基于miR-34a/SIRT1 軸研究柚皮素對(duì)H2 O2 誘導(dǎo)的人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用

魏抗抗 ,董偉華 ,帖紅艷 ,何章彪 ,趙 琳

(1.商丘醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校五官科教研室,河南 商丘 476006；2.鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室,鄭州 450001)

年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration,AMD)是一種累進(jìn)性和變性性眼病,會(huì)影響視網(wǎng)膜的黃斑區(qū)域,是導(dǎo)致老年人嚴(yán)重和永久性視力障礙及失明的常見(jiàn)原因[1]。AMD 發(fā)生率較高,據(jù)估計(jì)全球范圍內(nèi)AMD 的人數(shù)到2040 年將增加到3 億[2],嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量,也給經(jīng)濟(jì)造成沉重負(fù)擔(dān)。AMD 的主要表現(xiàn)為視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(retinal pigment epithelial cells,RPE)對(duì)視細(xì)胞外節(jié)盤(pán)膜吞噬消化能力降低,導(dǎo)致未被完全消化的盤(pán)膜殘余小體存在,形成玻璃膜疣,從而導(dǎo)致視力受損甚至失明[3]。雖然AMD 的發(fā)病機(jī)制尚未完全了解,但RPE 功能障礙在AMD 的進(jìn)展中發(fā)揮中心作用[4-6]。

據(jù)報(bào)道,miR-34a 在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、遷移、分化和凋亡中至關(guān)重要,可抑制RPE 細(xì)胞的增殖和遷移[7]；miR-34a 的調(diào)節(jié)功能與年齡相關(guān)性疾病(包括AMD)中的沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silence information regulator 1,SIRT1)有關(guān),研究顯示miR-34a 的顯著上調(diào),可導(dǎo)致細(xì)胞中SIRT1 表達(dá)降低,使ARPE-19細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的耐受性降低[8]。氧化應(yīng)激在AMD 的發(fā)展進(jìn)程中起關(guān)鍵作用,抗氧化系統(tǒng)組分活性與AMD 的嚴(yán)重程度有關(guān),補(bǔ)充抗氧化劑可以保護(hù)RPE 免受氧化應(yīng)激損傷,可預(yù)防或治療AMD[9]。柚皮素是一類黃酮類化合物,在柑橘類物種中含量豐富,具有強(qiáng)大的抗炎[10]和抗氧化活性[11]。研究發(fā)現(xiàn)柚皮素可抑制視網(wǎng)膜組織神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡,降低糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠氧化應(yīng)激損傷[12]；然而,目前尚不清楚柚皮素是否可以預(yù)防AMD,且柚皮素在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的RPE 損傷中的作用尚未可知。為此,本研究采用H2O2誘導(dǎo)人RPE 氧化損傷,初步探討柚皮素能否通過(guò)調(diào)控miR-34a 減輕RPE 氧化應(yīng)激損傷。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞

人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞系A(chǔ)RPE-19(ATCC)購(gòu)自上海青旗生物技術(shù)發(fā)展有限公司,貨號(hào):BFN60807591。

1.2 主要試劑與儀器

柚皮素(≥95%,貨號(hào):67604-48-2)、過(guò)氧化氫(H2O2,≥98%,貨號(hào):247079-84-1)均購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich 公司；miR-34a 模擬物(mimics)和陰性對(duì)照(NC) 購(gòu)自上海GenePharma 公司；TRIzol RNA 分離試劑(日本TaKaRa,貨號(hào):9108-1)；SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒(日本TaKaRa,貨號(hào):HRR041A-1)；PCR 引物的設(shè)計(jì)合成由美國(guó)賽默飛世爾科技公司完成；Lipofectamine 2000(11668019)購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司；胎牛血清、DMEM 培養(yǎng)基、胰蛋白酶(美國(guó)Gbico 公司,貨號(hào):16000044、10569-044、25200056),MTT、BCA、JC-1法線粒體膜電位檢測(cè)及Annexin V-FITC 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、RIPA 裂解液均購(gòu)自碧云天生物科技公司(碧云天生物科技公司,貨號(hào):C0009 S、P0010、C2006、C1062 L、P0013B)；活性氧(ROS)檢測(cè)試劑盒DCFH-DA(北京索萊寶科技有限公司,貨號(hào):CA1410-500)；WST -1 法超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、TBA 法丙二醛(malondialdehyde,MDA)及微板法還原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所,貨號(hào):A001-3-2、A003-1-2、A006-2-1)；兔抗 人SIRT1 (ab32441)、Bcl-2 (ab32124)、Bax(ab182733)、Caspase-3 (ab32150)、β-actin(ab8227)、山羊抗兔IgG H&L(HRP)(ab205718)購(gòu)自英國(guó)abcam 公司。

