重型顱腦損傷患者血清可溶性α-Klotho蛋白水平動態(tài)變化及臨床意義研究

任斌，楊雷方，丁新民，梁繼芳

創(chuàng)傷性顱腦損傷是世界范圍內重要的健康問題[1]。據估計全世界每年約有548萬的顱腦損傷患者，其中約20%為重型顱腦損傷，發(fā)病特點為病情危重且進展快、預后差，病死率高達30%～50%[2-3]。手術是治療該類患者的重要方法，術后患者病情的準確判斷及預后評估也至關重要。因此尋找與創(chuàng)傷性顱腦損傷病情演變相關的檢驗指標具有重要的臨床意義。

可溶性α-Klotho蛋白是一種跨膜可裂解蛋白，在人體內廣泛表達，其為一種體液因子，可發(fā)揮多種生物學作用[4]。動物模型研究證實Klotho蛋白缺乏可引起機體提前老化，過度表達則有助于長壽與認知功能改善[5]。近年來，其在中樞神經系統(tǒng)疾病中的作用逐漸被關注和研究。本研究通過檢測103例重型顱腦損傷且行手術治療患者血清可溶性α-Klotho蛋白水平隨時間的變化規(guī)律，分析其與患者病情演變及預后評估的關系，探索重型顱腦損傷患者預后評估相關的生物學標志物。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019年7月至2020年9月山西白求恩醫(yī)院重癥醫(yī)學科收治的重型顱腦損傷行手術治療需術后監(jiān)護的患者103例作為病例組，其中男86例、女17例；年齡20～57歲，平均年齡（48.3±9.7）歲。另選取同期在本院體檢的健康志愿者50例作為對照組，其中男34例、女16例；年齡24～58歲，平均年齡（44.6±8.1）歲。納入標準：（1）經顱腦CT、磁共振成像（MRI）等檢查符合《中國重型顱腦創(chuàng)傷早期康復管理專家共識（2017）》[6]中的重型顱腦損傷診斷標準，格拉斯哥昏迷量表（GCS）評分3～8分；（2）傷后24 h內入院并行急診手術治療，且住院時間≥7 d；（3）年齡≥18周歲且臨床資料完善、簽署知情同意書。排除標準：（1）既往明確診斷有腦梗死、腦出血及短暫性腦缺血發(fā)作等病史；（2）合并高血壓、糖尿病等慢性疾病；（3）合并惡性腫瘤；（4）未能完成臨床診療，中途自動出院或入院后7 d內死亡。根據病例組患者生存結局將其分為生存亞組（n=74）與死亡亞組（n=29）。本研究通過山西白求恩醫(yī)院倫理委員會審核批準（YXLL-2019-024）。

1.2 方法

1.2.1 血清可溶性α-Klotho蛋白水平的檢測 分別于病例組患者入重癥醫(yī)學科第1、3、5、7天采集靜脈血3 ml，對照組入組第1天采集靜脈血3 ml，以3 500 r/min離心10 min，離心半徑0.5 cm，留取上清液，置于-80℃冰箱中保存?zhèn)錅y。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測血清可溶性α-Klotho蛋白水平，試劑盒采用武漢博士德生物工程有限公司的KLOTHO ELISA試劑盒（貨號：EK1688）。

1.2.2 臨床資料收集 利用SPSS 22.0軟件建立數據庫，由雙人完成臨床資料數據錄入，包括：姓名、住院號、性別、年齡、體質指數（BMI）、治療方式、入院時急性生理和慢性健康狀況評估Ⅱ（acute physiology and chronic health evaluationⅡ，APACHE Ⅱ）評分、GCS評分及血細胞分析、血生化等臨床檢測指標。所有臨床檢測指標由本院檢驗科統(tǒng)一檢測。

1.2.2.1 APACHE Ⅱ評分 APACHE Ⅱ評分由KNAUS等[7]于1985年提出，包括年齡、急性生理學評分（APS）、慢性健康狀態(tài)評分（CPS）3部分，其中APS包括血氣分析、血常規(guī)、生命體征等各項指標；CPS包括肝臟、腎臟、心血管、呼吸及免疫抑制等方面，量表總分為各部分評分之和，總分為0～71分。

1.2.2.2 GCS評分 GCS包括睜眼反應、語言反應和肢體運動3個方面，共計15分[8]。

1.2.2.3 血細胞分析及血生化指標檢測 所有研究對象于入院即刻抽取靜脈血6 ml，取3 ml置入EDTA抗凝管充分搖勻保存，采用全自動血細胞分析儀（美國貝克曼，型號：DXH800）檢測白細胞計數、中性粒細胞計數、血小板計數；另取3 ml置入分離膠/促凝管，以3 500 r/min離心10 min，采用全自動生化分析儀（貝克曼，型號：5821）檢測血紅蛋白、白蛋白、血糖、尿素氮、肌酐。

