的關鍵酶類［20-22］，這是由于POD在清除H2O2的過程中，會同時將酚類物質(zhì)作為底物而氧化，而PPO則會直接氧化多酶類物質(zhì)。而綠原酸作為煙草中多酚類物質(zhì)之一，其可作為POD、PPO這2種酶的底物而引發(fā)煙葉褐變［23］。本試驗的研究表明，在變黃期，K326的POD、PPO活性均高于云煙87，且K326煙葉的細胞膜被破壞程度較大，酚類物質(zhì)與PPO、POD接觸過早，致使其烤后雜色煙葉比例較高，耐烤性相比于云煙87較差。因此，在實際烘烤作業(yè)中，POD活性適當降低，對阻止煙葉的酶促褐變有利，這一點與岳誠等［24］的研究結(jié)果一致。

4 結(jié)論

煙葉的烘烤特性與其烘烤過程中生理生化指標的變化密切相關，僅憑某種單一指標難以判斷煙葉的烘烤特性。研究結(jié)果表明，煙葉滲出液電導率和相對電導率與煙葉細胞膜的完整性關系密切，可作為判斷煙葉耐烤性的指標之一，并可與其POD、PPO活性相結(jié)合來判斷煙葉的耐烤性，同時煙葉的絕對電導率可能與煙葉細胞內(nèi)物質(zhì)的分解和衰老程度在著一定聯(lián)系。在實際烘烤過程中，可根據(jù)煙葉自身特點，適當調(diào)整烘烤工藝，在變黃期盡量維持煙葉細胞膜的完整性，避免煙葉滲出液電導率和相對電導率大幅增長，以此降低烤后雜色煙葉比例，提升烘烤質(zhì)量。