細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)于美國(guó)賽默飛世爾科技公司；IX73 倒置熒光顯微鏡購(gòu)于日本奧林巴斯公司；ABI Prism?7300 型熒光定量PCR 儀購(gòu)于美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；BD FACSCanto II 流式細(xì)胞儀、iMark680多功能酶標(biāo)儀及蛋白轉(zhuǎn)膜裝置均來(lái)于美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 柚皮素濃度的篩選

ARPE-19 細(xì)胞置于DMEM 培養(yǎng)基(100 U/mL青霉素、100 mg/L 鏈霉素及10%胎牛血清)中培養(yǎng),條件為37℃,5% CO2。取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的ARPE-19細(xì)胞,以6×103細(xì)胞/孔的濃度接種到96 孔板中,待細(xì)胞貼壁后,向培養(yǎng)基中添加不同濃度(0、5、10、20、40 μg/mL)的柚皮素預(yù)處理24 h,然后用200 μmol/L H2O2處理12 h,每個(gè)濃度設(shè)置6 個(gè)復(fù)孔。在37℃的5% CO2中繼續(xù)培養(yǎng),隨后將MTT 溶液(5 mg/mL,20 μL)在12、24、48 h 時(shí)加入各孔并孵育4 h,吸去上層清液后每孔加入150 μL 的DMSO,490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔吸光度(OD),計(jì)算細(xì)胞存活率。選取可增加ARPE-19 細(xì)胞活性的柚皮素濃度為后續(xù)實(shí)驗(yàn)濃度。細(xì)胞存活率=(用藥組OD 值-調(diào)零孔的OD 值)/(對(duì)照組OD 值-調(diào)零孔的OD值)×100%。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)分組及轉(zhuǎn)染

將對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的ARPE-19 細(xì)胞分成5 個(gè)處理組:(1)對(duì)照組:未經(jīng)處理的ARPE-19 細(xì)胞；(2)H2O2組:ARPE-19 細(xì)胞用200 μmol/L H2O2處理12 h[3]；(3)20 μg/mL 柚皮素組:ARPE-19 細(xì)胞用20 μg/mL 柚皮素預(yù)處理24 h,再用200 μmol/L H2O2處理12 h；(4) 20 μg/mL 柚皮素+NC 組:用Lipofectamine 2000 將100 nmol/L miR-34a 陰性對(duì)照(NC)轉(zhuǎn)染ARPE-19 細(xì)胞,轉(zhuǎn)染24 h 后,給予20 μg/mL 柚皮素預(yù)處理24 h,再用200 μmol/L H2O2處理12 h；(5)20 μg/mL 柚皮素+miR-34a mimics組:用Lipofectamine 2000 將100 nmol/L miR-34a mimics 轉(zhuǎn)染ARPE-19 細(xì)胞,轉(zhuǎn)染24 h 后,給予20 μg/mL 柚皮素預(yù)處理24 h,再用200 μmol/L H2O2處理12 h。在37℃的5% CO2中繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.3.3 RT-qPCR 檢測(cè)mRNA

48 h 后從培養(yǎng)ARPE-19 細(xì)胞中提取總RNA,后反轉(zhuǎn)錄為cDNA 并擴(kuò)增。20 μL 反應(yīng)體系:cDNA(200 ng/μL)2 μL,SYBR?Premix Ex TaqTM(2×)10 μL,上下游引物各0.4 μL,ddH2O 7.2 μL。反應(yīng)條件:40 個(gè)循環(huán),先預(yù)變性10 min(94℃),后變性15 s(95℃),隨后退火20 s(60℃),最后延伸20 s(75℃)。相對(duì)miR-34a(對(duì)照U6)和SIRT1 mRNA(對(duì)照GAPDH)的表達(dá)量采用2-ΔΔCt方法計(jì)算,引物序列見(jiàn)表1。

