樊雪敏，徐 雯，郭安捷，陳志興，莫水學(xué)△，方善寶△

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院，南寧 530021；2.廣西口腔頜面修復(fù)與重建研究自治區(qū)級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530021；3.廣西顱頜面畸形臨床醫(yī)學(xué)研究中心，南寧 530021；4.頜面外科疾病診治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室廣西高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530021）

慢性牙周病引起牙周組織破壞，造成牙槽骨缺損，長(zhǎng)期缺牙繼發(fā)牙槽骨廢用性吸收等是臨床口腔治療中常見的疑難問(wèn)題[1]。近年來(lái)，骨組織替代材料如人工骨粉在牙槽骨缺損修復(fù)中取得了較好的成骨效果，但目前骨粉價(jià)格較高，誘導(dǎo)成骨效果欠佳，機(jī)械性能不足，且伴有成骨后骨再吸收等問(wèn)題，使得人工骨粉的臨床應(yīng)用受到一定限制[2]。因此，采用組織工程學(xué)技術(shù)，研究更經(jīng)濟(jì)實(shí)惠且成骨效果優(yōu)良的骨替代支架材料仍在探索中。

復(fù)合材料是指通過(guò)物理或化學(xué)方法，從分子水平上復(fù)合兩種或兩種以上不同性質(zhì)的成分，合成具有不同功能的新型材料。納米復(fù)合材料指的是復(fù)合材料中添加了具有納米尺寸（直徑小于100 nm）的材料。納米粘土鋰皂石（laponite，LAP）是一種人工合成的層狀硅酸鹽材料，由直徑約為25 nm、厚度為1 nm 的層狀圓盤納米顆粒組成，是一種具有高孔隙率、高比表面積和大長(zhǎng)徑比等優(yōu)點(diǎn)的納米材料[3-4]。Laponite-XLG 可形成凝膠級(jí)產(chǎn)品的成品鋰皂石之一，具有高純度、低重金屬及低微生物含量等特性，易溶于水，可與其他成分相互作用生成新的納米復(fù)合物，被證明具有促進(jìn)成骨的作用效果[5-8]。

殼聚糖（chitosan，CS）是一種天然帶正電荷的堿性多糖，具有良好的生物相容性、抗菌性和可降解性，被廣泛研究應(yīng)用于支架材料、傷口愈合等領(lǐng)域[9-11]?；贚AP和CS在成骨領(lǐng)域表現(xiàn)出的優(yōu)秀潛能，本研究擬構(gòu)建LAP/CS納米復(fù)合支架載體，分析其理化性能表征，以人牙周膜干細(xì)胞作為種子細(xì)胞，觀察LAP/CS 納米復(fù)合支架對(duì)細(xì)胞的黏附能力及細(xì)胞毒性，探討其后期應(yīng)用于牙槽骨組織工程修復(fù)的可行性。

1 材料與方法

1.1 納米復(fù)合支架的制備

使用原位聚合法和冷凍干燥法制備LAP/CS納米復(fù)合支架。CS 溶于1 wt%的乙酸溶液中，獲得2%CS溶液。將不同質(zhì)量的LAP粉末溶于純水中，分別制取1 wt%、3 wt%、5 wt%、7 wt%、10 wt%的LAP 溶液。在CS溶液中緩慢加入不同濃度的LAP溶液，磁力攪拌器攪拌混勻。將LAP/CS 溶液澆鑄在直徑15 mm、高度2 mm 的圓柱形模具中，振蕩30 min，置于-20 ℃冰箱中冷凍過(guò)夜。使用冷凍干燥機(jī)將材料在低溫、真空狀態(tài)下進(jìn)行冷凍干燥。用0.1%NaOH溶液對(duì)材料進(jìn)行中和，去離子水反復(fù)清洗以去除多余的鹽分，再次凍干備用。

按不同LAP 濃度進(jìn)行分組，即CS 組（未添加LAP）、1% LAP/CS 組、3% LAP/CS 組、5% LAP/CS組、7% LAP/CS 組、10% LAP/CS 組，同時(shí)設(shè)未添加支架材料的空白對(duì)照組。

1.2 人牙周膜干細(xì)胞的分離培養(yǎng)

收集因正畸治療需要被拔除的離體前磨牙{倫理審查編號(hào)：2018 年倫申[科]第（914）號(hào)}?；颊呒{入標(biāo)準(zhǔn)：（1）無(wú)牙周系統(tǒng)疾病，牙齒無(wú)齲壞，無(wú)根尖病變；（2）牙齒被完整拔除；（3）年齡12～18 歲。本研究所有患者及家屬均知情同意。采用組織塊法[12]分離培養(yǎng)人牙周膜干細(xì)胞（human periodontal ligament stem cells，hPDLSC），進(jìn)行細(xì)胞傳代，取第3 代hPDLSC作為種子細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 納米復(fù)合支架的理化性能檢測(cè)

