椰毒假單胞菌酵米面亞種在濕米粉及其原料中的生長產(chǎn)毒規(guī)律及風(fēng)險(xiǎn)分析

陳榮橋，陳漢金，胡均鵬，冼燕萍，吳玉鑾，梁明，侯向昶，王莉

（廣州質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)研究院，廣州市食品安全風(fēng)險(xiǎn)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)與預(yù)警研究中心，廣州市食品安全檢測(cè)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 511447）

椰毒假單胞菌為革蘭氏陰性短桿菌，易在食品表面生長，最佳生長溫度為36 ℃，最佳產(chǎn)毒溫度為26 ℃，主要產(chǎn)生劇毒毒素米酵菌酸，米酵菌酸通過作用細(xì)胞線粒體膜，抑制線粒體中腺嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)位酶，影響細(xì)胞正常代謝[1-3]。米酵菌酸耐高溫，無法通過烹煮消除其毒性。人或動(dòng)物誤食含有米酵菌酸食物后，米酵菌酸會(huì)快速的損害肝腎功能，進(jìn)而導(dǎo)致全身多臟器的衰竭，最終導(dǎo)致死亡[4,5]。米酵菌酸中毒發(fā)病潛伏期一般為30 min～12 h，少數(shù)長達(dá)1～2 d，主要表現(xiàn)為上腹部不適、惡心、嘔吐、腹瀉、頭痛、全身無力，輕則腹瀉、重則休克死亡，至今尚無有效解毒藥[4]，事故死亡率很高，某些案例死亡率高達(dá)100%[6]。

20世紀(jì)30年代荷蘭學(xué)者首次在椰子制品中分離出椰毒假單胞菌[7]，此后非洲和我國分別在發(fā)酵玉米粉飲品和酵米面中毒事件的相關(guān)樣品中分離出了椰毒假單胞菌和檢出米酵菌酸[8,9]。2018年以前我國引起米酵菌酸中毒的食品主要有酵米面、糯米粉、吊漿粑、浸泡的木耳和銀耳等[10-14]，均為家庭自制食品。2018年和2020年，廣東發(fā)生了多起因食用企業(yè)生產(chǎn)的濕米粉引起米酵菌酸中毒事件[15,16]，導(dǎo)致多人死亡。在濕粉相關(guān)污染研究中，發(fā)現(xiàn)生產(chǎn)濕米粉的原料米中椰毒假單胞菌的檢出率為7.7%[17]，是主要污染源，并建立了靈敏準(zhǔn)確的、適用于米和濕米粉基質(zhì)中痕量米酵菌酸的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法[18]，以及研究了浸洗米工藝對(duì)椰毒假單胞菌的去除作用[19]等。此外，目前相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道主要集中在研究毒素生物合成基因簇的進(jìn)化和形成過程[20]、市售米面制品、淀粉及其制品中椰毒假單胞菌的污染情況調(diào)研[15]等，缺少椰毒假單胞菌污染原料米、米漿和濕米粉后的生長與產(chǎn)毒規(guī)律研究，導(dǎo)致從工廠防控到政府監(jiān)管缺乏科學(xué)的理論指導(dǎo)。

因此，本研究根據(jù)濕米粉的生產(chǎn)工藝，通過在原料米、浸泡后濕米、米漿和濕米粉中接入不同濃度椰毒假單胞菌，考察不同培養(yǎng)溫度和時(shí)間下椰毒假單胞菌的生長與產(chǎn)毒規(guī)律，并進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)分析，為企業(yè)和監(jiān)管部門進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)防控提供科學(xué)技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 菌株

實(shí)驗(yàn)用2株菌株編號(hào)為S12-7和L2-2，從2個(gè)不同產(chǎn)地的濕米粉原料米中分離得到[17]，并根據(jù)GB/T 4789.29-2003《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 椰毒假單胞菌酵米面亞種檢驗(yàn)》，經(jīng)過viteck 2 compact和毒性試驗(yàn)鑒定為椰毒假單胞菌。

