祝遠(yuǎn)奎，陳鴻祿，魏怡飛，王衛(wèi)民

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070)

羅氏沼蝦()，隸屬于節(jié)肢動(dòng)物門(mén)(Arthropoda)十足目(Decapoda)長(zhǎng)臂蝦科(Palaemonidae)沼蝦屬()，是一種經(jīng)濟(jì)價(jià)值高的水產(chǎn)動(dòng)物，其養(yǎng)殖區(qū)域廣泛分布于孟加拉國(guó)、中國(guó)、印度、緬甸、泰國(guó)和越南等亞洲國(guó)家。在全球蝦類養(yǎng)殖業(yè)中，羅氏沼蝦的養(yǎng)殖量已躋身前三。隨著羅氏沼蝦養(yǎng)殖量的持續(xù)增長(zhǎng)，由性早熟引起的生長(zhǎng)緩慢與抗逆性差等種質(zhì)衰退現(xiàn)象逐漸出現(xiàn)，并成為羅氏沼蝦養(yǎng)殖過(guò)程中不可忽視的問(wèn)題。因此，羅氏沼蝦的生殖調(diào)控研究在其產(chǎn)業(yè)發(fā)展中有重要意義。

卵巢是許多激素產(chǎn)生與分泌的主要場(chǎng)所和眾多激素受體的分布之處，如促性腺激素釋放激素樣肽、蛻皮激素受體與類視黃醇X受體，也是研究甲殼類動(dòng)物生長(zhǎng)和生殖相關(guān)基因的重要組織。許多研究表明，卵巢的發(fā)育受相關(guān)激素和基因的共同調(diào)控，包括促性腺激素釋放激素樣肽(-like peptides)、叉頭框家族L2基因(2,L2)、卵黃蛋白原基因(,)、組織蛋白酶L基因(,)、蛻皮類固醇受體基因(,)與一些類固醇合成相關(guān)基因，如類固醇生成酶基因(3,17)與細(xì)胞色素P450家族基因(111,17與191)。2基因?qū)儆诓骖^框(Forkhead box,FOX)家族，是卵巢分化、發(fā)育和維持等發(fā)育過(guò)程的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。2對(duì)卵巢的功能具有維持作用，在敲除2基因后，用黃體酮處理小鼠()的產(chǎn)后子宮可導(dǎo)致小鼠不孕。在魚(yú)類2的研究中也取得了類似的結(jié)果，周運(yùn)迪等在敲除青鳉()的2基因后發(fā)現(xiàn)青鳉的卵巢中出現(xiàn)了退化的卵母細(xì)胞，Yang等在敲除斑馬魚(yú)()的2基因后，發(fā)現(xiàn)斑馬魚(yú)卵巢的發(fā)育與卵子發(fā)生受到影響。此外2還與褐牙鲆()、施氏鱘()、烏鱧()等物種卵巢的發(fā)育有關(guān)。在克氏原螯蝦()與中華絨螯蟹()中的研究結(jié)果顯示，2僅在卵巢組織中高表達(dá)，并被認(rèn)為可能參與了卵巢的發(fā)育。羅氏沼蝦作為重要的水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)物種，其卵巢發(fā)育研究意義重大，但關(guān)于羅氏沼蝦2的研究仍未見(jiàn)報(bào)道。

本研究主旨是探究與分析羅氏沼蝦2基因在卵巢發(fā)育過(guò)程中的功能。本研究比較分析了2(2)在性成熟前后羅氏沼蝦肝胰腺與卵巢中的表達(dá)量變化，運(yùn)用RNA干擾技術(shù)沉默了2基因，確定了干擾2基因的最佳注射劑量，并比較了在不同的2-dsRNA注射劑量下生殖相關(guān)基因的表達(dá)量變化。本研究為羅氏沼蝦生殖調(diào)控研究提供了參考資料，同時(shí)也為羅氏沼蝦養(yǎng)殖與育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