1.2.3 生存結局定義 將住院28 d內因死亡或病情加重自動離院的患者定義其生存結局為死亡，將病情好轉并轉入普通病房或好轉出院的患者定義為生存。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 22.0及Medcalc 19.0軟件進行統(tǒng)計分析及繪圖，符合正態(tài)分布的計量資料以（±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；非正態(tài)分布的計量資料以M（P25，P75）表示，兩組間比較采用非參數檢驗；計數資料以相對數表示，兩組間分析采用χ2檢驗；重復測量資料的比較采用重復測量方差分析。應用受試者工作特征（ROC）曲線評價不同時間點指標的預測價值，組間比較采用Delong法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 生存亞組與死亡亞組患者基線資料比較 生存亞組和死亡亞組年齡、性別、BMI、休克發(fā)生率、GCS評分、血糖比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；生存亞組平均動脈壓（MAP）、血小板計數、白蛋白、尿素氮、肌酐、APACHE Ⅱ評分低于死亡亞組，白細胞計數、中性粒細胞計數、血紅蛋白高于死亡亞組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表1。

表1 生存亞組與死亡亞組患者基線資料比較Table 1 Baseline data of patients with severe craniocerebral injury

2.2 病例組和對照組不同時間點血清可溶性α-Klotho蛋白水平比較 病例組第1、3、5、7天血清可溶性α-Klotho蛋白水平均高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。病例組不同時間血清可溶性α-Klotho蛋白水平比較，差異均有統(tǒng)計學意義（F=28.640，P<0.001）；其中第3、5天血清可溶性α-Klotho蛋白水平均高于第1天，第5、7天血清可溶性α-Klotho蛋白水平均低于第3天，第7天血清可溶性α-Klotho蛋白水平低于第5天，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表2。

表2 病例組和對照組不同時間點血清可溶性α-Klotho蛋白水平比較（±s，ng/L）Table 2 Comparison of the level of serum soluble α-Klotho protein between healthy controls and patients with severe craniocerebral injury at different time points

表2 病例組和對照組不同時間點血清可溶性α-Klotho蛋白水平比較（±s，ng/L）Table 2 Comparison of the level of serum soluble α-Klotho protein between healthy controls and patients with severe craniocerebral injury at different time points

注：對照組第3、5、7天血清可溶性α-Klotho蛋白水平均采用第1天的數據；a表示與同組第1天相比P<0.05，b表示與同組第3天相比P<0.05，c表示與同組第5天相比P<0.05

組別 例數 第1天 第3天 第5天 第7天對照組 50 140.20±28.35 140.20±28.35 140.20±28.35 140.20±28.35病例組 103 173.67±3.08 204.90±5.25a 186.93±0.96ab 174.05±4.02bc t值 7.328 5.632 14.547 3.050 P值 <0.001 <0.001 <0.001 0.003

2.3 生存亞組與死亡亞組血清可溶性α-Klotho蛋白水平隨時間的變化規(guī)律分析 組別與時間對血清可溶性α-Klotho蛋白水平存在交互作用（P=0.003），組間及時間對血清可溶性α-Klotho蛋白水平主效應顯著（P<0.05）。其中第1、7天，生存亞組血清可溶性α-Klotho蛋白水平高于死亡亞組（P<0.05）；生存亞組第3天血清可溶性α-Klotho蛋白水平高于第1、5、7天；死亡亞組第3天血清可溶性α-Klotho蛋白水平高于第1、7天，第5天血清可溶性α-Klotho蛋白水平高于第1、7天，低于第3天，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表3。

表3 生存亞組與死亡亞組不同時間點血清可溶性α-Klotho蛋白水平比較（±s，ng/L）Table 3 Comparison of the level ofserum soluble α-Klotho protein betweensurvived and decreased patients with severe craniocerebral injuryat different time points

表3 生存亞組與死亡亞組不同時間點血清可溶性α-Klotho蛋白水平比較（±s，ng/L）Table 3 Comparison of the level ofserum soluble α-Klotho protein betweensurvived and decreased patients with severe craniocerebral injuryat different time points

注：a表示與生存亞組相比P<0.05；b表示與同組第1天相比P<0.05，c表示與同組第3天相比P<0.05，d表示與同組第5天相比P<0.05

組別 例數 第1天 第3天 第5天 第7天生存亞組 74 182.12±22.16 203.13±31.00b 188.19±10.25c 182.36±34.62a死亡亞組 29 167.48±24.53a206.86±33.86b 186.34±7.00bc 159.41±30.69acd F 值 F交互=4.912，F組間=6.127，F時間=18.387 P值 P交互=0.003，P組間=0.020，P時間<0.001

