飼料中添加橢圓柵藻對(duì)異育銀鯽中科5號(hào)越冬后抗病力的影響

許文婕 夏 雨, 朱曉鳴 韓 冬 劉昊昆 楊云霞 解綬啟, , 高 宏 金俊琰

(1. 中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所淡水生態(tài)與生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430072; 2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué), 北京 100049;3. 中國(guó)科學(xué)院種子創(chuàng)新研究院, 北京 100101)

越冬期是魚類養(yǎng)殖階段中的一個(gè)關(guān)鍵時(shí)期[1],低溫和食物缺乏等脅迫會(huì)造成魚類代謝紊亂和免疫力下降。在越冬期間, 大口黑鱸(Micropterus salmoides)體重降低[2]。南亞野鯪(Labeo rohita)的非特異性免疫指標(biāo)隨著季節(jié)變化而變化, 且血漿髓過氧化物酶(MPO)活力在冬季顯著低于其他季節(jié)[3]。低溫和饑餓會(huì)抑制黃姑魚(Nibea albiflora)生長(zhǎng)并且導(dǎo)致肝臟抗氧化酶基因表達(dá)下調(diào), 抗氧化相關(guān)酶活力下降, 影響其肝臟功能和免疫功能[4]。隨著越冬期結(jié)束, 水溫逐漸升高, 魚體易受到致病菌的侵入最終導(dǎo)致死亡[4,5], 給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失[6]。因此, 探究魚類在越冬期間的生理狀態(tài)特別是抗病力具有重要的意義, 可為提高養(yǎng)殖魚類越冬期存活率提供一定的理論依據(jù)。

藻類富含藻藍(lán)蛋白、藻多糖和β胡蘿卜素等物質(zhì), 有提高魚類免疫力的作用[7—9]。 在飼料中添加螺旋藻可以提高異育銀鯽中科3號(hào)的超氧化物歧化酶(SOD)、溶菌酶(LZM)、堿性磷酸酶(AKP)、總抗氧化能力(T-AOC)和白細(xì)胞吞噬活性[10]。金頭鯛(Sparus aurataL.)攝食添加微綠球藻(Nannochloropsis gaditana)或四爿藻(Tetraselmis chuii)飼料后血清天然溶血性補(bǔ)體活性顯著增強(qiáng)[11]。在機(jī)體感染病菌后, Toll樣受體(TLR)信號(hào)通路在非特異性免疫過程中起重要作用, TLR信號(hào)通路主要分為髓樣分化因子88(MyD88)依賴性和MyD88非依賴性通路[12]。MyD88和包含Toll/白介素1的接頭蛋白(TIRAP)是MyD88依賴性通路中重要的適配器蛋白, 包含TIR結(jié)構(gòu)域的IFN誘導(dǎo)連接蛋白(TRIF)是MyD88非依賴性通路中重要的適配器蛋白[13]。促炎因子白介素1β(IL1β)和腫瘤壞死因子α1(TNFα1)等在非特異性免疫中起重要作用[14,15]?？寡滓蜃尤甾D(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGFβ)和白介素10(IL10)等, 主要起到抑制炎癥反應(yīng)的過度激活的作用[16,17]。已有研究報(bào)道異育銀鯽中科3號(hào)攝食螺旋藻后脾臟中Toll樣受體(TLR)信號(hào)通路相關(guān)基因包括TLR2、MyD88、TIRAP、IL1β、TNFα等表達(dá)量顯著高于對(duì)照組, 因此螺旋藻粉可以通過TLR信號(hào)通路的介導(dǎo)和參與, 最終提高異育銀鯽中科3號(hào)的免疫力[10]。

