孕早中期孕婦腸道菌群差異與子癇前期發(fā)病關(guān)系的研究

莫蕾，鐘萍

子癇前期病情嚴(yán)重者可進(jìn)展至子癇并威脅母嬰生命安全[1-2]。子癇前期的病因至今未完全明確，除了積極探索子癇前期的高效治療手段并優(yōu)化預(yù)后外，在妊娠20周前篩查子癇前期高危孕婦并采取針對(duì)性干預(yù)措施，可能對(duì)降低子癇前期發(fā)病、從根本上降低妊娠風(fēng)險(xiǎn)具有重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)從孕早期至孕晚期，腸道菌群構(gòu)成發(fā)生了顯著變化[3-4]，且子癇前期患者隨孕周增加多種腸道致病菌數(shù)量有所增加而益生菌種類及數(shù)量減少[5]，推測(cè)腸道菌群變化可能參與子癇前期的發(fā)生發(fā)展，但相關(guān)研究開展不多。本研究前瞻性分析孕早中期孕婦腸道菌群與子癇前期發(fā)病的關(guān)系，在探索子癇前期發(fā)病機(jī)制的同時(shí)也為子癇前期高危孕婦篩查提供新思路。

本研究創(chuàng)新點(diǎn)：

腸道菌群差異被認(rèn)為是導(dǎo)致子癇前期病情加劇的重要原因之一，故推測(cè)其可能在子癇前期的發(fā)病中也扮演重要角色。超聲等產(chǎn)檢手段具有間接性、滯后性等特點(diǎn)且重復(fù)多次進(jìn)行可能對(duì)胎兒具有負(fù)面影響，故本研究嘗試尋找更為客觀、簡(jiǎn)便、高效的檢測(cè)指標(biāo)。糞便樣本采集及腸道菌群檢測(cè)后經(jīng)生物信息學(xué)分析獲得Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)，被證實(shí)可預(yù)測(cè)孕早期女性的子癇前期發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，向子癇前期發(fā)病危險(xiǎn)人群的早期精準(zhǔn)篩查又邁進(jìn)一步，也為后續(xù)更多無創(chuàng)預(yù)測(cè)指標(biāo)的發(fā)現(xiàn)提供新思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究為前瞻性隊(duì)列研究，于2019年1月至2021年1月桂林醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院產(chǎn)科招募孕婦484例。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）妊娠12+6周建檔產(chǎn)檢；（2）宮內(nèi)單胎；（3）年齡20～45周歲；（4）規(guī)律產(chǎn)檢、臨床資料完整、可接受隨訪。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）妊娠前或者孕早期確診為高血壓和/或腎功能異常；（2）妊娠前進(jìn)行大型胃腸道手術(shù)；（3）妊娠前3個(gè)月有抗生素服用史；（4）合并急慢性胃腸道疾病、嚴(yán)重自身免疫性疾病等；（5）合并妊娠期糖尿病、妊娠期心臟病、肝內(nèi)膽汁淤積等其他嚴(yán)重妊娠期并發(fā)癥。根據(jù)納入與排除標(biāo)準(zhǔn)共納入455例孕婦作為研究對(duì)象，另根據(jù)《妊娠期高血壓疾病診治指南（2015）》[6]，將孕20周后確診為子癇前期的孕婦作為子癇前期組（n=32），無子癇前期的孕婦作于非子癇前期組（n=423）。入組研究對(duì)象均由本人簽署知情同意書，本院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)本研究計(jì)劃（批準(zhǔn)編號(hào)：GXZQN-2020003）。

1.2 糞便樣本采集及腸道菌群檢測(cè) 所有入組孕婦分別于孕早期（≤12+6周）、孕中期（13～27+6周）留取糞便標(biāo)本，避光室溫保存，采用DNA提取試劑盒〔購(gòu)自賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司〕進(jìn)行糞便DNA提取。提取樣本DNA后用無菌水稀釋至1 mg/L，以其為模板使用特異性引物（引物序列如下：上游引物5'-TGACGAGCTGAAGCTGGCT-3'，下游引物5'-CGAAGCTGAAGCTGTGAGCGT-3'）對(duì)測(cè)序區(qū)域進(jìn)行基因擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件：98 ℃預(yù)變性1 min、98 ℃變性10 s、50 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，共計(jì)30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物與載樣緩沖液進(jìn)行等量混樣，混勻后使用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行PCR產(chǎn)物檢測(cè)。

