李運娜，黃海碧，王 冠，戴曉光，王旭紅，蘇勝杰，賈 皓

（1.內(nèi)蒙古自治區(qū)動物疫病預(yù)防控制中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010；2.金宇保靈生物藥品有限公司/獸用疫苗國家工程實驗室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010030；3.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)畜產(chǎn)品質(zhì)量安全中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010）

邊界?。╞order disease，BD）是由邊界病病毒（border disease virus，BDV）感染引起的、小反芻動物綿羊和山羊的一種傳染性疾病， 最早發(fā)生在英格蘭和威爾士邊界，所以得名［1］。 該病呈世界性分布，流行率因國家和地區(qū)而異，從5%到90%不等；死亡率取決于感染的時間、 感染毒株的毒力以及感染宿主的物種［2］。 該病的主要特征是繁殖障礙，母畜表現(xiàn)為不孕、流產(chǎn)以及產(chǎn)死胎、弱胎或畸形胎；羔羊表現(xiàn)為顫抖、被毛異常；有些綿羊也表現(xiàn)為黏膜樣病變［3］。BDV 還可感染牛、豬以及其他種類的反芻動物［4-5］。 邊界病通常是水平傳播和垂直傳播，羔羊可能會持續(xù)性感染（persistent infection，PI）。

BDV 在羊、豬、牛之間可跨種傳播，給診斷帶來了困難，同時對牛病毒性腹瀉病毒（bovine viral diarrhea virus，BVDV） 的 根 除 產(chǎn) 生 一 定 影 響［6］。BDV 可以從馴化物種（豬、牛、羊）傳播到野生物種（羚羊、美洲駝、羊駝、野牛和馴鹿等）［7］。 由于瘟病毒屬成員之間存在廣泛的交叉反應(yīng)和種間傳播，根據(jù)宿主種類、特定組織和器官中的定位、傳播途徑、臨床癥狀、起源地區(qū)等確定BDV 感染的方法是不可行的；可以通過BDV 與其他病毒株的遺傳和抗原相關(guān)性以及原始宿主對其進行鑒定［8-9］。 了解BDV 的病原學(xué)及流行病學(xué)特征有助于制定預(yù)防和控制BDV 感染的有效措施。 結(jié)合國內(nèi)外近期研究報道，從病原學(xué)、流行病學(xué)、診斷措施等方面對邊界病進行綜述， 以期為該病的防控工作提供參考。

1 病原學(xué)

BDV 與牛病毒性腹瀉病毒1 型 （BVDV-1）、牛病毒性腹瀉病毒2 型 （BVDV-2）、 豬瘟病毒（classical swine fever virus，CSFV）同屬黃病毒科瘟病毒屬成員。 BDV 是一種球形、有囊膜的RNA 病毒（40～60 nm），基因組由單鏈正性RNA 組成，長度大約為12 300 個核苷酸；對脂類溶劑、紫外線、溫度敏感， 對乙醚中等敏感；56 ℃處理30 min 可被滅活，在有機溶劑和洗滌劑中被迅速滅活，在外界環(huán)境中可存活數(shù)周； 可通過50 nm 的濾膜［10］。BDV 基因組包括5′和3′末端2 個非翻譯區(qū)（UTR）和1 個開放閱讀框（ORF），編碼4 種結(jié)構(gòu)蛋白，即衣殼蛋白（C）和3 種包膜糖蛋白（Erns、E1和E2）， 以及7 種非結(jié)構(gòu)蛋白 （Npro、p7、NS2-3、NS4A、NS4B、NS5A 和NS5B）［11］。

5′-UTR 是BDV 基因組中的高度保守區(qū)域，非結(jié)構(gòu)蛋白Npro 的基因編碼N 末端蛋白酶，E2蛋白在病毒附著和進入宿主細胞過程中起主要作用，可以誘導(dǎo)機體產(chǎn)生特異性中和抗體，抵抗BDV的感染。 通過比較5′-UTR、Npro 和E2 的基因序列對BDV 分離株進行分類，從而進行系統(tǒng)進化分析。 BDV 在系統(tǒng)發(fā)育上至少有8 個基因型（見表1）。 在GenBank 上有15 個完整的BDV 基因組序列（除BDV-6 外），全基因組序列比對顯示，在核苷酸和氨基酸序列水平上， 種內(nèi)相似性分別為72.9%～74.1%和78.6%～82.7%。