異育銀鯽(Carassius gibelio)是中國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)性魚類之一, 2019年全國(guó)養(yǎng)殖產(chǎn)量近300萬噸[18]。異育銀鯽中科5號(hào)是利用銀鯽獨(dú)特的異精雌核生殖,以生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)和隆背性狀為選育指標(biāo), 培育出整入了團(tuán)頭魴分子模塊的子代, 對(duì)皰疹病毒具有較強(qiáng)抗性和耐受性, 并且肌間骨數(shù)量顯著低于中科3號(hào), 在2018年被國(guó)家原良種委員會(huì)鑒定認(rèn)可為水產(chǎn)養(yǎng)殖新品種[19—22]。異育銀鯽作為大宗淡水魚, 在越冬期間面臨低溫的脅迫。嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)是異育銀鯽養(yǎng)殖過程中常見的致病菌,會(huì)造成敗血癥甚至最終導(dǎo)致死亡[23]。橢圓柵藻(Scenedesmus ovalternusHSJ296)富含α-亞麻酸和其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[24], 并且可以提高越冬期異育銀鯽中科3號(hào)的抗病力[25]。已有研究表明異育銀鯽中科3號(hào)和中科5號(hào)在免疫力等方面有顯著性差異[26]。因此,本研究的目的是探究在飼料中添加橢圓柵藻是否可以提高越冬期異育銀鯽中科5號(hào)的免疫力和抗病力。在異育銀鯽中科5號(hào)越冬前期投喂基礎(chǔ)飼料或者添加4%橢圓柵藻的飼料, 并在越冬結(jié)束后用嗜水氣單胞菌進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn), 測(cè)定其生長(zhǎng)、免疫力和抗病力等指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)飼料

基于實(shí)驗(yàn)室前期的研究結(jié)果, 在飼料中添加3.38%的螺旋藻可有效提高異育銀鯽的生長(zhǎng)性能和免疫力[10]。因此, 本實(shí)驗(yàn)配置兩種等氮(32%)等脂(10%)的實(shí)驗(yàn)飼料, 分別含有0(DS0)或者4%(DS4)橢圓柵藻(Scenedesmus ovalternusHSJ296), 飼料配方如表 1所示。橢圓柵藻的發(fā)酵采用基礎(chǔ)培養(yǎng)基(FeSO4·7H2O, 3 mg/L; K2HPO4, 0.3 g/L; MgSO4·7H2O, 0.3 g/L; KH2PO4, 0.7 g/L; 甘氨酸, 0.1 g/L; 維生素B1, 0.01 mg/L; 維生素A5, 1 mL/L), 氮源為2 g/L KNO3, 碳源為20 g/L葡萄糖。柵藻粉主要營(yíng)養(yǎng)成分含量(干重): 蛋白質(zhì)10.16%、脂肪7.10%、水分6.82%和灰分3.88%。所有原料過40目篩后充分混勻, 加水?dāng)嚢韬笥弥屏C(jī)(SLR-150, 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)院漁業(yè)機(jī)械研究所)制粒, 70℃烘烤后4℃保存。

表1 飼料配方和化學(xué)組成(g/kg干重)Tab. 1 Ingredients and proximate composition of the experimental diets

1.2 實(shí)驗(yàn)魚和實(shí)驗(yàn)管理

異育銀鯽中科5號(hào)來自于中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所官橋漁場(chǎng), 首先將實(shí)驗(yàn)魚轉(zhuǎn)移進(jìn)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中,飼喂2周以適應(yīng)養(yǎng)殖環(huán)境。實(shí)驗(yàn)開始前, 將實(shí)驗(yàn)魚饑餓24h, 挑選規(guī)格均勻且健康的個(gè)體進(jìn)行養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)2個(gè)處理組, 每組3個(gè)平行, 隨機(jī)選取25尾規(guī)格均勻且健康的實(shí)驗(yàn)魚[初重(109.24±0.23) g]稱重后放入每個(gè)水族缸中。投喂實(shí)驗(yàn)持續(xù)4周, 每天兩次飽食投喂(9:00和15:00)。實(shí)驗(yàn)期間水溫變化情況見圖 1, 水體氨氮含量維持在＜0.1 mg/L, 溶氧＞6 mg/L, 余氯＜0.01 mg/L, 光照周期為12L∶12D(8:00—20:00光亮)。投喂實(shí)驗(yàn)周期為2017年12月30日至2018年1月26日, 在投喂實(shí)驗(yàn)結(jié)束后(2018年1月26日)所有處理組停止投喂至越冬期結(jié)束(2018年3月16日), 越冬期結(jié)束后對(duì)實(shí)驗(yàn)魚進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)。

圖1 實(shí)驗(yàn)期間水溫變化情況Fig. 1 Water temperatures during the experiment

1.3 攻毒實(shí)驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)使用嗜水氣單胞菌進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn), 首先將嗜水氣單胞菌接種到腦心浸液肉湯(BHI)固體培養(yǎng)基中復(fù)蘇生長(zhǎng)后, 挑選單克隆接種到BHI液體培養(yǎng)基中于30℃下培養(yǎng)6h, 然后離心(3500×g, 10min)收集沉淀物, 用PBS沖洗3次后獲得攻毒實(shí)驗(yàn)菌種。在正式實(shí)驗(yàn)之前, 先進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn), 確定本實(shí)驗(yàn)異育銀鯽7d半致死嗜水氣單胞菌濃度為1×109CFU/mL。