1.3 生物信息學(xué)分析 以97%的一致性將序列聚類為操作分類單元（OTUs），根據(jù)OTUs聚類結(jié)果進(jìn)行物種注釋，統(tǒng)計(jì)基于豐度的物種分布情況，最后對(duì)各樣品數(shù)據(jù)進(jìn)行均一化處理并分析結(jié)果，包括Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)。

1.4 質(zhì)量控制 本研究由3名經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化培訓(xùn)的研究員進(jìn)行入組孕婦招募，以及糞便標(biāo)本收集、檢測(cè)、隨訪工作的指導(dǎo)，研究過程完整記錄、留存。糞便采樣使用常溫糞便采樣標(biāo)本管避免標(biāo)本變質(zhì)，嚴(yán)格遵循采用的無菌要求及送檢時(shí)效性。

1.5 臨床資料收集 收集所有入組孕婦的臨床資料，包括年齡、妊娠前體質(zhì)指數(shù)（BMI）、是否為經(jīng)產(chǎn)婦、孕早期留標(biāo)本孕周、孕中期留標(biāo)本孕周。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以（±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以相對(duì)數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；采用多因素Logistic回歸分析探究孕婦發(fā)生子癇前期的影響因素。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 子癇前期組和非子癇前期組患者的臨床資料比較子癇前期組和非子癇前期組妊娠前BMI、經(jīng)產(chǎn)婦所占比例、孕早期留標(biāo)本孕周、孕中期留標(biāo)本孕周、孕早期Chao1指數(shù)、孕中期Chao1指數(shù)、孕中期Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。子癇前期組和非子癇前期組年齡、孕早期Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表1。

表1 子癇前期組和非子癇前期組患者臨床資料比較Table 1 Comparison of clinical data between preeclampsia group and nonpreeclampsia group

2.2 多因素Logistic回歸分析 以是否發(fā)生子癇前期為因變量（賦值：0=否，1=是），以2.1中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變量：年齡（賦值：<35歲=0，≥35歲=1）、孕早期Shannon指數(shù)（賦值：連續(xù)變量）及Simpson指數(shù)（賦值：連續(xù)變量）為自變量進(jìn)行多因素Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，年齡≥35周歲、孕早期Shannon指數(shù)下降、孕早期Simpson指數(shù)下降是孕婦發(fā)生子癇前期的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P<0.05），見表2。

表2 孕婦發(fā)生子癇前期影響因素的多因素Logistic回歸分析Table 2 Multivariate Logistic regression analysis of influencing factors of preeclampsia in pregnant women

2.3 孕早期腸道菌群指標(biāo)對(duì)子癇前期發(fā)病的預(yù)測(cè)價(jià)值

繪制孕早期Shannon指數(shù)及Simpson指數(shù)預(yù)測(cè)孕婦子癇前期發(fā)病的受試者工作特征（ROC）曲線，結(jié)果顯示，孕早期Shannon指數(shù)預(yù)測(cè)孕婦子癇前期發(fā)病的ROC曲線下面積為0.745〔95%CI（0.652，0.838）〕，截?cái)嘀禐?.255，靈敏度為76.58%，特異度為60.00%；孕早期Simpson指數(shù)預(yù)測(cè)孕婦子癇前期發(fā)病的ROC曲線下面積為0.724〔95%CI（0.623，0.826）〕，截?cái)嘀禐?.945，靈敏度為62.90%，特異度為60.61%，見圖1。

圖1 孕早期腸道菌群指標(biāo)預(yù)測(cè)孕婦發(fā)生子癇前期的ROC曲線Figure 1 ROC curve of intestinal flora in early pregnancy to predict preeclampsia in pregnant women

