何軼群，黃文輝，李 娟，趙玲莉，張 翔，楊世聞

青海大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，青海西寧 810001

近年來耐碳青霉烯類腸桿菌科細(xì)菌(CRE)引起的院內(nèi)和社區(qū)感染越來越多，其病死率也越來越高。CRE引起的感染在臨床治療上不僅不好治愈而且病死率較高[1-2]。CRE可通過患者與患者、患者與醫(yī)護(hù)人員之間進(jìn)行相互傳播，不僅嚴(yán)重威脅患者的生命健康，而且造成醫(yī)療資源的浪費(fèi)和患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)的加重。及時(shí)對(duì)院內(nèi)CRE進(jìn)行同源性分析，是判斷其是否存在院內(nèi)感染及確定傳染源的關(guān)鍵。目前用于細(xì)菌同源性分析的方法多采用多位點(diǎn)序列分型(MLST)方法。MLST的優(yōu)點(diǎn)是重復(fù)性好，分辨力高，易于標(biāo)準(zhǔn)化，并可直接進(jìn)行分析[3-4]，缺點(diǎn)是要提前知道待測(cè)菌株基因組序列，并查詢?cè)摼晗鄬?duì)應(yīng)的管家基因。此外檢測(cè)的高額費(fèi)用和所需特定的儀器使得MLST只能局限在大型的流行病學(xué)研究中心，不適用于醫(yī)院等中小范圍的流行病學(xué)分析。基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)是近年來快速發(fā)展起來的一種新型微生物鑒定技術(shù)，自2010年質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)入國內(nèi)后得到了飛速發(fā)展[5-8]。MALDI-TOF MS主要是分析比較細(xì)菌的蛋白質(zhì)指紋圖譜，其最大特點(diǎn)是快速、簡單、方便，可在幾分鐘內(nèi)完成病原菌的同源性分析[9-10]。本研究通過對(duì)青海大學(xué)附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科分離的5株碳青霉烯耐藥的肺炎克雷伯菌，以及同期其他科室分離的6株碳青霉烯敏感的肺炎克雷伯菌進(jìn)行MALDI-TOF MS和MLST同源性分析，通過比較評(píng)價(jià)MALDI-TOF MS在高原地區(qū)用于CRE同源性分析的能力，從而為高原地區(qū)醫(yī)院感控工作提供一種快速、便捷、經(jīng)濟(jì)的同源性分析方法。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1標(biāo)本來源 收集青海大學(xué)附屬醫(yī)院2020年1月分離的肺炎克雷伯菌，其中5株碳青霉烯耐藥的肺炎克雷伯菌來自重癥醫(yī)學(xué)科，碳青霉烯耐藥的肺炎克雷伯菌采用金山川免疫顯色表型檢測(cè)卡進(jìn)行確認(rèn)，經(jīng)確認(rèn)均為KPC酶型的CRE，6株碳青霉烯敏感的肺炎克雷伯菌來自其他科室。肺炎克雷伯菌ATCC10031由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2培養(yǎng)基 實(shí)驗(yàn)所用的血瓊脂平板來自賽默飛世爾生物化學(xué)制品(北京)公司有限公司。

1.2儀器與試劑 甲酸、HCCA基質(zhì)、三氟乙酸、乙腈購于德國布魯克公司，PCR實(shí)驗(yàn)所需試劑全部購于上海生工生物工程有限公司。MALDI-TOF MS(德國布魯克)，PCR擴(kuò)增儀(美國Bio-rad)，ViteK 2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定藥敏系統(tǒng)(法國梅里埃)，凝膠成像儀(美國Bio-rad)，電泳儀(北京六一)。

1.3方法

1.3.1MLST 將保存于-20 ℃冰箱的菌株凍存管中的待測(cè)肺炎克雷伯菌轉(zhuǎn)種于血瓊脂平板上，35 ℃培養(yǎng)24 h后備用。采用煮沸法提取細(xì)菌基因組，具體步驟：無菌挑取備用菌株于400 μL的無菌蒸餾水中煮沸10 min，13 000 r/min離心5 min，取上清液做細(xì)菌模板DNA。肺炎克雷伯菌7對(duì)管家基因gapA、infB、mdh、pgi、phoE、rpoB和tonB，參考MLST網(wǎng)址https://bigsdb.pasteur.fr/klebsiella/primers_used.html中提供的方法進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增序列上傳MLST網(wǎng)站進(jìn)行比對(duì)，得到相應(yīng)的細(xì)菌ST型，具體引物長度、退火溫度和PCR產(chǎn)物擴(kuò)增長度見表1。