1.2 原料

原料米樣品采自濕粉生產(chǎn)企業(yè)[17]，米漿和濕米粉樣品通過該原料米樣品自制。

1.3 試劑與設(shè)備

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；米酵菌酸標(biāo)準(zhǔn)品（1 mg/mL），Sigma Aldrich；甲醇和乙腈（HPLC級(jí)），德國Merck公司；甲酸（HPLC級(jí)），德國CNW公司；氨水（分析純），廣州化學(xué)試劑廠；MAX固相萃取小柱（6 mg/3 mL），Waters公司；超純水（18.2 MΩ·cm），實(shí)驗(yàn)室Milli-Q自制。

生物安全柜，Thermo Scientific；高壓滅菌鍋，Hirayama HVE 50；恒溫培養(yǎng)箱，Binder；天平，PL6001E；移液槍，transfepette；ACQUITYTM超高效液相色譜儀和Waters XevoTMTQ MS三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，Waters公司；FE28-Standard pH計(jì)，METTLER TOLEDO。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 濕米、米漿和濕米粉的制備

模擬企業(yè)生產(chǎn)濕米粉工藝，選擇同一批次原料米制備浸泡后濕米、米漿和濕米粉樣品。稱取1000 g米于2500 mL燒杯中，加入1500 mL水浸泡1 h，棄去浸泡液，再用1500 mL水沖洗1次，棄去沖洗液，最后加入1500 mL水，將米和水置于磨漿機(jī)中研磨成米漿，混勻并調(diào)節(jié)米漿波美度至16～16.5。獲得濕米和米漿樣品。由于米、濕米和米漿在高壓滅菌后會(huì)發(fā)生很大的性狀改變，因此采用不滅菌進(jìn)行接種實(shí)驗(yàn)。

取適量米漿平鋪于蒸煮平板，厚度約為2 mm，沸騰蒸汽蒸煮2 min成型，冷卻后切成1×1 cm的濕米粉方塊，重復(fù)制備，約制得500 g濕米粉樣品。將濕米粉樣品放置于高壓滅菌鍋中121 ℃滅菌20 min，待接種實(shí)驗(yàn)。

1.4.2 樣品接入椰毒假單胞菌與培養(yǎng)

分別挑取菌株L2-2和S12-7于滅菌生理鹽水中渦旋震蕩，配制比濁度為1.8～2.2的菌懸液，再通過梯度稀釋法將菌懸液稀釋成7個(gè)梯度。各選取三種濃度（103cfu/mL、105cfu/mL和107cfu/mL）的菌液進(jìn)行后續(xù)接種操作。

（1）濕米粉接種組

1）接種試驗(yàn)A：分別稱取6組（編號(hào)為A1、A2.....A6）、每組20份（2 g/份）滅菌后的濕米粉樣品于50 mL無菌離心管中，在A1和A2組、A3和A4組、A5和A6組分別接入濃度為103cfu/mL、105cfu/mL、107cfu/mL的L2-2菌株懸液200 μL，把A1、A3和A5組放置在36 ℃恒溫培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)5 d，把A2、A4和A6組放置在26 ℃恒溫培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)5 d，培養(yǎng)濕度為40%～65%，每天從每組樣品中取出4份樣品，其中2份用于檢測(cè)米酵菌酸含量、2份用于菌落計(jì)數(shù)。研究不同污染水平、不同培養(yǎng)溫度和時(shí)間下濕米粉中椰毒假單胞菌的生長和產(chǎn)米酵菌酸的規(guī)律。

2）濕米粉空白對(duì)照組：稱取2組各10份（2 g/份）濕米粉樣品，分別加入200 μL滅菌生理鹽水作為空白對(duì)照組。將兩組樣品分別放置于26 ℃和36 ℃恒溫培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)5 d，培養(yǎng)濕度為40%～65%，每天各組取2份，分別做米酵菌酸檢測(cè)和菌落計(jì)數(shù)。

3）接種試驗(yàn)B：稱取24份（2 g/份）滅菌后濕米粉樣品于50 mL無菌離心管中，接入濃度為105cfu/mL的L2-2菌株懸液200 μL，放置于4 ℃冰箱中連續(xù)培養(yǎng)6 d，每天取出2份檢測(cè)米酵菌酸含量，第6 d結(jié)束時(shí)將剩余樣品中的6份放置于26 ℃恒溫培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)3 d，另外6份樣品放置于36 ℃恒溫培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)3 d，培養(yǎng)濕度為40%～65%，每天各取2份檢測(cè)米酵菌酸。研究低溫冷藏、最佳生長溫度和最佳產(chǎn)毒溫度對(duì)濕米粉中椰毒假單胞菌產(chǎn)毒的影響。