3 討論

子癇前期是目前全球孕產(chǎn)婦死亡的主要原因之一，嚴(yán)重高血壓及多器官損傷可導(dǎo)致胎兒生長(zhǎng)受限甚至死亡。子癇前期病因不明給治療帶來不確定性，目前研究認(rèn)為子癇前期的發(fā)生是一種多因素綜合作用的過程，最終導(dǎo)致胎盤氧合失調(diào)、血管生成障礙[1，7-8]。在妊娠過程中健康孕婦也存在生理性腸道菌群改變，包括細(xì)菌多樣性降低、具有抗炎作用的糞桿菌豐度降低、機(jī)會(huì)性致病菌豐度增加，但是這些改變?cè)谠性缙诓幻黠@，至孕晚期逐步出現(xiàn)[9-10]。李湛等[11]研究顯示子癇前期孕婦在孕晚期產(chǎn)氣莢膜梭菌、毛狀大泡菌增加而益生菌減少。既往研究多涉及子癇前期孕婦的腸道菌群變化，但是對(duì)尚未確診、處于孕早中期的孕婦，如何通過篩查其糞便中腸道菌群的變化而預(yù)測(cè)子癇前期的發(fā)病，相關(guān)研究涉及很少。

本研究發(fā)現(xiàn)子癇前期組孕婦孕早期Shannon指數(shù)及Simpson指數(shù)分別低于非子癇前期組。Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)均是腸道菌群的主要指標(biāo)，其中Chao1指數(shù)反映菌落豐富度，Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)反映菌群物種多樣性[12-14]。上述結(jié)果提示子癇前期孕婦孕早期已經(jīng)存在較為明顯的腸道菌群物種多樣性下降，而其腸道菌群菌落豐度可能仍較為穩(wěn)定。子癇前期組、非子癇前期組其他存在明顯差異的指標(biāo)為年齡，子癇前期孕婦的平均年齡明顯大于非子癇前期組。將上述存在差異的指標(biāo)納入Logistic回歸模型，發(fā)現(xiàn)孕早期Shannon指數(shù)下降、孕早期Simpson指數(shù)下降是子癇前期發(fā)病的危險(xiǎn)因素，同時(shí)年齡≥35周歲也是子癇前期發(fā)生的重要原因之一。孕早期腸道菌群多樣性下降對(duì)后續(xù)子癇前期發(fā)生的影響機(jī)制尚不明確，可能與其影響機(jī)體免疫調(diào)節(jié)、誘導(dǎo)炎性反應(yīng)及細(xì)胞因子表達(dá)、合成的某些神經(jīng)遞質(zhì)可改變血管內(nèi)皮功能及血管張力等途徑血管[15-16]。年齡對(duì)子癇前期的影響已在研究中被證實(shí)[17]，可能涉及年齡增加后血管彈性下降、胰島素抵抗增加等環(huán)節(jié)。

進(jìn)一步探討孕早期腸道菌群指標(biāo)對(duì)子癇前期發(fā)病的預(yù)測(cè)價(jià)值，發(fā)現(xiàn)孕早期Shannon指數(shù)<6.255、Simpson指數(shù)<0.945對(duì)子癇前期具有良好的預(yù)警價(jià)值，且靈敏度、特異度分別達(dá)到76.58%、60.00%，62.90%、60.61%，相較于既往其他預(yù)測(cè)指標(biāo)而言該指標(biāo)靈敏度及特異度較高。且孕婦糞便樣本獲取后即可相對(duì)便捷高效的得出Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)，可重復(fù)性好且孕婦無痛苦，可能成為后續(xù)除影像學(xué)手段外早期篩查子癇前期患病高危人群的又一可靠指標(biāo)。本研究中創(chuàng)新性地將Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)用于孕早期婦女的子癇前期發(fā)病預(yù)測(cè)，為子癇前期的早期無創(chuàng)精準(zhǔn)篩查目標(biāo)實(shí)現(xiàn)又邁出一步。

綜上所述，孕早期糞便Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)下降是子癇前期發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一，且對(duì)子癇前期發(fā)病具有早期預(yù)警價(jià)值，可能成為后續(xù)子癇前期高危人群篩查的重要手段之一，有待后續(xù)開展更多研究并深入明確。

作者貢獻(xiàn)：莫蕾提出研究思路，設(shè)計(jì)研究方案，實(shí)施研究過程，包括糞便樣本采集及腸道菌群檢測(cè)、生物信息學(xué)分析、臨床資料收集以及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析、繪制圖表；鐘萍負(fù)責(zé)論文起草，最終版本修訂，對(duì)論文負(fù)責(zé)。

本文無利益沖突。