表1 肺炎克雷伯菌7對(duì)管家基因序列

1.3.2MALDI-TOF MS同源性分析 將保存于-20 ℃冰箱的菌株凍存管中的肺炎克雷伯菌轉(zhuǎn)種于血瓊脂平板上，35 ℃培養(yǎng)24 h后備用。采用甲酸提取法進(jìn)行菌株處理，用10 μL的一次性接種環(huán)挑取待測(cè)菌株于1.5 mL的小型離心管中，加入300 μL的去離子水，取待測(cè)菌株至小型離心管中，用移液槍反復(fù)吹打，加入900 μL的無水乙醇充分混勻，13 000 r/min離心2 min，用移液槍棄上清液，整個(gè)過程不應(yīng)觸碰沉淀。室溫下干燥沉淀2～3 min，向小型離心管中加入50 μL的70%的甲酸和50 μL的乙腈充分混勻后以13 000 r/min離心2 min，取1 μL的上清液于MALDI靶板上，晾干后再加1 μL的HCCA基質(zhì)晾干后備用。應(yīng)用MALDI-TOF MS軟件中的MALDI Biotyper RTC軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。通過MALDI-TOF MS中的flexAnalysis獲取蛋白峰信息采集，通過MALDI Biotyper 3軟件進(jìn)行聚類分析和主成分分析。

2 結(jié) 果

2.1MLST分析結(jié)果 分析顯示來自重癥醫(yī)學(xué)科的5株碳青霉烯耐藥的肺炎克雷伯菌均為ST11型，來自其他科室的6株碳青霉烯敏感的肺炎克雷伯菌中3株為ST147型，2株為ST340型，1株為ST1724型。

2.2MALDI-TOF MS同源性分析結(jié)果 應(yīng)用分析軟件MALDI Biotyper3 對(duì)11株肺炎克雷伯菌進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見圖1，聚類分析后發(fā)現(xiàn)MALDI-TOF MS將11株肺炎克雷伯菌分為兩大類，來自重癥醫(yī)學(xué)科的5株碳青霉烯耐藥的肺炎克雷伯菌被劃分為Ⅰ類，來自其他科室的6株肺炎克雷伯菌被劃分為Ⅱ類。5株碳青霉烯耐藥的肺炎克雷伯菌蛋白質(zhì)譜見圖2，可以看出來自重癥醫(yī)學(xué)科的5株碳青霉烯耐藥的肺炎克雷伯菌的蛋白峰大致一樣，并且和肺炎克雷伯菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC10031的某些蛋白峰有明顯差異。主成分三維散點(diǎn)分析見圖3，可以看出11株肺炎克雷伯菌處于兩個(gè)平面，其中1～5號(hào)為來自重癥醫(yī)學(xué)科的5株碳青霉烯耐藥的肺炎克雷伯菌，三維散點(diǎn)圖顯示均處于同一個(gè)平面且空間距離較近，來自其他科室的6株肺炎克雷伯菌處于其他平面，結(jié)果提示5株來自重癥醫(yī)學(xué)科的碳青霉烯耐藥的肺炎克雷伯菌空間較近，推斷親緣關(guān)系較近，可能為同一株來源。

注：1～5號(hào)為來自重癥醫(yī)學(xué)科的碳青霉烯耐藥的5株肺炎克雷伯菌，6～11號(hào)為來自其他科室的碳青霉烯敏感的6株肺炎克雷伯菌。圖1 11株肺炎克雷伯菌MALDI-MOF MS同源性分析圖

注：kpn1～kpn5為5株碳青霉烯耐藥的肺炎克雷伯菌，kpn6為肺炎克雷伯菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC10031。圖2 5株碳青霉烯耐藥的肺炎克雷伯菌和肺炎克雷伯菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC10031的蛋白質(zhì)譜圖

注：1～5號(hào)為來自重癥醫(yī)學(xué)科的碳青霉烯耐藥的5株肺炎克雷伯菌，6～11號(hào)為來自其他科室的6株肺炎克雷伯菌，PC1為第一主成分，PC2為第二主成分，PC3為第三主成分，Load1為載荷1，Load2為載荷2，Load3為載荷3。圖3 11株肺炎克雷伯菌的主成分三維散點(diǎn)圖