表1 RT-qPCR 引物序列Table 1 Primer sequence of RT-qPCR

1.3.4 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞活力

對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)ARPE-19 細(xì)胞接種到96 孔板,濃度6×103細(xì)胞/孔,按照1.3.2 項(xiàng)步驟處理,48 h 后每孔中加入20 μL 的MTT 溶液(5 mg/mL),于培養(yǎng)箱中孵育4 h,吸去上層清液后加入150 μL 的DMSO,各孔吸光度(OD)在490 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定,計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.3.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的ARPE-19 細(xì)胞,按照1.3.2 項(xiàng)步驟處理,將培養(yǎng)的ARPE-19 細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化處理,離心,去除上清液,PBS 洗滌,隨后將細(xì)胞重懸,密度為每毫升1×106細(xì)胞,避光孵育15 min(需加入5 μL Annexin V-FITC 及5 μL PI),細(xì)胞凋亡率用流式細(xì)胞儀分析并依步驟操作。

1.3.6 熒光探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS 水平

取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的ARPE-19 細(xì)胞,按照1.3.2 項(xiàng)步驟處理,ARPE-19 細(xì)胞用PBS 洗滌3 次,與10 mmol/L 的2’,7’-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFHDA)于37℃避光孵育30 min。后用酶標(biāo)儀檢測(cè)二氯熒光素(DCF)熒光(激發(fā)波長(zhǎng)488 nm、發(fā)射波長(zhǎng)525 nm),其熒光強(qiáng)度代表ROS 水平。

1.3.7 生化法檢測(cè)SOD 活性、MDA 和GSH 水平

按照1.3.2 項(xiàng)步驟處理ARPE-19 細(xì)胞,收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液,按照試劑盒說(shuō)明書(shū)的操作檢測(cè)SOD活性、MDA 和GSH 水平。

1.3.8 JC-1 法檢測(cè)線粒體膜電位(MMP)

按照線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(JC-1 法)說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行染色。按照1.3.2 項(xiàng)步驟處理,向每孔加入JC-1(DMSO 溶解為濃度5 mg/mL),使終濃度為10 μg/mL,于培養(yǎng)箱中避光孵育20 min,將96 孔板置于多功能熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光值,激發(fā)光為488 nm,發(fā)射光為530 nm 時(shí)(綠色熒光,檢測(cè)JC-1單體)的熒光值為A1；激發(fā)光為529 nm,發(fā)射光為590 nm 時(shí)(紅色熒光,檢測(cè)JC-1 聚合物)的熒光值為A2。各組的熒光值A(chǔ)=A2/A1,最終以相對(duì)熒光值對(duì)MMP 進(jìn)行定量分析。相對(duì)熒光值=實(shí)驗(yàn)組A/對(duì)照組A。

1.3.9 Western blot 檢測(cè)SIRT1 和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

使用RIPA 裂解液提取ARPE-19 細(xì)胞中蛋白質(zhì)并測(cè)定蛋白濃度(BCA 法),隨后取等量蛋白質(zhì)樣品上樣,每條泳道30 μg/泳道,SDS-PAGE 凝膠電泳,轉(zhuǎn)膜封閉,加入一抗SIRT1、Bcl-2、Bax、Caspase-3、βactin(1 ∶1000),孵育過(guò)夜(4℃)后加入二抗(1 ∶5000),室溫孵育1 h,ECL 顯色。內(nèi)參均為β-actin,并計(jì)算目的條帶相對(duì)表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

SPSS 22.0 和Image-Pro Plus 分析數(shù)據(jù)。平均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差() 表示,采用單向方差分析(ANOVA)和Tukey 事后檢驗(yàn)比較多組測(cè)量數(shù)據(jù)之間的差異。以上所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次,P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 柚皮素的濃度篩選

MTT 結(jié)果顯示,柚皮素在濃度為10、20 μg/mL時(shí)培養(yǎng)48 h 后可顯著提高H2O2誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞活力(P＜0.05),且濃度為20 μg/mL 時(shí)對(duì)ARPE-19 細(xì)胞活力的促進(jìn)作用優(yōu)于10 μg/mL,而40 μg/mL 柚皮素處理的細(xì)胞活性較20 μg/mL 柚皮素明顯降低,見(jiàn)圖1；因此選擇20 μg/mL 柚皮素為后續(xù)實(shí)驗(yàn)藥物干預(yù)濃度。

圖1 不同濃度的柚皮素對(duì)細(xì)胞活性的影響Note.Compared with the control group,*P＜0.05.Compared with the H2O2 group,#P＜0.05.Figure 1 Effects of naringenin at different concentrations on cell viability