從華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)養(yǎng)殖基地挑選健康、活力好的未性成熟羅氏沼蝦(體重約為1.55±0.08 g)10只，與性成熟[未產(chǎn)卵(體重約為3.50±0.07 g)與產(chǎn)卵一次(體重約為19.65±1.36 g)]羅氏沼蝦30只作為試驗(yàn)動(dòng)物，在300 L的養(yǎng)殖桶內(nèi)暫養(yǎng)一周后開(kāi)始試驗(yàn)，水溫控制在(28±0.5)℃，每日投喂4次蝦用飼料，每三日更換1/3的水。

1.2 樣品采集、總RNA提取與反轉(zhuǎn)錄

分別采集未性成熟與性成熟的羅氏沼蝦的卵巢與肝胰腺并用于RNA提取。采用Trizol法提取樣品中的總RNA，RNA的濃度由Nanodrop 2000(Thermo Scientific,USA)測(cè)定，并使用瓊脂糖凝膠電泳評(píng)估所提取RNA的質(zhì)量。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)使用PrimeScriptRT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa Bio Inc.，大連)試劑盒，總RNA的用量為1 μg，實(shí)驗(yàn)步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用滅菌水稀釋后保存于-20 ℃冰箱。

1.3 Mrfoxl2在性成熟前后羅氏沼蝦肝胰腺與卵巢中表達(dá)

挑選未性成熟與性成熟的雌性羅氏沼蝦各6只，分別摘取肝胰腺與卵巢組織，經(jīng)RNA提取與反轉(zhuǎn)錄后用于熒光定量分析，2在性成熟前后羅氏沼蝦肝胰腺與卵巢中的表達(dá)量由Quanstudio 6 Flex儀器檢測(cè)與分析。根據(jù)GenBank中所收錄的2序列(GenBank accession No.MZ647492)，利用Primer3web version 4.1.0(http://bioinfo.ut.ee/primer3/)在編碼區(qū)設(shè)計(jì)了一對(duì)引物(F-qf1/R-qf1)用于熒光定量PCR(表1)，熒光定量PCR的程序?yàn)?5 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，58 ℃ 30 s共 35 循環(huán)。每個(gè)樣品做三個(gè)重復(fù)，利用2方法計(jì)算三個(gè)重復(fù)的平均值。

表1 本研究中所用的引物序列

1.4 RNA干擾MrFoxl2后生殖相關(guān)基因的表達(dá)量變化

1.4.1 dsRNA模板的制備

利用在線軟件http://www.flyrnai.org/snapdragon在編碼區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)了一對(duì)引物(F-ds-f1/R-ds-f1)用于dsRNA的制備(表1)，從卵巢組織中提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，使用F-ds-f1/R-ds-f1作為引物，以卵巢cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所得的PCR產(chǎn)物使用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行評(píng)估，PCR反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，67 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，共 35 循環(huán)；72 ℃ 10 min。將符合預(yù)期的PCR產(chǎn)物切膠回收，DNA片段的回收與純化使用MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0試劑盒，經(jīng)純化后的產(chǎn)物保存于-20 ℃。

1.4.2 dsRNA的合成

以純化后的PCR產(chǎn)物為模板，用F-ds-f1/R-ds-f1引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，67 ℃ 45 s，72 ℃ 2 min，共36 循環(huán)；72 ℃ 10 min。所獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳評(píng)估后進(jìn)行切膠回收，利用HiScribeT7 High Yield RNA Synthesis Kit(NEB，USA)試劑盒，以切膠回收后的產(chǎn)物為模板合成2-dsRNA，所得產(chǎn)物由Nanodrop 2000(Thermo Scientific,USA)測(cè)定2-dsRNA濃度，并由瓊脂糖凝膠電泳評(píng)估其質(zhì)量與完整性。最后用MonarchRNA Cleanup Kit試劑盒對(duì)2-dsRNA進(jìn)行純化，用無(wú)酶水稀釋純化后的dsRNA并保存在-80 ℃。