3 討 論

目前高原地區(qū)應(yīng)用MALDI-TOF MS技術(shù)進(jìn)行CRE同源性分析的研究報(bào)道較少。本研究采用MLST和MALDI-TOF MS技術(shù)對(duì)待測(cè)菌株進(jìn)行同源性分析。MLST分析結(jié)果顯示，5株碳青霉烯耐藥的肺炎克雷伯菌均為ST11型，6株碳青霉烯敏感的肺炎克雷伯菌中3株為ST147型，2株為ST340型，1株為ST1724型。MALDI-TOF MS將11株肺炎克雷伯菌分為兩大類，其中來自重癥醫(yī)學(xué)科的5株為Ⅰ類，來自其他科室的6株為Ⅱ類，兩種方法在同源性分析方面的結(jié)果基本一致。來自重癥醫(yī)學(xué)科的5株碳青霉烯耐藥的肺炎克雷伯菌中，其中3株來自不同患者的肺泡灌洗液，1株來自患者所處環(huán)境，1株來自呼吸機(jī)，同源性分析將其歸為同一類，提示可能是由于院內(nèi)消毒不徹底引起的院內(nèi)暴發(fā)，后期的流行病學(xué)調(diào)查也提示為院內(nèi)感染。通過后期詢問臨床得知，3例患者中2例死亡，1例患者病情嚴(yán)重家屬放棄治療后自動(dòng)出院，這也提示在今后的工作中要重視CRE引起的院內(nèi)交叉感染。

CRE引起的院內(nèi)感染暴發(fā)在國內(nèi)外已有很多報(bào)道，快速對(duì)CRE進(jìn)行同源性分析是控制CRE院內(nèi)感控的重要手段。李冬菊等[11]應(yīng)用MALDI-TOF MS技術(shù)對(duì)重癥ICU病房的懷疑院內(nèi)感染暴發(fā)的7株肺炎克雷伯菌進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MALDI-TOF MS技術(shù)在同源性分析方面可以和MLST分型相媲美，這也和本研究結(jié)果一致。國外有學(xué)者通過大量的研究得出MALDI-TOF MS在病原菌同源性分析方面的準(zhǔn)確度與MLST相類似[12-14]。但是應(yīng)用MLST進(jìn)行同源性分析需要高額費(fèi)用和特定儀器，以及進(jìn)行PCR擴(kuò)增后外送測(cè)序，使其只能局限在大型的流行病學(xué)研究中心，不適用于醫(yī)院中小范圍及高原地區(qū)進(jìn)行同源性和流行病學(xué)分析。

雖然本研究發(fā)現(xiàn)在高原地區(qū)MALDI-TOF MS在同源性研究方面和MLST分型結(jié)果一致，但徐建民等[15]應(yīng)用MALDI-TOF MS技術(shù)分析95株肺炎克雷伯菌后得出，該方法雖然能比較直觀清晰的分析細(xì)菌的同源性，但是其廣泛應(yīng)用于臨床菌株同源性分析方面還需要更深入的實(shí)驗(yàn)研究。MALDI-TOF MS主要是通過分析細(xì)菌蛋白質(zhì)表達(dá)的特征峰，而菌體蛋白表達(dá)可能會(huì)受到溫度、海拔、培養(yǎng)條件等影響，導(dǎo)致兩種方法在同源性分析方面還有差距。

全國細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)數(shù)據(jù)顯示，我國CRE檢出率逐年呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，其引起的病死率也在逐年增加[1]。GUDUCUOGLU等[16]對(duì)某大學(xué)醫(yī)院兩個(gè)重癥ICU病房8例患者連續(xù)分離出的9株耐碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的肺炎克雷伯菌進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)5例患者平均于12 d內(nèi)因感染死亡，病死率高達(dá)62.5%。CRE引起的感染因治療手段有限，在治療上不僅難治而且病死率高，只能采取隔離和消毒等措施[17-20]。青藏高原地區(qū)處我國西北，經(jīng)濟(jì)和醫(yī)療條件相對(duì)落后，一旦發(fā)生院內(nèi)CRE感染其后果相對(duì)嚴(yán)重，故對(duì)高原地區(qū)疑似發(fā)生院內(nèi)感染暴發(fā)的CRE快速進(jìn)行同源性分析，可為院內(nèi)CRE感控提供數(shù)據(jù)支持。MALDI-TOF MS因其快速、方便、經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn)，故在同源性分析方面有一定的潛力，尤其對(duì)筆者所在的高原地區(qū)的醫(yī)院有一定的應(yīng)用推廣價(jià)值，但需要在今后的研究中加大菌株數(shù)量及不同菌種之間的比較，從而更好更快地為院內(nèi)感控工作服務(wù)。