龜齡集膠囊對(duì)SAMP8小鼠不同組織MDA、SOD、GSH-PX及端粒酶的影響*

陳慧琴 李璽 權(quán)乾坤 李明

(1.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院，陜西 西安 710004；2.西安市人民醫(yī)院，陜西 西安 725000)

龜齡集創(chuàng)見(jiàn)于1541年明朝嘉靖年間宮廷御方，其具有延年益壽、強(qiáng)身補(bǔ)腦、固腎補(bǔ)氣、增進(jìn)食欲之功效，臨床主要用于腎虧陽(yáng)弱、記憶減退、夜夢(mèng)精溢、腰酸腿軟、氣虛咳嗽、五更溏瀉、食欲不振等癥[1]，在《中國(guó)長(zhǎng)壽大辭典》中龜齡集列益壽強(qiáng)身內(nèi)服藥之首，是著名的抗衰老處方[2]。楊小玲等[3]研究表明龜齡集可延緩D-半乳糖致衰老模型大鼠的自主活動(dòng)，改善大鼠的衰老行為。趙思俊等[4]研究證實(shí)龜齡集能明顯改善衰老引起的學(xué)習(xí)記憶功能減退，同時(shí)在提高免疫、改善生殖、保護(hù)肝臟方面也具有一定作用。張志偉等[5]從實(shí)驗(yàn)研究及臨床研究?jī)煞矫婵偨Y(jié)了龜齡集的研究現(xiàn)狀，其作用涉及延緩中樞神經(jīng)衰老、增強(qiáng)記憶及識(shí)別能力、鎮(zhèn)靜安神、抗癲癇、護(hù)肝、增強(qiáng)心肌收縮力、增強(qiáng)非特異性免疫功能和特異性免疫功能等。

抗衰老是龜齡集主要功效之一，然而目前關(guān)于龜齡集抗衰老的作用機(jī)制還不完全明了。本研究通過(guò)觀察龜齡集膠囊對(duì)SAMP8小鼠心、肝、腎、腦不同組織丙二醛(Malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(Glutathione peroxidase，GSH-Px)水平及端粒酶活性的影響，以探討研究龜齡集抗衰老的作用機(jī)制。

1 儀器與材料

1.1儀器 DH36001B電熱恒溫培養(yǎng)箱(天津泰斯特公司)；DZKW-4電子恒溫水浴鍋(上?？莆龉?；UV752紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)(湖南湘儀公司)；NANO 2000紫外分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo公司)；Exicycler TM 96 Real Time 96熒光定量PCR儀(韓國(guó)BIONEER公司)。