1.3.1 形貌觀察 將制備好的各組材料進(jìn)行噴金鍍膜，用掃描電鏡（SEM，日本，Hitachi SU8220）觀察材料表面形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.3.2 材料元素分析 X 線能譜分析（energy dispersive X-ray，EDX）觀察材料的硅、鎂、氧、鈉等元素的分布情況。

1.3.3 支架材料的吸水性 每組支架材料采用專用模具制備成直徑為15 mm、高度為2 mm 的圓柱形材料，稱量干燥的支架重量，記為Wd，浸泡于5 mL去離子水中，次日取出，用濾紙吸干表面水分，稱量支架的濕重，記為Ws。計(jì)算支架的吸水率，即（Ws-Wd）/Wd×100%。

1.3.4 支架材料的降解率 取各組制備好的支架材料，用萬(wàn)分之一天平進(jìn)行稱重，初始質(zhì)量記為W1；然后將支架材料浸泡于5 mL PBS 溶液中，37 ℃、100 r/min 持續(xù)振搖，去離子水沖洗，冷凍過(guò)夜、干燥，用萬(wàn)分之一天平進(jìn)行稱重，質(zhì)量記為W2。計(jì)算材料的降解率，即（W1-W2）/W1×100%。

1.3.5 支架的細(xì)胞毒性 首先制備LAP/CS支架材料的浸提液：在超凈工作臺(tái)中將消毒好的支架材料置于無(wú)菌12孔板中，加入細(xì)胞培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)箱中靜置過(guò)夜，即可得到材料的浸提液。取hPDLSC，按2×103個(gè)/孔的密度接種在96 孔板中，分組處理后，培養(yǎng)24 h，加入浸提液，空白對(duì)照組僅加入含10%血清的普通培養(yǎng)基，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。分別在1 d、3 d、5 d、7 d采用CCK8法檢測(cè)支架材料對(duì)hPDLSC的毒性，用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處各孔的吸光度（OD）值。

1.3.6 支架對(duì)細(xì)胞的黏附能力 取hPDLSC，按2×104個(gè)/孔的密度接種于LAP/CS納米復(fù)合支架上，細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)2 h后加入培養(yǎng)基。次日去除培養(yǎng)基，PBS 清洗，胰蛋白酶消化、計(jì)數(shù)。計(jì)算細(xì)胞黏附率，即黏附細(xì)胞數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%。

細(xì)胞接種后置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24 h，去除培養(yǎng)基，PBS清洗，4%多聚甲醛固定30 min，置于-20 ℃冰箱中，次日使用冷凍干燥機(jī)進(jìn)行干燥，噴金鍍膜后在電鏡下觀察細(xì)胞在材料上的黏附情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 24.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 支架形貌

肉眼觀察（圖1）各組支架，表現(xiàn)為多孔海綿狀結(jié)構(gòu)，CS 組顏色較LAP/CS 組偏黃，呈黃白色。LAP/CS組支架呈白色疏松多孔的海綿狀結(jié)構(gòu)。電鏡觀察支架的表面形態(tài)（圖2），各組支架均表現(xiàn)為疏松多孔結(jié)構(gòu)，各孔隙之間相互連通。

圖1 不同支架形貌大體觀

圖2 電鏡觀察LAP/CS支架形貌（×200）

2.2 EDS元素分析

各組支架分布著氧、鈉、鎂、硅等元素。CS組大部分為氧元素，幾乎不含鎂、硅元素。LAP/CS各組鎂、硅元素含量較高。各組材料元素的平面分布見圖3。

圖3 元素分布平面圖

2.3 支架材料的吸水率與降解率

CS 組吸水率和降解率最高，隨著LAP 含量升高，支架材料的吸水率和降解率均下降；CS 組吸水率超過(guò)600%，其余各組吸水率均低于CS組；在18 d時(shí)CS 組、LAP/CS 組、3% LAP/CS 組、5% LAP/CS組、7% LAP/CS 組、10% LAP/CS 組降解率分別為12.96%、9.96%、9.56%、8.62%、7.05%、6.85%，見圖4。

圖4 支架材料吸水率和降解率

2.4 支架材料的細(xì)胞相容性

2.4.1 各組支架材料對(duì)hPDLSC 的毒性 在1 d、3 d、5 d、7 d 時(shí)各組OD 值比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表明各組支架材料無(wú)細(xì)胞毒性，見圖5。

圖5 CCK8細(xì)胞毒性檢測(cè)