1.4.3 dsRNA的注射

挑選16只卵巢發(fā)育正常且性成熟的羅氏沼蝦[體重為(3.50±0.15)g]用于RNA干擾試驗(yàn)，分為1個(gè)對(duì)照組與3個(gè)處理組，每組包含4只雌蝦，對(duì)照組與處理組的雌蝦均在相同條件下飼養(yǎng)。對(duì)照組的雌蝦注射無(wú)酶水，三個(gè)處理組的雌蝦注射dsRNA的劑量分別為0.5、1與2 μg/g，注射部位均為第二腹節(jié)，注射24 h后采集所有雌蝦的卵巢組織并迅速放入-80 ℃保存，RNA干擾2后卵巢中2、、與的表達(dá)量變化由Quanstudio 6 Flex儀器檢測(cè)與分析,所用引物見(jiàn)表1。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析由SPSS 19.0(SPSS Inc.,Chicago,IL,USA)軟件完成，<0.05被認(rèn)為有顯著性差異，利用GraphPad Prism 8(GraphPad Software,California,USA)軟件繪制熒光定量分析結(jié)果圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 性成熟前后MrFoxl2在肝胰腺與卵巢中的表達(dá)

2在羅氏沼蝦性成熟前后卵巢中的表達(dá)量均顯著高于肝胰腺，在未性成熟的羅氏沼蝦卵巢中2的表達(dá)量為肝胰腺的3.8倍，在性成熟的羅氏沼蝦卵巢中2的表達(dá)量為肝胰腺的9.5倍。2的表達(dá)量在性成熟前后羅氏沼蝦肝胰腺中無(wú)顯著差異，而性成熟后羅氏沼蝦卵巢中2的表達(dá)量明顯高于性成熟前(圖1)。

圖1 性成熟前后MrFoxl2在肝胰腺與卵巢中的表達(dá)

2.2 MrFoxl2-dsRNA的干擾效果驗(yàn)證和最適劑量探究

熒光定量PCR結(jié)果顯示，在注射2-dsRNA干擾2基因后，2的表達(dá)量顯著下降，由圖2可知，注射不同劑量的2_dsRNA對(duì)2基因產(chǎn)生了不同的干擾效果，注射2_dsRNA的劑量為1 μg/g時(shí)對(duì)2基因的干擾效果最佳，隨著注射劑量增加至2 μg/g，2_dsRNA對(duì)2基因的干擾效果反而減弱。

圖2 不同MrFoxl2-dsRNA注射劑量下卵巢中MrFoxl2的表達(dá)

2.3 MrFoxl2沉默后生殖相關(guān)基因表達(dá)量的變化

在2沉默后，生殖相關(guān)基因與的表達(dá)量顯著降低，而生殖相關(guān)基因的表達(dá)量顯著提高(圖3)。在注射2-dsRNA的劑量為0.5 μg/g時(shí)，與基因的表達(dá)量下降至最低，在注射劑量為1 μg/g時(shí)，2基因的表達(dá)量下降至最低，而與基因的表達(dá)量并未繼續(xù)降低。在2沉默后，隨著注射劑量從0.5 μg/g增加至1 μg/g時(shí)，基因的表達(dá)量繼續(xù)升高。

圖3 MrFoxl2沉默后生殖相關(guān)基因(VG、EcR and CatL)的表達(dá)

3 討論

由于羅氏沼蝦()的產(chǎn)卵周期較長(zhǎng)，并且在人工圈養(yǎng)下的自然產(chǎn)卵相對(duì)不集中，致使育苗成本增加。眼柄消融是過(guò)去實(shí)現(xiàn)促進(jìn)卵巢成熟的常用技術(shù)之一，但該方法造成的損傷導(dǎo)致了雌蝦在眼柄摘除后存活率降低。因此，相比摘除整個(gè)器官，通過(guò)操控相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控卵巢發(fā)育似乎是一種更好的方法。