1.2試藥 龜齡集膠囊(批號(hào)20151108)，由山西廣譽(yù)遠(yuǎn)國(guó)藥有限公司提供；MDA檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)WLA048)；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(WLA004a)；SOD活性檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)WLA110 )；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(貨號(hào)WLA004)、GSH-Px 活性檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)WLA107)購(gòu)自沈陽(yáng)wanleibio公司; TRIpure(貨號(hào)RP1001)、Super M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶(貨號(hào)PR6502)、RNase inhibitor(貨號(hào)RP5602)購(gòu)自北京BioTeke公司；2×Taq PCR MasterMix(貨號(hào)PC1150)、SYBR Green(貨號(hào)SY1020)購(gòu)自北京Solarbio公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR端粒酶檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)KGA1028M)購(gòu)自江蘇KeyGEN公司。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 加速老化小鼠模型(SAMP8小鼠)是一個(gè)從普通的遺傳群AKR/J系小鼠中通過(guò)表型選擇培育出的加速老化小鼠，具有快速老化伴隨學(xué)習(xí)記憶功能障礙的特點(diǎn)，是目前研究衰老性認(rèn)知障礙較理想的動(dòng)物模型。同屬SAMR1表現(xiàn)為抗快速老化，具有正常的老化特性，常用作SAMP8小鼠的正常對(duì)照。本研究中SAMP8小鼠和SAMR1小鼠均購(gòu)自北京華阜康生物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK(京)2020-0004。其中SAMP8小鼠32只，SAMR1小鼠8只，均為8月齡，雌雄各半，體重(30±5)g，均飼養(yǎng)在12 h 明暗交替、室溫23 ℃、相對(duì)濕度(50±10)%的環(huán)境中，允許自由地進(jìn)食和飲水。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1分組與給藥干預(yù) 將32只SAMP8小鼠按性別依據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為模型組、龜齡集低劑量組、中劑量組、高劑量組，每組8只，雌雄各半；8只SAMR1小鼠為對(duì)照組。適應(yīng)性喂養(yǎng)后，龜齡集低劑量組、中劑量組、高劑量組分別按0.125、0.25、0.5 g·(kg·d)-1劑量予以龜齡集膠囊灌胃，對(duì)照組和模型組小鼠灌服等體積的生理鹽水，干預(yù)持續(xù)28 d。干預(yù)結(jié)束后上述動(dòng)物經(jīng)水合氯醛腹腔麻醉后取心、肝、腎、腦組織用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2MDA、SOD、GSH-Px含量檢測(cè) 將各組心、肝、腎及腦組織勻漿后采用BCA法進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定，然后參照 MDA、SOD、GSH-Px檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)MDA含量及SOD、GSH-Px活性，最后采用紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)檢測(cè)各組樣本吸光度OD值。檢測(cè)結(jié)果計(jì)算：MDA含量(nmol·mgprot-1)=[(測(cè)定OD值-對(duì)照OD值)/(標(biāo)準(zhǔn)OD值-空白OD值)]×標(biāo)準(zhǔn)管濃度(10 nmol·mL-1)/待測(cè)勻漿蛋白濃度(mgprot·mL-1)；SOD活力(U·mgprot-1)=[(對(duì)照OD值-測(cè)定OD值)/ 對(duì)照OD值]/50%×[反應(yīng)液總體積(mL)/取樣量(mL)]/待測(cè)樣本蛋白濃度(mgprot·mL-1)；GSH-Px酶活力(U·mgprot-1)=[(非酶管OD值-酶管OD值)/(標(biāo)準(zhǔn)OD值-空白OD值)]×標(biāo)準(zhǔn)管濃度(20 μmol·L-1)×稀釋倍數(shù)/反應(yīng)時(shí)間/樣本蛋白含量(mg·mL-1)。

2.3端粒酶活性檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR端粒酶檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組小鼠心、肝、腎及腦組織端粒酶活性。首先采取TRIpure法提取心、肝、腎及腦樣本組織總RNA，使用紫外分光光度計(jì)測(cè)定各樣本中RNA的濃度。參照說(shuō)明書(shū)在PCR儀進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：將提取的RNA及oligo(dT)15、random、ddH2O加入無(wú)核酸酶的離心管，70 ℃加熱5 min，冰上冷卻2 min，離心后加入dNTP、5×Buffer、Rnase inhibitor、Super M-MLV，25 ℃溫浴10 min，42 ℃溫浴50 min，最后80 ℃ 加熱10 min終止反應(yīng)，從而得到 cDNA樣本。然后在Exicycler PCR儀進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系：Maxima SYBR Green qPCR Master Mix(2×)10 μL、TERT-F/TERT-R Primer(10 μmol·L-1) 1 μL、GAPDH-F/GAPDH-R Primer(10 μmol·L-1)1 μL、Template DNA<500 ng，加入Water Nuclease-free至體系為20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min、95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。采用 2-△△ CT法分析熒光實(shí)時(shí)定量結(jié)果。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1對(duì)8月齡小鼠心、肝、腎、腦組織中MDA含量的影響 與對(duì)照組比較，模型組小鼠心、肝、腎、腦組織中MDA含量明顯升高(均P<0.05)；與模型組比較，龜齡集低、中、高劑量組小鼠心、肝、腎、腦組織中MDA含量均有不同程度下降(均P<0.05)，其中以龜齡集大劑量組下降最明顯(與龜齡集低、中劑量組比較，P<0.05)。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 對(duì)8月齡小鼠心、肝、腎、腦組織中MDA含量的影響