對(duì)于菌株S12-7，也按照上述相同步驟進(jìn)行接種實(shí)驗(yàn)。

（2）米接種組

1）接種試驗(yàn)C：分別稱取6組（編號(hào)為C1、C2…...C6）各4份（2 g/份）浸泡后濕米樣品和6組（編號(hào)為C7、C8.....C12）各4份（2 g/份）原料米樣品于50 mL無菌離心管中，在C1、C2、C7和C8組接入濃度為103cfu/mL的L2-2菌株懸液200 μL，在C3、C4、C9和C10組接入濃度為105cfu/mL的L2-2菌株懸液200 μL、在C5、C6、C11和C12組接入濃度為107cfu/mL的L2-2菌株懸液200 μL，把C1、C3、C5、C7、C9和C11組放置在36 ℃恒溫培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)2 d，把C2、C4、C6、C8、C10和C12組放置在26 ℃恒溫培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)2 d，培養(yǎng)濕度為40%～65%，每天從每組樣品中取出2份樣品，檢測(cè)米酵菌酸含量。研究不同污染水平、不同水分含量、不同培養(yǎng)溫度和時(shí)間對(duì)米中椰毒假單胞菌產(chǎn)毒的影響。

2）米空白對(duì)照組：分別稱取2組（編號(hào)為C13和C14）各2份（2 g/份）浸泡后濕米樣品和2組（編號(hào)為C15和C16）各2份（2 g/份）原料米樣品于50 mL無菌離心管中，加入200 μL滅菌生理鹽水作為空白對(duì)照組，把C13和C15組放置在36 ℃恒溫培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)2 d，培養(yǎng)濕度為40%～65%，把C14和C16組放置在26 ℃恒溫培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)2 d，每天各取1份檢測(cè)米酵菌酸。

3）接種試驗(yàn)D：稱取2組（編號(hào)為D1和D2）各26份（2 g/份）原料米樣品于50 mL無菌離心管中，接入105cfu/mL的L2-2菌液200 μL，把D1組放置在36 ℃恒溫培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)35 d，把D2組放置在26 ℃恒溫培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)35 d，培養(yǎng)濕度為40%～65%，定期各取2份檢測(cè)米酵菌酸。考察被椰毒假單胞菌污染的原料米在長時(shí)間存放過程中米酵菌酸含量的變化規(guī)律。

對(duì)于菌株S12-7，也按照上述相同步驟進(jìn)行接種實(shí)驗(yàn)。

（3）米漿接種組

1）接種試驗(yàn)E：分別稱取6組（編號(hào)為E1、E2......E6）各4份（2 g/份）波美度為16.5的米漿樣品于50 mL無菌離心管中，在E1和E2組接入濃度為103cfu/mL的L2-2菌株懸液200 μL、在E3和E4組接入濃度為105cfu/mL的L2-2菌株懸液200 μL、在E5和E6組接入濃度為107cfu/mL的L2-2菌株懸液200 μL，把E1、E3和E5組放置在36 ℃恒溫培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)2 d，把E2、E4和E6組放置在26 ℃恒溫培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)2 d，培養(yǎng)環(huán)境濕度為40%～65%，每天各取出2份檢測(cè)米酵菌酸。研究不同污染水平、不同培養(yǎng)溫度和時(shí)間下米漿中椰毒假單胞菌的產(chǎn)毒規(guī)律。

菌株S12-7按以上試驗(yàn)方法同樣處理。

2）米漿空白對(duì)照組：稱取米漿樣品2組各2份（2 g/份）于50 mL無菌離心管中，加入200 μL滅菌生理鹽水作為空白對(duì)照組，將兩組樣品分別放置在26 ℃和36 ℃恒溫培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)2 d，培養(yǎng)環(huán)境濕度為40%～65%，每天各組取1份檢測(cè)米酵菌酸。

1.4.3 椰毒假單胞菌的計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)