性成熟是生物發(fā)育過(guò)程中的重要節(jié)點(diǎn)，在性成熟前后生殖相關(guān)基因的表達(dá)水平會(huì)出現(xiàn)顯著變化，方之平等發(fā)現(xiàn)性成熟后黃顙魚(yú)()與鲇()卵巢中的(-)和(-)的表達(dá)量明顯高于性成熟前，VON等發(fā)現(xiàn)在性成熟前后大西洋鱈()垂體中的1、2、()與(-)等基因的表達(dá)量有顯著性變化。本研究對(duì)比分析了羅氏沼蝦性成熟前后肝胰腺與卵巢中2的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)性成熟后羅氏沼蝦卵巢中2的表達(dá)量明顯高于性成熟前，這顯示2與羅氏沼蝦的生殖活動(dòng)關(guān)系密切。此外，性成熟前后2在卵巢中的表達(dá)量均顯著高于肝胰腺，這與2基因在克氏原螯蝦卵巢與肝胰腺中的表達(dá)模式類似。

2在一些哺乳動(dòng)物和魚(yú)類的卵巢發(fā)育中發(fā)揮了重要功能，但在甲殼動(dòng)物中，2基因所發(fā)揮的作用仍然未知。RNA干擾是研究基因功能的重要手段，通過(guò)注射dsRNA研究基因功能在甲殼動(dòng)物中已有諸多報(bào)道。本研究使用了不同劑量的2-dsRNA敲降2基因，發(fā)現(xiàn)1 μg/g的注射劑量對(duì)2基因的敲降效果最佳，并且2基因的敲降水平與2-dsRNA的注射劑量并未呈完全正相關(guān)，這與VENTURA等干擾(insulin-like androgenic gland)基因的研究結(jié)果類似。性腺的成熟依賴于卵母細(xì)胞中卵黃蛋白原的快速合成與積累，持續(xù)敲降基因會(huì)顯著延遲卵巢的成熟。本研究通過(guò)注射2-dsRNA顯著降低了2的表達(dá)水平，并且發(fā)現(xiàn)基因的表達(dá)水平隨著2被敲降而顯著降低，這表明2可能通過(guò)調(diào)控基因的表達(dá)從而參與卵巢的成熟過(guò)程，類似的結(jié)果在中華絨螯蟹中已被報(bào)道。在甲殼類動(dòng)物中，卵巢中的表達(dá)量在卵巢成熟前達(dá)到頂峰，基因被認(rèn)為介導(dǎo)了蛻皮類固醇刺激卵巢發(fā)育。本研究中RNA干擾2基因造成基因表達(dá)量的顯著下降，這佐證了2可能參與卵巢成熟過(guò)程的推論。此外，隨著注射劑量從0.5 μg/g增加至1 μg/g，2基因的表達(dá)量進(jìn)一步降低，而與基因的表達(dá)量反而相對(duì)上升，推測(cè)可能存在一些基因?qū)εc進(jìn)行正調(diào)控，并與2基因協(xié)同參與卵巢成熟過(guò)程。CatL是卵黃的水解酶，在昆蟲(chóng)與魚(yú)類的卵巢發(fā)育中起著核心作用。當(dāng)注射劑量為0.5 μg/g與1 μg/g時(shí)，基因的表達(dá)量顯著下降，卵黃蛋白原的合成可能受到抑制，基因表達(dá)量的顯著上升可能與機(jī)體保障卵巢發(fā)育有關(guān)，與基因表達(dá)量的負(fù)相關(guān)在Zhu等對(duì)日本沼蝦()基因的研究中已被報(bào)道。在脊椎動(dòng)物中的研究表明2可能與-1(-1)相互作用，共同調(diào)節(jié)細(xì)胞色素P450酶的轉(zhuǎn)錄并參與卵黃蛋白原的合成，根據(jù)本研究的結(jié)果推測(cè)，在甲殼類動(dòng)物中2基因可能通過(guò)調(diào)控基因的表達(dá)從而影響卵黃蛋白原的合成。甲殼動(dòng)物卵巢成熟的調(diào)節(jié)機(jī)制仍需更多的研究進(jìn)行探索和發(fā)現(xiàn)。

綜上所述，2在卵巢組織中高表達(dá)，并且性成熟后2在卵巢中的表達(dá)較性成熟前顯著上升。RNA干擾2基因造成與基因的表達(dá)量顯著下降，基因的表達(dá)量顯著上升，這表明2可能在羅氏沼蝦卵巢成熟過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。