表1 BDV 各基因型及其分離的最初宿主

與BVDV 類似，根據(jù)BDV 對易感組織培養(yǎng)物的影響， 可分為2 種生物型： 致細胞病變型（cytopathogenic，CP） 和非致細胞病變型 （non-cytopathogenic，NCP）。 前者可導(dǎo)致受感染細胞空泡化和溶解，形成病毒蝕斑；后者不會導(dǎo)致可見的感染跡象［30］。 NCP 生物型比CP 生物型更容易分離，NCP 可在細胞培養(yǎng)中建立持續(xù)感染。 NCP 型的BDV 對于誘發(fā)致命的黏膜病變（壞死性化膿性炎癥）至關(guān)重要，該種病變常見于綿羊［3，31］；CP 型的BDV 感染多見于山羊。

2 流行病學(xué)

2.1 易感動物及傳播途徑

綿羊是BDV 的自然宿主，山羊和某些反芻動物也可以感染邊界病。 家養(yǎng)和野生動物存在種間傳播， 邊界病表現(xiàn)出較低的宿主特異性和廣泛的宿主范圍［7-8］。 病羊、持續(xù)性感染的羔羊以及帶毒動物是該病的主要傳染源， 持續(xù)性感染的羔羊是最重要的傳染源；BDV 存在于流產(chǎn)的胎兒、羊水和持續(xù)感染動物的排泄物及分泌物中，因此，動物通過污染物感染該病。 邊界病的傳播途徑包括垂直傳播和水平傳播，BDV 通過胎盤感染胎兒，導(dǎo)致母羊流產(chǎn)、胎兒死亡，甚至產(chǎn)生持續(xù)感染；持續(xù)感染動物無癥狀，幾乎總是血清陰性，并不斷通過分泌物和排泄物向環(huán)境中排泄病毒， 加速了該病的水平傳播。

2.2 邊界病的流行情況

BDV 呈全球性流行， 在歐洲和亞洲國家都有報道，包括法國、德國、意大利、荷蘭、西班牙、印度、日本、中國等。 對分離自不同區(qū)域的BDV 分離株進行抗原和基因分類， 對于提高邊界病流行病學(xué)的認識至關(guān)重要。 表2 列出了不同基因型BDV在各國的分布情況。 BDV-1、BDV-2 最初分別被稱為BDV-A 和BDV-B， 由德國分離株組成［32］；BDV-3 和BDV-1 是歐洲最流行的基因型，BDV-1在世界范圍內(nèi)流行；BDV-4 在西班牙占主導(dǎo)地位［33］；BDV-5 和BDV-6 首次在法國報道［34］；BDV-7 最初在意大利發(fā)現(xiàn)， 且該基因型目前僅在意大利檢測到［25］；BDV-8 由Caruso 等［26］和Peletto 等［27］分別從意大利的一只羚羊和一只山羊羔羊上分離，隨后Peterhans 等［28］和Stalder 等［29］分別從瑞士的牛、羊和豬上檢測到該基因型的毒株。

表2 不同基因型BDV 在各國的分布情況

2.2.1 邊界病在國外的流行

1959 年，Hughes［1］首先報道了該病。 1984 年，從法國Aveyron 地區(qū)的綿羊中分離出一株BDV 毒株，該毒株使成年羊和羔羊患病，死亡率高；據(jù)調(diào)查在法國阿爾卑斯山脈野生動物群中瘟病毒的血清陽性率為41%，流行毒株多為BDV-4［43-44］。1997年，在西班牙東北部的羔羊中暴發(fā)了邊界病，特點是死亡率高，臨床癥狀與Aveyron 病相似［22］。 2001年，西班牙比利牛斯山脈中部和東部的羚羊發(fā)生了致命的邊界病疫情，導(dǎo)致羚羊數(shù)量急劇減少（超過80%），威脅到該物種的生存，引起各國關(guān)注［45-46］。2011 年，日本首次對小型反芻動物進行了邊界病流行病學(xué)調(diào)查， 將綿羊血清使用中和過氧化物酶連接抗體檢測BDV 抗體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，日本北部地區(qū)BDV 血清陽性率為17.6%，大多表現(xiàn)為持續(xù)性感染，結(jié)果具有特異性，不包括與BVDV 的交叉反應(yīng)［35］。 2009 年，Gur［47］對綿羊和山羊進行邊界病調(diào)查， 發(fā)現(xiàn)瘟病毒血清學(xué)陽性率為3.0%～78.5%，分離的生物型包括CP 型和NCP 型。Hasbi 等［15］使用RT-PCR 技術(shù)在2013—2014 年采集的40 份野豬樣本中檢測到BDV-1，這也是土耳其學(xué)者首次在該國野豬體內(nèi)檢測到BDV。