2.2 柚皮素對(duì)H2O2 誘導(dǎo)的ARPE-19 細(xì)胞miR-34a 和SIRT1 mRNA 表達(dá)的作用

與對(duì)照組相比,H2O2組miR-34a 表達(dá)明顯升高,而SIRT1 mRNA 表達(dá)明顯降低(P＜0.05)；與H2O2組相比,20 μg/mL 柚皮素組和20 μg/mL 柚皮素+mimics NC 組細(xì)胞中miR-34a 表達(dá)明顯降低,SIRT1 mRNA 表達(dá)明顯升高(P＜0.05)；與20 μg/mL柚皮素組相比,20 μg/mL 柚皮素+miR-34a mimics組細(xì)胞中miR-34a 表達(dá)明顯升高,SIRT1 mRNA 表達(dá)明顯降低(P＜0.05),見(jiàn)圖2。

圖2 各組細(xì)胞中miR-34a 和SIRT1 mRNA 的表達(dá)Note.Compared with the control group,*P＜0.05.Compared with the H2O2 group,#P ＜0.05.Compared with the 20 μg/mL naringenin group,&P＜0.05.The same as below.Figure 2 Expression of miR-34a and SIRT1 mRNA in each group

2.3 柚皮素對(duì)H2O2 誘導(dǎo)的ARPE-19 細(xì)胞活力的作用

與對(duì)照組相比,H2O2組細(xì)胞存活率明顯降低(P＜0.05)；與H2O2組相比,20 μg/mL 柚皮素組和20 μg/mL 柚皮素+mimics NC 組細(xì)胞存活率明顯升高(P＜0.05)；與20 μg/mL 柚皮素組相比,20 μg/mL 柚皮素+miR-34a mimics 組細(xì)胞存活率明顯降低(P＜0.05),見(jiàn)圖3。

圖3 各組細(xì)胞中細(xì)胞存活率Figure 3 Cell viability in each group of cells

2.4 柚皮素對(duì)H2O2 誘導(dǎo)的ARPE-19 細(xì)胞凋亡的作用

與對(duì)照組(3.28±0.41)%相比,H2O2組ARPE-19 細(xì)胞凋亡率(17.85±1.23)%明顯升高(P＜0.05)；與H2O2組相比,20 μg/mL 柚皮素組(9.63±0.95)%和20 μg/mL 柚皮素+mimics NC 組(10.07±1.03)%細(xì)胞凋亡率明顯降低(P＜0.05)；與20 μg/mL 柚皮素組相比,20 μg/mL 柚皮素+miR-34a mimics 組(14.86±1.17)%細(xì)胞凋亡率明顯升高(P＜0.05),見(jiàn)圖4。

圖4 各組ARPE-19 細(xì)胞凋亡率Note.A,Control group.B,H2O2 group.C,20 μg/mL naringenin group.D,20 μg/mL naringenin+mimics NC group.E,20 μg/mL naringenin+miR-34a mimics group.Figure 4 Apoptotic rate of ARPE-19 cells in each group

2.5 柚皮素對(duì)H2O2 誘導(dǎo)的ARPE-19 細(xì)胞內(nèi)ROS、SOD、MDA 和GSH 含量的作用

與對(duì)照組相比,H2O2組ARPE-19 細(xì)胞內(nèi)ROS、MDA 含量明顯升高,SOD、GSH 含量明顯降低(P＜0.05)；與H2O2組相比,20 μg/mL 柚皮素組和20 μg/mL 柚皮素+mimics NC 組細(xì)胞內(nèi)ROS、MDA 含量明顯降低,SOD、GSH 含量明顯升高(P＜0.05)；與20 μg/mL 柚皮素組相比,20 μg/mL 柚皮素+miR-34a mimics 組細(xì)胞內(nèi)ROS、MDA 含量明顯升高,SOD、GSH 含量明顯降低(P＜0.05),見(jiàn)圖5。

圖5 各組ARPE-19 細(xì)胞內(nèi)ROS、SOD、MDA 及GSH 含量Note.A,Control group.B,H2O2 group.C,20 μg/mL naringenin group.D,20 μg/mL naringenin+mimics NC group.E,20 μg/mL naringenin+miR-34a mimics group.Figure 5 Contents of ROS,SOD,MDA and GSH in ARPE-19 cells of each group