3.2對(duì)8月齡小鼠心、肝、腎、腦組織中SOD活性的影響 與對(duì)照組比較，模型組小鼠心、肝、腎、腦組織中SOD活性明顯下降(均P<0.05)；與模型組比較，龜齡集低、中、高劑量組小鼠心、肝、腎、腦組織中SOD活性均有不同程度升高(均P<0.05)，其中以龜齡集大劑量組升高最明顯(與龜齡集低、中劑量組比較，P<0.05),結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 對(duì)8月齡小鼠心、肝、腎、腦組織中SOD活性的影響

3.3對(duì)小鼠心、肝、腎、腦組織中GSH-Px酶活力的影響 與對(duì)照組比較，模型組小鼠心、肝、腎、腦組織中GSH-Px活性明顯下降(均P<0.05)；與模型組比較，龜齡集低、中、高劑量組小鼠心、肝、腎、腦組織中GSH-Px活性均有不同程度升高(均P<0.05)，其中以龜齡集大劑量組升高最明顯(與龜齡集低、中劑量組比較，P<0.05),結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 對(duì)8月齡小鼠心、肝、腎、腦組織中GSH-Px活性的影響

3.4對(duì)小鼠心、肝、腎、腦組織中端粒酶活力的影響 與對(duì)照組比較，模型組小鼠心、肝、腎、腦組織中端粒酶活性明顯下降(均P<0.05)；與模型組比較，龜齡集低、中、高劑量組小鼠心、肝、腎、腦組織中端粒酶活性均有不同程度升高(均P<0.05)，其中以龜齡集大劑量組升高最明顯(與龜齡集低、中劑量組比較，P<0.05),結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 對(duì)8月齡小鼠心、肝、腎、腦組織中端粒酶活性的影響

4 討論

衰老是指隨著機(jī)體年齡增長(zhǎng)逐漸出現(xiàn)生理功能、行動(dòng)能力、反應(yīng)能力等的衰退，組織結(jié)構(gòu)及器官功能等逐漸退化的不可逆性現(xiàn)象[6]。目前研究認(rèn)為自由基與衰老密切相關(guān)。隨著年齡的增長(zhǎng)，自由基產(chǎn)生增多，清除能力卻下降，進(jìn)而導(dǎo)致體內(nèi)自由基過(guò)剩，從而促進(jìn)機(jī)體的衰老；而體內(nèi)氧自由基生成過(guò)多能誘發(fā)組織脂質(zhì)過(guò)氧化，從而引起細(xì)胞的破壞，最終導(dǎo)致機(jī)體衰老[7]。SAMP8小鼠具有快速老化伴隨學(xué)習(xí)記憶功能障礙的特點(diǎn),表現(xiàn)為全面的腦病理變化，包括皮質(zhì)萎縮、神經(jīng)細(xì)胞丟失、神經(jīng)膠質(zhì)增生和血管損傷，是研究衰老性認(rèn)知障礙較理想的動(dòng)物模型。SAMR1小鼠表現(xiàn)為正常老化，通常作為SAMP8小鼠的正常對(duì)照[8]。故本研究選擇SAMP8及SAMR1小鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。

SOD是體內(nèi)一種清除氧自由基的酶，對(duì)機(jī)體的氧化與抗氧化平衡起著重要作用，是機(jī)體抗自由基損傷的重要防御機(jī)制，SOD通過(guò)催化超氧陰離子歧化為H2O2和O2，從而達(dá)到清除自由基、抗衰老的作用[7-9]。GSH-Px是機(jī)體另一種抗氧化的重要酶，其能催化還原型谷胱甘肽(Glutathione，GSH)還原脂質(zhì)氫過(guò)氧化物成羥基化合物，從而清除自由基，發(fā)揮抗氧化作用[10-11]。研究證實(shí)SOD和GSH-Px的活性均隨著年齡增長(zhǎng)而減弱，二者是評(píng)價(jià)衰老的重要指標(biāo)[10-11]。本研究發(fā)現(xiàn)在快速老化小鼠的心、肝、腎及腦組織SOD活性及GSH-Px活性下降，再次證明SOD及GSH-Px與衰老有密切關(guān)系。本研究通過(guò)龜齡集干預(yù)后，快速老化小鼠不同組織SOD活性及GSH-Px活性均增加，與模型組比較，龜齡集低、中、高劑量組優(yōu)于模型組(均P<0.05)，表明龜齡集可能通過(guò)上調(diào)SOD活性及GSH-Px活性，通過(guò)清除氧自由基，發(fā)揮其抗衰作用機(jī)制。