在越冬結(jié)束后, 每缸選取15尾異育銀鯽通過腹腔注射嗜水氣單胞菌(2.8×109CFU/mL, 0.2 mL/100g魚體重)進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn), 其中2尾魚取樣, 13尾魚用于統(tǒng)計(jì)攻毒后異育銀鯽的累計(jì)存活率, 計(jì)算公式如下:

存活率(%)=(存活魚總數(shù)/起始魚總數(shù))×100%

1.4 樣品采集

在越冬期結(jié)束后, 使用麻醉劑MS-222(60 mg/L,Sigma, USA)將實(shí)驗(yàn)魚麻醉后稱總重, 同時(shí)每缸取2尾魚進(jìn)行樣品采集。注射嗜水氣單胞菌10h后, 每缸取2尾魚進(jìn)行樣品采集。用肝素鈉抗凝劑潤(rùn)過的注射器從實(shí)驗(yàn)魚尾部靜脈采血, 將血液在4℃下3000×g離心10min(Eppendorf 5417R, Germany)得到上清液為血漿, 保存于-80℃冰箱中用于后續(xù)分析。在采血后, 將實(shí)驗(yàn)魚解剖取頭腎組織于液氮中速凍, 隨后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱中保存, 用于總RNA 的提取。

1.5 樣品分析

血漿抗氧化和免疫指標(biāo)T-AOC、SOD、MPO、丙二醛(MDA)、免疫球蛋白M(IgM)和補(bǔ)體C3(C3)采用商品試劑盒進(jìn)行測(cè)試(南京建成生物工程研究所, 中國(guó)南京)。

使用TRIzol(Invitrogen, USA)提取頭腎組織的總RNA, 并通過1%瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop 2000超微量分光光度計(jì)(Thermo Fisher Scientific,USA)檢測(cè)總RNA的完整性、濃度和質(zhì)量。使用MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶(Promega, USA)對(duì)RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,反轉(zhuǎn)錄體系20 μL。在羅氏 Light Cycle 480 II PCR儀(Roche, Germany)上進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量反應(yīng),測(cè)定目標(biāo)基因的表達(dá)量, 以β-actin為內(nèi)參基因[27],引物序列見表 2。實(shí)時(shí)熒光定量反應(yīng)體系為6 μL:2 μL cDNA, 3 μL LightCycle?480 SYBR?Green ⅠMaster(Roche, Switzerland), 0.24 μL Primer forward,0.24 μL Primer reverse, 0.52 μL PCR water。反應(yīng)條件為: 95℃, 5min; 45個(gè)循環(huán)的3步擴(kuò)增(95℃, 10s;56或60℃, 30s; 72℃, 30s)。目標(biāo)基因相對(duì)表達(dá)量計(jì)算公式如下:

表2 實(shí)時(shí)熒光定量引物Tab. 2 Primers used for qPCR

式中,E目標(biāo)基因?yàn)槟繕?biāo)基因的擴(kuò)增效率,E內(nèi)參基因?yàn)閮?nèi)參基因β-actin的擴(kuò)增效率,Ct為臨界循環(huán)數(shù)[28]。

1.6 數(shù)據(jù)分析

使用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 25.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析, 數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。首先對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)(Levene homogeneity of viarance test); 采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)(Independent-samplettest)比較對(duì)照組和柵藻組或者攻毒前和攻毒后數(shù)據(jù)的差異,P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 生長(zhǎng)結(jié)果和攻毒后存活率

在投喂實(shí)驗(yàn)期間, 對(duì)照組和柵藻組平均每尾魚的攝食總量分別為(10.98±0.48)和(10.56±0.16) g, 無顯著性差異。如圖 2所示, 異育銀鯽中科5號(hào)在飼喂4周后的體重與越冬初期體重?zé)o顯著性差異(P＞0.05), 但在越冬結(jié)束時(shí)體重顯著降低(P＜0.05)。對(duì)照組和柵藻組實(shí)驗(yàn)魚的體重在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)無顯著性差異(P＞0.05)。攻毒后累計(jì)存活率在兩組間無顯著性差異(圖 3;P＞0.05)。

圖2 異育銀鯽中科5號(hào)越冬期間體重變化Fig. 2 Body weight of gibel carp var. CAS Ⅴ during overwintering