2.2.2 邊界病在我國的流行

在我國安徽省、江蘇省、山東省、青海省等地的羊群中均發(fā)現(xiàn)有BDV 感染，并且調(diào)查發(fā)現(xiàn)在青海省羊群中存在BDV 和BVDV 混合感染。 2012年，李文良等［48］首次在安徽省和江蘇省的腹瀉羊中檢測到BDV。 2013 年，劉霞等［42］對華東地區(qū)某羊場綿羊血液樣品進行邊界病感染情況調(diào)查，發(fā)現(xiàn)1 只綿羊血清樣品為陽性； 通過病毒全基因組測序和遺傳進化分析，證實該毒株屬于BDV-3 亞型，這是繼國內(nèi)山羊中發(fā)現(xiàn)BDV 感染后，首次在綿羊群中發(fā)現(xiàn)BDV 感染。 2014 年，彭程等［49］從采集自山東省外觀健康羊群的257 份鼻拭子樣品中，檢測到1 份樣品含有BDV，這是首次在山東省羊群中檢測出BDV， 推測該病可能來自活羊的跨省傳播。 2017 年，陳云政等［50］采用RT-PCR 方法對青海省的健康羊血清樣品（161 份）和腹瀉羊的組織樣品（34 份）進行BDV 和BVDV 核酸檢測，發(fā)現(xiàn)檢測樣品中存在BDV 或BVDV 單獨感染以及二者混合感染，個別養(yǎng)殖場（戶）的羊群感染嚴重； 健康羊血清樣品BDV 的總體陽性率為11.8%，BVDV 的總體陽性率為26.71%；腹瀉羊組織樣品BDV 的總體陽性率為26.47%，BVDV 的總體陽性率高達44.12%；該研究證實青海省羊群中存在BVD 和BD 混合感染。

3 診斷方法

由于BDV 和CSFV、BVDV 感染有類似的臨床癥狀， 而瘟病毒屬病毒之間又存在血清交叉反應(yīng)， 邊界病的診斷通常采用臨床診斷與多種檢測技術(shù)結(jié)合的方式。

3.1 臨床癥狀與組織病變

邊界病的典型癥狀是母羊的繁殖性疾病癥狀（流產(chǎn)、 產(chǎn)弱羔）， 以及羔羊的神經(jīng)系統(tǒng)疾病癥狀（骨骼肌震顫）。 神經(jīng)癥狀主要是由中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)纖維的髓鞘缺陷導(dǎo)致的。 綿羊的產(chǎn)后感染往往是輕微的，特點是輕度發(fā)熱和短暫的淋巴痛，然后是血清轉(zhuǎn)化［2］。在綿羊的急性BDV 感染中，偶爾會出現(xiàn)高死亡率［44］。 如果感染發(fā)生在妊娠期的前2 個月（即胎兒具有免疫能力之前），如果胎兒存活下來， 則新生兒將是一只PI 動物， 特征是對BDV 具有特異性免疫耐受性，缺乏抗體，在整個生命周期內(nèi)持續(xù)排毒。 BDV 的PI 動物可能外觀正常， 但通常生長不良， 有骨硬化或骨質(zhì)疏松樣病變，預(yù)期壽命較低［6］。 若感染母羊流產(chǎn)，則胎盤出現(xiàn)局灶性、壞死性炎癥。

3.2 實驗室診斷

邊界病的實驗室診斷主要包括病原的分離鑒定、核酸檢測以及血清學(xué)檢測技術(shù)，病原的分離鑒定是診斷該病的“金標準”。

3.2.1 病原的分離

將疑似病例的血清或經(jīng)研磨處理的疑似病料在MDBK 細胞上培養(yǎng)， 觀察細胞病變。 該方法適用于CP 生物型BDV，對于NCP 生物型BDV 還需結(jié)合RT-PCR 方法對培養(yǎng)物進行病毒鑒定。 該方法費時耗力，不適合大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查。

在難以分離獲得病毒的情況下， 可以用干擾試驗證明BDV 的存在。BDV 在原代犢牛睪丸細胞上可以干擾BVDV 的生長， 而且該種干擾作用可以被特異性抗血清中和。

3.2.2 血清學(xué)診斷技術(shù)