2.4 應用ROC曲線評價不同時間點血清可溶性α-Klotho蛋白水平對生存結局的預測價值 繪制重型顱腦損傷患者術后第1、7天血清可溶性α-Klotho蛋白水平預測生存結局的ROC曲線，結果顯示，ROC曲線下面積（AUC）分別為0.686〔95%CI（0.587，0.774）〕、0.710〔95%CI（0.612，0.796）〕，兩者AUC比較，差異無統(tǒng)計學意義（Z=0.265，P=0.791），見圖1。

圖1 重型顱腦損傷患者術后第1、7天血清可溶性α-Klotho蛋白水平預測生存結局的ROC曲線Figure 1 ROC analysis of postoperative （days 1 and 7） serum soluble α-Klotho in predicting 28-day in-hospital survival in patients with severe craniocerebral injury

3 討論

重型顱腦損傷是一種在我國臨床常見的顱腦損傷疾病，其傷后顱內腦組織存在復雜的病理生理反應，其疾病的演變難以用臨床神經功能檢查及影像學檢查來預測，且隨著鎮(zhèn)靜治療在神經重癥監(jiān)護病房的普及，神經功能檢查有其局限性，其靈敏度差，而且時間滯后[9]。不同患者變化不同，快速變化如出現“talk and die”現象，緩慢者可數天后惡化[10]，因此，尋找與其疾病演變及預后判斷相關的生化指標對于這類疾病的患者術后預后的準確判斷具有重要意義[11]。

Klotho蛋白是Klotho基因編碼的跨膜蛋白，研究證實Klotho蛋白通過分泌型和膜結合型兩種類型對多個靶器官發(fā)揮生物學效應[12]，其中分泌型Klotho蛋白具有抗氧化、免疫調節(jié)、抗炎等多種作用，在多種疾病中具有保護作用[4]。急性缺血性腦卒中、阿爾茨海默病等疾病發(fā)病早期均可出現血清可溶性α-Klotho蛋白水平的明顯升高，考慮可能與疾病早期的代償性反應有關[13-14]。本研究發(fā)現顱腦損傷后患者也出現了Klotho蛋白水平的明顯升高，與前述研究結果一致，且在傷后第3天達到峰值，這種變化規(guī)律與其生存結局無關，考慮其升高與顱腦損傷后患者缺氧、水腫、炎性反應等有關，在第3天達峰值，這與臨床上顱腦損傷后腦水腫在創(chuàng)傷后3～4 d達高峰的時間相一致[15]，提示血清可溶性α-Klotho蛋白可作為顱腦損傷后患者顱內水腫進展的一個間接監(jiān)測指標，有利于指導臨床醫(yī)師對該類患者的病情變化做出早期評估，指導臨床決策制定。

重型顱腦損傷危害性較大，臨床救治難度高，且預后影響因素存在較多變異性。重型顱腦損傷患者預后的早期評估是對治療方案選擇、資源的分配、患者的分類以及與患者家屬溝通的重要因素[16]。因此該類患者的預后評估指標的篩選具有重要意義。本研究通過ROC曲線證實其術后第1天及第7天的血清可溶性α-Klotho蛋白水平均對預后具有預測價值，但二者間AUC比較無差異，考慮可能與本研究樣本例數偏少有關，需進一步擴大樣本量深入研究。

本研究存在一定局限性，首先，本研究為單中心研究，且樣本例數有限，存在病例選擇偏倚可能，可能會影響研究結果的價值，需進一步擴大樣本量進行多中心前瞻性研究，從而為臨床提供證據支持。其次，關于血清可溶性α-Klotho蛋白水平在顱腦損傷后變化的機制尚不十分明確，還需在動物實驗中進一步深入研究其與顱腦損傷病情演變及預后關系的生物學機制。

綜上所述，血清可溶性α-Klotho蛋白水平的監(jiān)測可以實現對重型顱腦損傷患者病情演變及預后的判斷，對于指導顱腦損傷患者臨床治療、優(yōu)化治療方案，具有重要的意義，且與預后具有相關性，可作為臨床可行的一種監(jiān)測手段進一步深入研究。

作者貢獻：任斌進行文章的構思與設計、撰寫論文，并提供研究經費支持；楊雷方進行研究的實施與可行性分析，進行數據分析與整理；丁新民進行統(tǒng)計結果的分析與解釋及論文的修訂；梁繼芳進行論文思路的可行性評價，負責文章的質量控制及審校。

本文無利益沖突。