圖3 異育銀鯽中科5號(hào)攻毒72h累計(jì)存活率Fig. 3 The cumulative survival rate of gibel carp var. CAS Ⅴchallenged with Aeromonas hydrophila infection for 72h

2.2 血漿抗氧化和免疫指標(biāo)

如圖 4所示, 在對(duì)照組中, 攻毒顯著降低了實(shí)驗(yàn)魚血漿SOD活力和MDA、C3、IgM的含量(P＜0.05); 在柵藻組中, 攻毒后MPO活力升高, 但是C3、IgM含量顯著降低(P＜0.05)。在攻毒前, 對(duì)照組的SOD的活力和IgM的含量顯著高于柵藻組(P＜0.05); 在攻毒后, 對(duì)照組T-AOC的活力高于柵藻組, 但是MDA的含量顯著低于柵藻組(P＜0.05)。

圖4 異育銀鯽中科5號(hào)在攻毒前和攻毒10h后血漿抗氧化和免疫指標(biāo)變化Fig. 4 Changes in plasma antioxidant and immunological indices of gibel carp var. CAS Ⅴ pre and 10h post bacterial challenge

2.3 免疫相關(guān)基因和細(xì)胞因子相關(guān)基因表達(dá)

異育銀鯽中科5號(hào)在攻毒前后頭腎中TLR通路相關(guān)基因表達(dá)變化見圖 5。在對(duì)照組中, 攻毒后頭腎中MyD88和IκBα基因表達(dá)量上調(diào)(P＜0.05); 柵藻組, 攻毒會(huì)引起TLR4、MyD88、TIRAP、TRIF和IκBα基因表達(dá)量上升(P＜0.05)。攻毒前, 各處理間基因表達(dá)量無顯著性差異(P＞0.05)。攻毒后, 柵藻組實(shí)驗(yàn)魚頭腎中MyD88基因表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)。

圖5 異育銀鯽中科5號(hào)在攻毒前和攻毒10h后頭腎中TLR通路相關(guān)基因表達(dá)Fig. 5 The expression of TLR signaling pathway-related genes in the head kidney of gibel carp var. CAS Ⅴ pre and 10h post bacterial challenge

如圖 6所示, 在攻毒后對(duì)照組實(shí)驗(yàn)魚頭腎中IL1β、TNFα1和IL10基因表達(dá)量上調(diào)(P＜0.05); 攻毒會(huì)引起柵藻組IL1β、TNFα1、IL10和TGFβ基因表達(dá)量上升(P＜0.05)。兩個(gè)處理間基因表達(dá)量在攻毒前無顯著性差異(P＞0.05)。在攻毒后, 攝食柵藻飼料的異育銀鯽中科5號(hào)頭腎中IL1β基因表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)。

圖6 異育銀鯽中科5號(hào)在攻毒前和攻毒10h后頭腎中細(xì)胞因子基因表達(dá)Fig. 6 Expression of cytokine genes in the head kidney of gibel carp var. CAS Ⅴ pre and 10h post bacterial challenge

3 討論

在本實(shí)驗(yàn)中, 生長(zhǎng)結(jié)果顯示越冬結(jié)束時(shí)實(shí)驗(yàn)魚體重顯著下降。已有文獻(xiàn)報(bào)道, 越冬會(huì)降低魚體重,主要是因?yàn)轲囸I和低溫脅迫造成的[2]。攝食對(duì)照飼料和柵藻飼料的中科5號(hào)攻毒后的累計(jì)存活率無顯著性差異。但是在異育銀鯽中科3號(hào)的研究結(jié)果表明柵藻可以提高實(shí)驗(yàn)魚在越冬后攻毒后累計(jì)存活率[25]。本實(shí)驗(yàn)選擇的研究對(duì)象是異育銀鯽中科5號(hào),已有文獻(xiàn)報(bào)道證明中科3號(hào)和中科5號(hào)在代謝和免疫等方面有顯著差異[26], 因此, 柵藻對(duì)越冬期不同品系異育銀鯽免疫力和抗病力的影響存在差異, 具體機(jī)制有待進(jìn)一步的分析。