按照GB 4789.2-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》對(duì)菌落總數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.4.4 米酵菌酸的測(cè)定

米酵菌酸測(cè)定：首先采用100 ℃蒸汽對(duì)各培養(yǎng)后樣品滅菌30 min，再參考GB 5009.189-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中米酵菌酸的測(cè)定》進(jìn)行樣品前處理，采用液相色譜-質(zhì)譜法對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)[17]，方法檢出限為0.2 μg/kg。

1.4.5 樣品中水分含量的測(cè)定

參考GB 5009.3-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測(cè)定》，稱取原料米、浸泡后濕米、米漿、濕米粉各2～10 g，采用直接干燥法測(cè)定水分，平行試驗(yàn)2次。

1.4.6 米漿pH值的測(cè)定

按1.4.2中米漿的接種濃度，配制三種接種濃度的米漿各2份（100 mL/份），混勻后采用pH計(jì)測(cè)量米漿初始pH值，然后，每種接種濃度各取1份分別放置于26 ℃和36 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，測(cè)量培養(yǎng)24 h和48 h時(shí)米漿的pH值。

1.4.7 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)圖片均采用origin 2021進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 試樣的水分含量

濕米粉水分含量為60.1%，符合廣東省食品安全地方標(biāo)準(zhǔn)DBS44/ 012-2019《食品安全地方標(biāo)準(zhǔn) 濕米粉》規(guī)定的水分含量（≤70%）要求。原料米、浸泡后濕米、米漿的水分含量分別為11.83%、29.86%和68.39%。

2.2 椰毒假單胞菌在原料米和浸泡后濕米中的產(chǎn)毒規(guī)律

2.2.1 原料米存放過程中椰毒假單胞菌產(chǎn)毒規(guī)律

原料米中接入3種濃度椰毒假單胞菌在不同溫度/時(shí)間條件下培養(yǎng)產(chǎn)生的米酵菌酸量如表1所示。2株椰毒假單胞菌雖然來源于不同產(chǎn)地的米，但在同一條件下產(chǎn)生米酵菌酸的量差異不明顯，產(chǎn)毒能力表現(xiàn)相似，米酵菌酸的產(chǎn)量均與椰毒假單胞菌的量呈正相關(guān)，接種濃度為107cfu/mL時(shí)，米酵菌酸含量最高，在36 ℃和26 ℃兩種溫度下米酵菌酸含量可以達(dá)到216～865 μg/kg，是接種濃度為105cfu/mL時(shí)的25～135倍。由于米在接種前沒有滅菌，米樣中微生物體系復(fù)雜，可能含有與椰毒假單胞菌競爭生長或抑制椰毒假單胞菌產(chǎn)米酵菌酸的微生物，因此，在接種量較小時(shí)，椰毒假單胞菌可能難以成為優(yōu)勢(shì)菌，故米酵菌酸產(chǎn)量較少；當(dāng)接入椰毒假單胞菌量較大時(shí)，可能較易生長成為優(yōu)勢(shì)菌，從而產(chǎn)生較多的米酵菌酸。

表1 原料米中3種濃度菌株在不同溫度/時(shí)間條件下產(chǎn)米酵菌酸量Table 1 Bongkrek acid production of three concentration strains in rice with different temperature/time

表1數(shù)據(jù)顯示，在相同培養(yǎng)時(shí)間下，26 ℃的米酵菌酸含量高于36 ℃，這是因?yàn)橐炯賳伟淖罴旬a(chǎn)毒溫度為26 ℃，但椰毒假單胞菌在最佳生長溫度36 ℃下也同樣會(huì)產(chǎn)毒；在相同接種濃度和培養(yǎng)溫度下，米酵菌酸含量均隨時(shí)間呈增加趨勢(shì)，因此實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步考察了原料米被椰毒假單胞菌污染后長時(shí)間存儲(chǔ)過程中米酵菌酸含量變化規(guī)律（具體實(shí)驗(yàn)操作見1.4.2的米接種實(shí)驗(yàn)D）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2，2株菌株污染原料米后，在35 d的存儲(chǔ)過程中產(chǎn)毒表現(xiàn)基本一致，在2種溫度下米酵菌酸含量均低于20 μg/kg，且隨著存儲(chǔ)時(shí)間的延長并無明顯增長，這與本項(xiàng)目組前期在濕粉生產(chǎn)企業(yè)采集到的原料米中檢出的米酵菌酸含量水平基本一致[17]。米在種植過程中可能易受環(huán)境中椰毒假單胞菌污染，椰毒假單胞菌雖可以在米表面存活[17]，但推測(cè)可能由于米水分含量較少，質(zhì)構(gòu)致密，且微生物體系復(fù)雜，椰毒假單胞菌生長產(chǎn)毒能力可能受到抑制，所產(chǎn)生的米酵菌酸處于較低風(fēng)險(xiǎn)水平。