2.6 柚皮素對(duì)H2O2 誘導(dǎo)的ARPE-19 細(xì)胞MMP的作用

與對(duì)照組(1.00±0.00)相比,H2O2組ARPE-19細(xì)胞內(nèi)MMP 水平(0.45±0.05) 明顯降低(P＜0.05)；與H2O2組相比,20 μg/mL 柚皮素組(0.83±0.07)和20 μg/mL 柚皮素+mimics NC 組(0.85±0.08)細(xì)胞內(nèi)MMP 水平明顯升高(P＜0.05)；與20 μg/mL 柚皮素組相比,20 μg/mL 柚皮素+miR-34a mimics 組(0.69±0.06)細(xì)胞內(nèi)MMP 水平明顯降低(P＜0.05),見(jiàn)圖6。

圖6 各組ARPE-19 細(xì)胞MMPFigure 6 MMP in ARPE-19 cells of each group

2.7 柚皮素對(duì)H2O2 誘導(dǎo)的ARPE-19 細(xì)胞SIRT1和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的作用

與對(duì)照組相比,H2O2組ARPE-19 細(xì)胞SIRT1、Bcl-2 表達(dá)明顯降低,而B(niǎo)ax、Caspase-3 表達(dá)明顯升高(P＜0.05)；與H2O2組相比,20 μg/mL 柚皮素組和20 μg/mL 柚皮素+mimics NC 組細(xì)胞SIRT1、Bcl-2 表達(dá)明顯升高,而B(niǎo)ax、Caspase-3 表達(dá)明顯降低(P＜0.05)；與20 μg/mL 柚皮素組相比,20 μg/mL 柚皮素+miR-34a mimics 組細(xì)胞SIRT1、Bcl-2 表達(dá)明顯降低,而B(niǎo)ax、Caspase-3 表達(dá)明顯升高(P＜0.05),見(jiàn)圖7。

圖7 各組細(xì)胞SIRT1、Bcl-2、Bax、Caspase-3 蛋白表達(dá)Figure 7 Protein expression of SIRT1,Bcl-2,Bax and Caspase-3 in each group

3 討論

眼睛持續(xù)暴露于環(huán)境刺激中,如輻射、化學(xué)物質(zhì)、大氣中的氧氣[13]。在正常情況下,這些刺激引起的氧化應(yīng)激可以通過(guò)機(jī)體的抗氧化系統(tǒng)消除[14]。然而,隨著人口老齡化,年齡介導(dǎo)的氧化應(yīng)激和抗氧化劑水平下降導(dǎo)致蛋白質(zhì)修飾和氧化,引起RPE功能障礙和隨后的細(xì)胞凋亡[15],RPE 細(xì)胞介導(dǎo)的氧化應(yīng)激在AMD 的發(fā)病機(jī)理和進(jìn)程中起著重要作用。氧化應(yīng)激是ROS 水平在機(jī)體內(nèi)大量產(chǎn)生和積累的結(jié)果。在各種ROS 中,H2O2被確定為可以介導(dǎo)各種細(xì)胞作用的第二信使分子,其過(guò)量產(chǎn)生是氧化還原信號(hào)傳導(dǎo)和氧化應(yīng)激的中心樞紐[16]。因此,H2O2通常在體外實(shí)驗(yàn)中用于誘導(dǎo)氧化應(yīng)激[17]。據(jù)報(bào)道,用200 μmol/L 的H2O2處理ARPE-19 細(xì)胞12 h,可顯著抑制ARPE-19 細(xì)胞活力,促進(jìn)ARPE-19細(xì)胞ROS 產(chǎn)生和凋亡,并誘導(dǎo)細(xì)胞出現(xiàn)氧化應(yīng)激損傷[3]。因此,本研究使用200 μmol/L 的H2O2誘導(dǎo)建立RPE 細(xì)胞氧化損傷模型。有文獻(xiàn)報(bào)道,阿霉素會(huì)誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷,產(chǎn)生大量的ROS,柚皮素可升高GSH 含量及SOD 酶活力,降低ROS 水平,產(chǎn)生抗氧化應(yīng)激作用,減輕心肌細(xì)胞損傷[18-19]。本研究發(fā)現(xiàn)H2O2誘導(dǎo)后細(xì)胞活力下降,而ROS 水平增加,柚皮素減輕了RPE 細(xì)胞中H2O2對(duì)細(xì)胞活力和ROS產(chǎn)生的影響。此外,柚皮素還可以降低H2O2誘導(dǎo)的RPE 細(xì)胞中MDA 水平,增加內(nèi)源性抗氧化劑GSH 及抗氧化酶SOD 活性。表明柚皮素處理提高了H2O2誘導(dǎo)的RPE 細(xì)胞中的GSH 水平和SOD 活性。提示柚皮素處理逆轉(zhuǎn)了RPE 細(xì)胞中H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激。