3.1 飼料中添加橢圓柵藻對(duì)血漿抗氧化和免疫指標(biāo)的影響

血漿中抗氧化能力和細(xì)胞因子含量等被認(rèn)為是衡量魚類健康的重要指標(biāo)[29]。低溫會(huì)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生活性氧繼而激活抗氧化系統(tǒng)[4,30]。T-AOC和SOD可以清除代謝過程產(chǎn)生的自由基等物質(zhì), 而MDA是衡量魚體氧化應(yīng)激狀態(tài)和脂質(zhì)過氧化狀態(tài)的重要指標(biāo)[31—33]。本研究顯示, 攻毒前對(duì)照組SOD活力高于柵藻組, 攻毒后對(duì)照組T-AOC活力高于柵藻組, MDA含量低于柵藻組。因?yàn)榈蜏睾凸ザ緯?huì)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生自由基等有害物質(zhì), 進(jìn)而抗氧化酶活力會(huì)升高去清除自由基[4,30], 柵藻飼料可能具有保護(hù)作用, 因此自由基物質(zhì)產(chǎn)生量低于對(duì)照組,最終導(dǎo)致抗氧化酶活力較低。柵藻組的T-AOC活力、SOD活力和MDA含量在攻毒前后無顯著性差異, 可能是攝食柵藻飼料的中科5號(hào)抗氧化系統(tǒng)對(duì)嗜水氣單胞菌的響應(yīng)較對(duì)照組緩慢。攝食柵藻飼料的中科3號(hào)血漿SOD活力和MDA含量在攻毒后也沒有顯著變化[25]。

MPO在機(jī)體先天免疫防御中起重要作用, 是中性粒細(xì)胞活化的標(biāo)志, 并且會(huì)產(chǎn)生活性中間產(chǎn)物,具有強(qiáng)氧化性, 可以殺滅微生物[34,35]。在本研究中,MPO活力在不同飼料處理中無顯著性差異, 但是柵藻組在攻毒后MPO活力顯著升高?？共×?嗜水氣單胞菌)較強(qiáng)的南亞野鯪(Labeo rohita)品系MPO活力高于易感品系, 說明MPO可能在抵抗嗜水氣單胞菌過程中起重要作用[36]。盡管攝食柵藻飼料后并沒有提高中科5號(hào)攻毒后的存活率, 但是顯著增強(qiáng)的MPO活力表明柵藻一定程度提高了中科5號(hào)的免疫力。已有文獻(xiàn)報(bào)道, 魚類攝食含有類胡蘿卜素或者其他免疫增強(qiáng)劑可以增強(qiáng)MPO活力[37]。中科3號(hào)攝食柵藻飼料后血漿MPO活力同樣在攻毒后顯著升高, 并且高于對(duì)照組[25]。

補(bǔ)體系統(tǒng)在先天免疫系統(tǒng)中起重要的作用, 而補(bǔ)體C3是補(bǔ)體系統(tǒng)中重要的組成部分[38]。IgM是魚類調(diào)節(jié)獲得性免疫中關(guān)鍵的物質(zhì)[39], 已有研究報(bào)道急性和慢性的冷應(yīng)激都會(huì)造成肉雞IgM表達(dá)量的升高[40]。在投喂實(shí)驗(yàn)結(jié)束后, 實(shí)驗(yàn)魚保持饑餓狀態(tài)至越冬期結(jié)束, 越冬結(jié)束后(即攻毒前)對(duì)照組中科5號(hào)血漿IgM含量顯著高于柵藻組, IgM含量的升高可能是越冬期的低溫應(yīng)激造成的。因此, 柵藻可能在一定程度上緩解了冷應(yīng)激對(duì)魚體造成的影響。稀有鮈鯽(Gobiocypris rarus)在熒光假單胞菌攻毒后C3和IgM的含量顯著降低[41]。與攻毒前相比, 攻毒后中科5號(hào)血漿C3含量和IgM含量顯著降低, 可能與機(jī)體免疫力被抑制, 從而導(dǎo)致機(jī)體抵抗細(xì)菌感染的能力下降有關(guān)[42]。