表2 原料米中接種105 cfu/mL后放置35 d米酵菌酸含量的變化Table 2 Changes of bongkrek acid content in rice with 105 cfu/mL strain during 35 days

2.2.2 椰毒假單胞菌在浸泡后濕米中的產(chǎn)毒規(guī)律

分別在浸泡1 h后濕米中接入3種濃度的2株椰毒假單胞菌，在不同溫度/時(shí)間培養(yǎng)下米酵菌酸檢出值如表3所示。由表3可見，2株椰毒假單胞菌在濕米中整體產(chǎn)米酵菌酸的趨勢(shì)與在干米中的趨勢(shì)類似，即米酵菌酸的含量與椰毒假單胞菌的量呈正相關(guān)、接種濃度為107cfu/mL時(shí)米酵菌酸含量最高、26 ℃時(shí)米酵菌酸含量高于36 ℃，但是，椰毒假單胞菌在濕米中米酵菌酸含量比在干米中高，接種濃度為107cfu/mL時(shí)米酵菌酸含量最高可達(dá)到14 mg/kg，這已是一個(gè)相當(dāng)高風(fēng)險(xiǎn)水平。推測(cè)可能由于濕米含水量（29.83%）比干米含水量（11.86%）高，米表面質(zhì)構(gòu)軟化，更利于椰毒假單胞菌生長繁殖，這可進(jìn)一步推測(cè)如果已被椰毒假單胞菌污染的原料米存放不當(dāng)，被雨淋或受潮，就有可能為椰毒假單胞菌生長繁殖創(chuàng)造了一個(gè)有利的環(huán)境，增加風(fēng)險(xiǎn)隱患，非洲發(fā)生的玉米粉飲品米酵菌酸中毒事件也主要是由于原料玉米粉在存放過程中曾被洪水浸泡[9]。由于濕米在26 ℃和36 ℃下存放2 d后已發(fā)生腐敗，本研究沒有開展長時(shí)間放置實(shí)驗(yàn)。

表3 浸泡后濕米中3種濃度菌株在不同溫度/時(shí)間條件下產(chǎn)生米酵菌酸的量Table 3 Bongkrek acid production of three concentration strains in soaked rice with different temperature/time

2.3 椰毒假單胞菌在米漿中的產(chǎn)毒規(guī)律

分別在米漿中接入3種不同濃度的2株椰毒假單胞菌，在不同溫度/時(shí)間培養(yǎng)下米酵菌酸含量如表4所示?？梢?，2株椰毒假單胞菌在米漿中整體產(chǎn)米酵菌酸的趨勢(shì)與在濕米、干米中的趨勢(shì)類似，即米酵菌酸的含量與椰毒假單胞菌的量呈正相關(guān)、接種濃度為107cfu/mL時(shí)米酵菌酸的含量最高、26 ℃時(shí)米酵菌酸含量高于36 ℃，但是，椰毒假單胞菌在米漿中米酵菌酸含量比在濕米和干米中高，接種濃度為105cfu/mL、培養(yǎng)48 h后米酵菌酸含量比在濕米和干米中的高一個(gè)數(shù)量級(jí)，接種濃度為107cfu/mL時(shí)米酵菌酸含量最高約為12 mg/kg，這已是較高風(fēng)險(xiǎn)水平。推測(cè)可能由于米漿水分含量高，且在性狀質(zhì)構(gòu)上比濕米和干米更適于椰毒假單胞菌生長繁殖，導(dǎo)致產(chǎn)生更多的米酵菌酸。