ROS 介導(dǎo)的氧化應(yīng)激可能導(dǎo)致RPE 細(xì)胞凋亡[20]。而柚皮素可以降低Caspase-3 蛋白表達(dá),升高Bcl-2 蛋白水平及Bcl-2/Bax 比值,抑制細(xì)胞凋亡,減輕心肌細(xì)胞損傷[18-19]。本研究結(jié)果顯示,柚皮素處理可抑制H2O2誘導(dǎo)的RPE 細(xì)胞凋亡,Western blot 結(jié)果進(jìn)一步顯示柚皮素抑制了RPE 細(xì)胞中促凋亡Bax 蛋白的表達(dá),并誘導(dǎo)抗凋亡蛋白Bcl-2 的表達(dá)。此外,柚皮素還阻止了H2O2誘導(dǎo)的RPE 細(xì)胞中Caspase-3 的活化。MMP 參與細(xì)胞凋亡的發(fā)展和進(jìn)程,MMP 的降低是細(xì)胞凋亡的特異性標(biāo)志[21]。JC-1 是一種碳氰化合物類陽(yáng)離子熒光染料,廣泛用于檢測(cè)MMP。正常情況下,JC-1 能依賴跨膜電位聚集在線粒體的基質(zhì)中,形成紅色熒光的聚合物；當(dāng)發(fā)生凋亡則降低跨膜電位,釋放線粒體中的JC-1,在胞質(zhì)內(nèi)以單體的形式存在發(fā)綠色熒光[22]；柚皮素可明顯升高紅/綠熒光比值,升高M(jìn)MP 水平。這些結(jié)果均提示柚皮素可抑制H2O2誘導(dǎo)的RPE 細(xì)胞凋亡。

此外,本研究發(fā)現(xiàn)H2O2誘導(dǎo)的RPE 細(xì)胞中miR-34a 水平顯著增加,而SIRT1 mRNA 水平顯著降低。有報(bào)道顯示miR-34a 是RPE 細(xì)胞中高度表達(dá)的調(diào)節(jié)因子之一,miR-34a 上調(diào)可通過(guò)直接或間接抑制c-Met 和其他細(xì)胞周期相關(guān)分子的表達(dá)來(lái)抑制RPE 細(xì)胞的增殖和遷移[7],證實(shí)了其可調(diào)節(jié)RPE細(xì)胞功能。SIRT1 已被證明是miR-34a 的靶基因,在細(xì)胞分化、衰老、凋亡、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、氧化應(yīng)激等多種重要的生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮重要作用；既往研究已經(jīng)證實(shí)SIRT1 可通過(guò)抗炎、抗氧化、減少凋亡等機(jī)制發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用[23-24]。Tong 等[8]發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-34a 可顯著抑制SIRT1 轉(zhuǎn)錄后表達(dá),同時(shí)H2O2誘導(dǎo)的ARPE-19 細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的耐受性降低。本研究結(jié)果顯示柚皮素可下調(diào)miR-34a,促進(jìn)SIRT1 mRNA 和蛋白表達(dá)；采用Lipofectamine 2000 將miR-34a 轉(zhuǎn)染ARPE-19 細(xì)胞上調(diào)miR-34a,結(jié)果顯示miR-34a 轉(zhuǎn)染ARPE-19 細(xì)胞后,miR-34a 水平明顯增加,而SIRT1 的表達(dá)降低,明顯逆轉(zhuǎn)了柚皮素對(duì)H2O2誘導(dǎo)的RPE 細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用。提示,柚皮素的保護(hù)作用可能是由miR-34a/SIRT1 信號(hào)通路介導(dǎo)的。

綜上所述,柚皮素可通過(guò)下調(diào)miR-34a,促進(jìn)SIRT1 表達(dá),抑制RPE 細(xì)胞凋亡,保護(hù)H2O2誘導(dǎo)的RPE 細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。然而,本研究存在一定的局限性,H2O2誘導(dǎo)氧化損傷后柚皮素是否能發(fā)揮較長(zhǎng)時(shí)間的保護(hù)作用需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn),且需要進(jìn)行體內(nèi)動(dòng)物研究以及柚皮素與其他藥物相比的功效進(jìn)一步明確柚皮素的保護(hù)作用。