3.2 飼料中添加橢圓柵藻對(duì)TLR通路相關(guān)基因表達(dá)的影響

TLR是魚類先天免疫中重要的組成部分, 特別在抵抗病原體的過程中起重要的作用。TLR2、TLR3和TLR4是Toll樣受體家族中主要的成員[43]。Toll樣受體家族識(shí)別病原體關(guān)聯(lián)分子, 并通過MyD88依賴性或者M(jìn)yD88非依賴性通路轉(zhuǎn)化為信號(hào)。TIRAP可以激活下游MyD88依賴性通路, 并且通過TLR2和TLR4調(diào)節(jié)MyD88依賴性通路[44]。TLR3和TLR4 通過TRIF激活MyD88非依賴性通路[45]。已有文獻(xiàn)報(bào)道, 細(xì)菌感染會(huì)顯著上調(diào)機(jī)體TLR信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá), 包括TLR2、TLR3、TLR4、MyD88、TIRAP和TRIF等基因[10,46]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示嗜水氣單胞菌攻毒后中科5號(hào)頭腎中MyD88基因表達(dá)顯著升高, 且柵藻組高于對(duì)照組。此外, 攝食柵藻飼料的中科5號(hào)的TLR4、TIRAP和TRIF基因表達(dá)也顯著升高, 而對(duì)照組中無顯著性變化。因此, 中科5號(hào)攝食柵藻后MyD88依賴性或者M(jìn)yD88非依賴性通路可能都被激活以抵御病菌的入侵。盡管本實(shí)驗(yàn)中兩個(gè)處理組的中科5號(hào)攻毒后累計(jì)存活率無顯著性差異, 但是前期的實(shí)驗(yàn)證明在飼料中添加螺旋藻可以部分通過增強(qiáng)TLR通路相關(guān)基因表達(dá)從而有效提高異育銀鯽3號(hào)存活率[10]。因此, 在飼料中添加?xùn)旁蹇赡茉谝欢ǔ潭壬咸岣咧锌?號(hào)越冬后的抗病力。NF-κB是調(diào)節(jié)先天性和特異性免疫應(yīng)答的主要轉(zhuǎn)錄因子, 在炎癥反應(yīng)過程中TLR信號(hào)通過激活核因子κB(NF-κB)的抑制蛋白從而調(diào)控NF-κB介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄[47]。在本實(shí)驗(yàn)中, 中科5號(hào)IκBα基因表達(dá)量在攻毒后顯著升高, 表明嗜水氣單胞菌會(huì)誘導(dǎo)異育銀鯽的炎癥反應(yīng), 與中科3號(hào)的研究結(jié)果趨勢(shì)相同[25]。

TLR信號(hào)通路的激發(fā)會(huì)誘導(dǎo)IL1β和TNFα1基因表達(dá)上調(diào)[48]。IL1β是一種促炎因子, 并且是機(jī)體應(yīng)對(duì)組織損傷、細(xì)菌感染等過程的關(guān)鍵物質(zhì)[14]。TNFα也是一種重要的促炎因子, 主要是通過激活內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行調(diào)節(jié)的[15]。在本實(shí)驗(yàn)中, 中科5號(hào)頭腎中IL1β和TNFα1基因表達(dá)在攻毒后顯著高于攻毒前, 前期的實(shí)驗(yàn)也有相似的結(jié)果[10]。同時(shí), 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示攝食柵藻飼料的中科5號(hào)在攻毒后IL1β表達(dá)量顯著高于對(duì)照組。已有研究證明, 一些飼料添加劑可以誘導(dǎo)IL1β基因表達(dá)。鯉攝食螺旋藻后IL1β基因表達(dá)量升高[49]; 在金頭鯛的飼料中添加β葡聚糖會(huì)誘導(dǎo)頭腎中IL1β的表達(dá)。因此, IL10和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGFβ是兩種重要的抗炎因子[16,17]。在本實(shí)驗(yàn)中, 攻毒后, 攝食不同飼料中科5號(hào)頭腎中IL10基因表達(dá)顯著升高, 但是僅有柵藻組TGFβ表達(dá)量上調(diào), 表明細(xì)菌感染會(huì)誘導(dǎo)頭腎中抗炎因子的表達(dá)且在柵藻組中抗炎因子TGFβ反應(yīng)更加靈敏。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示, 攻毒后促炎因子和抑炎因子基因表達(dá)量同時(shí)增加, 與大口黑鱸的研究結(jié)果一致[50]。因?yàn)樵诩?xì)菌侵入魚體后, 機(jī)體的免疫反應(yīng)處于一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡的過程, 細(xì)菌會(huì)引起機(jī)體的炎癥反應(yīng), 機(jī)體產(chǎn)生大量的促炎因子, 但是促炎因子也會(huì)通過增強(qiáng)凋亡和自噬等方式, 甚至促進(jìn)機(jī)體產(chǎn)生抑炎因子來消除細(xì)菌帶來的損傷[51]。

綜上所述, 飼料中添加?xùn)旁逶谝欢ǔ潭壬峡梢蕴岣咴蕉螽愑y鯽中科5號(hào)的抗病力, 這種調(diào)控可能是通過TLR通路來介導(dǎo)的。本研究為提高越冬后魚類免疫力和抗病力提供一定的數(shù)據(jù)支撐。