表4 米漿中菌株L2-2和S12-7在不同溫度和時(shí)間條件下產(chǎn)生米酵菌酸量Table 4 Bongkrek acid production of L2-2 and S12-7 strain in rice pulp with different temperature/time

本研究在不同pH值的培養(yǎng)基中接入椰毒假單胞菌進(jìn)行試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基pH≤4.5會(huì)抑制椰毒假單胞菌生長，培養(yǎng)基pH 3.8時(shí)椰毒假單胞菌基本不生長，這與趙夢(mèng)馨[21]和Buckle等[22]的研究結(jié)論一致。米漿中營養(yǎng)物質(zhì)豐富、微生物體系復(fù)雜，在室溫放置過程中，各種微生物易大量生長繁殖產(chǎn)酸，導(dǎo)致米漿pH值下降。本研究考察了接入不同濃度椰毒假單胞菌的米漿分別于36 ℃和26 ℃放置培養(yǎng)2 d的米漿pH值的變化情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5，可見米漿及接種后的米漿放置2 d后pH值的變化情況相似，26 ℃時(shí)pH值由原來的6.1下降到5.0左右，36 ℃時(shí)pH值下降略快，2 d后pH值下降到4.7左右，但這個(gè)pH值尚未對(duì)椰毒假單胞菌生長繁殖產(chǎn)生很大影響。因此，在濕米粉生產(chǎn)中，應(yīng)盡量阻遏原料米中可能存在的椰毒假單胞菌向下端工藝（浸泡米和米漿等）傳遞或交叉污染。

表5 米漿pH值隨溫度/時(shí)間的變化Table 5 Changes of rice pulp pH with temperature/time

2.4 椰毒假單胞菌在濕米粉中的生長產(chǎn)毒規(guī)律

2.4.1 椰毒假單胞菌在濕米粉中的生長規(guī)律

椰毒假單胞菌在濕米粉基質(zhì)中分別于26 ℃和36 ℃中培養(yǎng)5 d的生長規(guī)律如圖1所示?？梢?，不同濃度的菌株L2-2與菌株S12-6在濕米粉基質(zhì)中生長規(guī)律一致，均符合典型微生物的生長曲線[23]；24 h內(nèi)，椰毒假單胞菌在36 ℃的生長速度明顯快于26 ℃；接種濃度越高，椰毒假單胞菌越快達(dá)到穩(wěn)定期，接種濃度為107cfu/mL時(shí)，在24 h內(nèi)就可以達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)（109cfu/g～1010cfu/g）。

2.4.2 椰毒假單胞菌在濕米粉中的產(chǎn)毒規(guī)律

分別在濕米粉中接入3種濃度椰毒假單胞菌，在不同溫度/時(shí)間培養(yǎng)下米酵菌酸檢出值見表6?？梢姡瑵衩追壑忻捉途岷颗c椰毒假單胞菌的量呈正相關(guān)、與培養(yǎng)時(shí)間也呈正相關(guān)，26 ℃時(shí)米酵菌酸含量高于36 ℃，接種濃度為107cfu/mL、培養(yǎng)24 h后米酵菌酸含量最高可達(dá)30 mg/kg，遠(yuǎn)高于在米漿、濕米和干米中的含量。推測(cè)可能由于濕米粉水分含量高，表面粘性大，在性狀質(zhì)構(gòu)上比米漿、濕米和干米更利于椰毒假單胞菌生長繁殖，導(dǎo)致產(chǎn)生更多的米酵菌酸?！睹绹纠韺W(xué)手冊(cè)》研究表明，人體血液中米酵菌酸濃度達(dá)到200～300 μg/L時(shí)就可以中毒致死，一般成人的血液量相當(dāng)于人體重量的7%～8%，以60 kg體重計(jì)，若濕粉中含有約30 mg/kg米酵菌酸，則只需食用約50 g濕米粉就可以中毒身亡，且微生物在自然界通常表現(xiàn)為典型的群居特征，可能就是聚集在幾克或十幾克的食物范圍內(nèi)。因此，濕米粉被椰毒假單胞菌污染后，在較高室溫下放置較長時(shí)間后存在很大的食用中毒風(fēng)險(xiǎn)。