2.4.2 細(xì)胞黏附能力 掃描電鏡下可見CS 組支架孔徑較小，表面黏附凝聚成團(tuán)狀的細(xì)胞；添加了LAP的支架孔徑相對(duì)較多，在孔徑之間的材料表面可見細(xì)胞均勻分散，局部可見細(xì)胞聚集成團(tuán)，亦可見多處單個(gè)細(xì)胞分布，細(xì)胞的分散性優(yōu)于CS 組。1% LAP/CS 組、3% LAP/CS 組、5% LAP/CS 組細(xì)胞較少且分散，而7%LAP/CS組、10%LAP/CS組細(xì)胞較多且密集。

1% LAP/CS 組細(xì)胞黏附率為72.22%，低于CS組的86.11%；5% LAP/CS 組和7% LAP/CS 組細(xì)胞黏附率分別為94.44%和97.22%，均高于CS 組；3%LAP/CS 組、10% LAP/CS 組細(xì)胞黏附率分別為88.89%、90.02%，與CS 組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖6。

圖6 細(xì)胞黏附情況

3 討論

支架材料修復(fù)組織缺損時(shí)承擔(dān)恢復(fù)缺損組織形態(tài)，提供臨時(shí)機(jī)械性能和傳遞生物因子等作用[13]。具有多孔結(jié)構(gòu)的支架材料可提供細(xì)胞黏附生長(zhǎng)的空間，有利于細(xì)胞的黏附和遷移，為細(xì)胞外基質(zhì)的形成提供模板，也為再生的組織提供結(jié)構(gòu)支持[14]。本研究中，添加了LAP 的支架具有網(wǎng)格狀的結(jié)構(gòu)，這種網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)提供了種子細(xì)胞生長(zhǎng)和黏附的空間。

鎂元素被證明與骨的代謝密切相關(guān)，Mg2+可通過(guò)多種途徑影響成骨與破骨的作用[15]。Mg2+可通過(guò)多種途徑調(diào)控成骨分化，包括增強(qiáng)細(xì)胞的黏附和增殖功能，促進(jìn)細(xì)胞的成骨分化[16-17]。研究表明，以LAP 制備的支架材料在作用過(guò)程中可緩慢釋放一定量的Mg2+，通過(guò)Mg2+激活細(xì)胞成骨分化，從而促進(jìn)成骨效果[18]。本研究結(jié)果表明，LAP/CS支架含有鎂元素，進(jìn)一步提示本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建新型支架材料可能具有誘導(dǎo)干細(xì)胞成骨分化的潛能。

良好的吸水性可充分保證支架材料對(duì)培養(yǎng)基及生長(zhǎng)因子等物質(zhì)的吸附能力，為細(xì)胞在材料上生長(zhǎng)及植入體內(nèi)提供有利的條件[19]。CS 基復(fù)合材料可維持較高的吸水率，同時(shí)延緩材料的降解率，提高機(jī)械性能，如CS-納米羥基磷灰石、CS-明膠復(fù)合物等[20-21]。CS 組支架表現(xiàn)出較高的吸水率，添加LAP 后復(fù)合支架的吸水率稍有降低，但仍保持在400%以上，表明LAP/CS 支架仍具有良好的吸水性。

骨組織工程支架材料的降解率與成骨的過(guò)程密切相關(guān)，過(guò)快的降解速率無(wú)法為新骨的形成提供支持作用，過(guò)慢的降解率則可能會(huì)限制新生骨組織的生長(zhǎng)空間[22-23]。本研究材料降解實(shí)驗(yàn)證明LAP/CS支架材料在18 d時(shí)的降解率約10%左右，為緩慢降解型材料。CS組降解率較添加了LAP的各組降解率稍快，可能原因是LAP 與CS 相互作用形成的三維多孔結(jié)構(gòu)具有較高的穩(wěn)定性，使其降解速率降低。LAP/CS 支架的降解率較低，可能導(dǎo)致在體內(nèi)成骨過(guò)程中影響新生骨組織的生長(zhǎng)。

良好的生物安全性和細(xì)胞相容性是支架材料最基本的性能要求。本研究CCK8 實(shí)驗(yàn)證明LAP/CS納米復(fù)合支架無(wú)細(xì)胞毒性，細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)和掃描電鏡觀察均可證明LAP/CS支架具有良好的細(xì)胞黏附能力，表明支架具有較好的細(xì)胞相容性。

綜上，LAP/CS 納米復(fù)合支架的制備方法較為簡(jiǎn)單，具有多孔結(jié)構(gòu)，良好的吸水性，含成骨相關(guān)的微量鎂元素，體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明LAP/CS 支架具有良好的細(xì)胞相容性，具備成骨誘導(dǎo)支架材料的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。但該支架材料的降解率較低，仍待進(jìn)一步研究如何改良支架材料的降解率，以提升支架的骨傳導(dǎo)性能。