3.2.2.1 病毒中和試驗（VNT）

由于BDV 感染過程復(fù)雜，且存在PI 情況，被感染牲畜表現(xiàn)為免疫耐受和體內(nèi)抗體滴度低，病毒中和試驗特異性強，可以利用VNT 法檢測BDV抗體。但是該方法操作復(fù)雜且檢測周期長，不適合大批量樣品的檢測。

3.2.2.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）和交叉血清中和試驗（SNT）

ELISA 操作簡單，在大批量流行病學(xué)調(diào)查時，優(yōu)勢突出。 2011 年，土耳其學(xué)者Mehmet T 等［51］使用ELISA 法， 對隨機采集的465 份綿羊血液樣本進行了分析， 以確定是否存在瘟病毒（BVDV、BDV）抗體；據(jù)估計，樣本動物和樣本城鎮(zhèn)的瘟病毒血清流行率分別為75.9%和60.0%～82.5%。 由于瘟病毒的血清學(xué)交叉反應(yīng)特性，ELISA 對BDV的血清學(xué)檢測不能區(qū)分BVDV 和BDV 感染。 SNT法可以區(qū)分BVDV 和BDV 的感染， 通過Logistic回歸分析，識別物種間傳播的潛在風(fēng)險因素。2017年，瑞士學(xué)者Kaiser 等［6］應(yīng)用SNT 法對3 種瘟病毒 （BVDV-1a、BVDV-1h 和BDSwiss-a 亞型的毒株） 進行流行病學(xué)分析， 以充分區(qū)分BVDV 和BDV。 該研究首次確定了瑞士血清陽性牛的BDV血清流行率； 通過對畜主和對照農(nóng)場進行問卷調(diào)查，收集流行病學(xué)信息，結(jié)合Logistic 回歸分析，確定牛和羊的共同生存空間是牛感染BDV 最重要的風(fēng)險因素。

3.2.3 病原學(xué)檢測

目前常用RT-PCR 技術(shù)檢測血液或者組織中的BDV。 以5′-UTR 基因或者Npro 基因為檢測靶標，根據(jù)BDV 基因組序列設(shè)計特異性引物，可檢測病變組織或者血清中的BDV。 2011 年，Toplu 等［52］使用RT-PCR 技術(shù)在自然感染的羔羊中檢測出BDV。 2012 年，西班牙學(xué)者Fernández-Sirera 等［53］應(yīng)用RT-PCR 技術(shù)在羚羊中檢測到BDV， 同時，對4 株BDV 毒株和1 株BVDV 毒株，應(yīng)用病毒中和試驗進行檢測，結(jié)果表明所有羚羊有BDV 特異性抗體。

4 防控措施

目前，尚無有效的BDV 疫苗。 盡管美國及一些歐洲國家，已經(jīng)生產(chǎn)出了滅活全病毒疫苗，但仍未上市［54］。 使用BVDV 疫苗進行免疫，對BDV 的保護效果不佳（在短時間內(nèi)有部分保護作用，但是接種疫苗2 個月后血清抗體呈陰性）。雖然這兩種病毒在抗原上相關(guān)， 但并不能提供充分的交叉保護［55］，因此，對于邊界病主要采取綜合防控措施。一是，要盡早診斷，及時淘汰病畜，清除PI 動物，切斷畜群中潛在的傳染源，并對飼養(yǎng)環(huán)境消毒；二是，加強口岸檢疫，禁止從有邊界病流行的國家或地區(qū)引入種畜；三是，養(yǎng)殖戶要做好防范，防止該病在野生動物和家畜之間傳播。

5 小結(jié)

迄今為止，至少有8 個基因型的BDV 在世界范圍內(nèi)傳播。 BDV 基因組中的基因變化可以改變毒力，新的綿羊瘟病毒也可能會出現(xiàn)，從而影響該病的流行病學(xué)。 在畜牧業(yè)發(fā)達的國家了解邊界病的流行病學(xué)特征十分必要。

對我國來說，邊界病是一種外來動物疫病，養(yǎng)殖戶對其了解較少，危害性可能被低估。BDV 引起母羊繁殖障礙，產(chǎn)下PI 羔羊，不利于養(yǎng)羊業(yè)的健康發(fā)展。 由于BDV 在抗原和基因上與BVDV 及CSFV 相關(guān)， 可能對牛構(gòu)成重大風(fēng)險， 影響牛場BVDV 凈化。 同樣，豬群中存在BDV，可能會導(dǎo)致CSFV 診斷的不確定性，因此，應(yīng)該對BDV 引起足夠重視，了解其流行特征，及時、準確作出診斷，淘汰感染羊只，做好綜合防控措施。