表6 濕米粉中菌株L2-2和S12-7產(chǎn)米酵菌酸量Table 6 Bongkrek acid production of L2-2 and S12-7 strain in rice noodle

有研究報(bào)道椰毒假單胞菌在4 ℃基本不生長。本研究進(jìn)一步考察了在濕米粉接種105cfu/mL后，置于4 ℃冷藏6 d再分別轉(zhuǎn)置于26 ℃和36 ℃培養(yǎng)3 d的米酵菌酸含量情況，結(jié)果如表7所示?？梢姡瑵衩追塾? ℃存放6 d中均未檢出米酵菌酸（方法檢出限為0.2 μg/kg）；將濕米粉轉(zhuǎn)置于36 ℃和26 ℃分別放置1 d后，開始檢出米酵菌酸，36 ℃放置2 d（即表7中8 d/36 ℃）檢出米酵菌酸含量最高約為38 mg/kg，26 ℃放置3 d（即表7中9d /26 ℃）檢出米酵菌酸含量最高約為6.84 mg/kg。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在較低溫度4 ℃以下可以抑制椰毒假單胞菌生長產(chǎn)毒，但若離開冷藏條件放置在室溫下，適宜的溫度就會(huì)促進(jìn)椰毒假單胞菌生長產(chǎn)毒，因此建議流通和消費(fèi)環(huán)節(jié)全程嚴(yán)格按照濕米粉產(chǎn)品保存條件存放，并在保質(zhì)期內(nèi)食用，避免存儲(chǔ)過程污染風(fēng)險(xiǎn)。

表7 濕米粉中椰毒假單胞菌（105 cfu/mL）在溫度變化過程中米酵菌酸含量變化Table 7 Bongkrek acid production changes of Pseudomonas cocovenenans subsp farinofermantans in rice noodle with temperature

3 結(jié)論

本研究采用在食物基質(zhì)中接入椰毒假單胞菌培養(yǎng)的方式進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明：（1）椰毒假單胞菌在濕米粉中的生長規(guī)律符合微生物生長模型，在2 d內(nèi)達(dá)到對(duì)數(shù)生長靜止期；椰毒假單胞菌在濕米粉及其原料米、濕米、米漿中產(chǎn)生米酵菌酸的量與椰毒假單胞菌的量呈正相關(guān)，與培養(yǎng)時(shí)間和食品水分含量也呈一定的正相關(guān)，米酵菌酸產(chǎn)量由高到低依次為濕米粉、米漿、濕米和原料米。（2）原料米接菌105cfu/mL、26 ℃和36 ℃培養(yǎng)35 d，期間米酵菌酸含量約在0.7～16 μg/kg，表明原料米被椰毒假單胞菌污染后，在干燥通風(fēng)條件下倉儲(chǔ)過程中產(chǎn)生米酵菌酸的量一般較低，風(fēng)險(xiǎn)較低；當(dāng)原料米浸泡后或磨成米漿后，水分含量增加，質(zhì)構(gòu)發(fā)生變化，這可能更有利于椰毒假單胞菌生長繁殖，產(chǎn)生更多米酵菌酸，增加風(fēng)險(xiǎn)隱患，故要盡量阻遏椰毒假單胞菌進(jìn)一步向濕米生產(chǎn)的下端工藝傳遞和交叉污染。（3）濕米粉被椰毒假單胞菌污染后，在低溫4 ℃以下冷藏可以抑制椰毒假單胞菌生長，在室溫或較高溫度下存放時(shí)椰毒假單胞菌則會(huì)快速生長繁殖并大量產(chǎn)毒，存在很高風(fēng)險(xiǎn)；椰毒假單胞菌在濕米粉基質(zhì)中產(chǎn)毒效率比在米漿、濕米和干米中的高（最高約5000多倍），這可能與濕米粉的水分含量、性狀質(zhì)構(gòu)以及微生物菌群等因素有關(guān)。因此，濕米粉的椰毒假單胞菌污染風(fēng)險(xiǎn)防控需從原料、生產(chǎn)、儲(chǔ)運(yùn)、經(jīng)營和消費(fèi)全鏈條來加強(qiáng)管控。