MDA 是體內(nèi)脂褐素形成的中間產(chǎn)物，隨著年齡的增長(zhǎng)而升高，其能間接反映機(jī)體內(nèi)的脂質(zhì)過(guò)氧化水平，反映機(jī)體內(nèi)自由基的產(chǎn)生情況和機(jī)體組織細(xì)胞的脂質(zhì)過(guò)氧化程度，在老年色素類(lèi)生物垃圾以及與衰老相關(guān)的蓄積產(chǎn)物的形成過(guò)程中起著核心作用[9-12]。MDA既是評(píng)價(jià)衰老的重要指標(biāo)之一，又可反映組織氧化的程度。本研究發(fā)現(xiàn)在快速老化小鼠心、肝、腎及腦組織MDA含量增加，通過(guò)龜齡集干預(yù)后可以降低MDA含量。

端粒是染色體末端一段由短的重復(fù)的非編碼DNA序列組成的一段特殊DNA，其主要作用是保持染色體結(jié)構(gòu)的完整性，從而維持基因組的穩(wěn)定性[12]。端粒的主要功能包括：特殊結(jié)構(gòu)保護(hù)染色體末端[13]，緩沖保護(hù)防止染色體復(fù)制時(shí)末端丟失[14]，端粒DNA與核基質(zhì)蛋白固定染色體的位置[15]，端粒長(zhǎng)度決定細(xì)胞的壽命[16]。端粒酶是一種具有端粒末端轉(zhuǎn)移功能的核糖核酸蛋白復(fù)合物，它以自身的RNA為模板，在染色體末端加入多個(gè)重復(fù)的TTAGGG六聚體，能維持細(xì)胞分裂過(guò)程中丟失的染色體端粒區(qū)域[17]。研究證實(shí)端粒在人的正常體細(xì)胞中長(zhǎng)度是有限的，隨著細(xì)胞分裂次數(shù)的增多和年齡的增長(zhǎng)，端粒會(huì)逐漸縮短，當(dāng)端?？s短到不足以維持細(xì)胞分裂時(shí)，便會(huì)終止細(xì)胞分裂，細(xì)胞便會(huì)自然衰老死亡。端粒酶有維持端粒長(zhǎng)度的作用，當(dāng)細(xì)胞中端粒酶活性重新激活時(shí)細(xì)胞便成為永生化細(xì)胞從而進(jìn)入無(wú)限增殖分裂過(guò)程[18]。已證實(shí)絕大多數(shù)永生化細(xì)胞系中檢測(cè)到較高的端粒酶活性[19]。端粒酶不但可以使細(xì)胞永生化，也能防止或逆轉(zhuǎn)衰老細(xì)胞生理功能的喪失，而不會(huì)引起與癌相關(guān)的其他改變，此外，端粒酶在保持基因組完整、潛在的繼續(xù)增殖能力和細(xì)胞長(zhǎng)期活性等方面也具有重要作用。本研究結(jié)果顯示龜齡集可以提高快速老化小鼠不同器官組織下降的端粒酶活性，證實(shí)了龜齡集對(duì)端粒酶的影響。但是關(guān)于龜齡集影響端粒酶活性的機(jī)制目前還不清楚，未來(lái)將開(kāi)展相關(guān)研究進(jìn)一步探討該問(wèn)題。

總之，本研究證實(shí)龜齡集膠囊能有效降低SAMP8小鼠心、肝、腎及腦組織MDA含量，提高SOD、GSH-PX及端粒酶活性，通過(guò)清除氧自由基，從而發(fā)揮抗衰老作用，這為臨床應(yīng)用其抗衰老治療提供了理論依據(jù)。