短波紫外發(fā)光二極管處理對(duì)脂環(huán)酸芽孢桿菌的滅活效果及作用機(jī)制

翟婭菲，田佳麗，石佳佳，相啟森，申瑞玲，王章存，李 可

（鄭州輕工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南省冷鏈?zhǔn)称焚|(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，食品生產(chǎn)與安全河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 鄭州 450001）

近年來，中國的果汁飲料市場發(fā)展快速，果汁飲料中豐富的維生素和生物活性化合物以及優(yōu)良的口感成為其吸引消費(fèi)者的主要原因[1]。但由脂環(huán)酸芽孢桿菌引起的果汁變質(zhì)在美國、澳大利亞等國相繼發(fā)生[2]。脂環(huán)酸芽孢桿菌是一種嗜酸、嗜熱、非致病性的革蘭氏陽性菌，能夠通過產(chǎn)生孢子來度過不利于營養(yǎng)細(xì)胞生長的時(shí)期，傳統(tǒng)的巴氏殺菌不能夠使其完全滅活[3]。尋找合適的殺菌方式以有效滅活脂環(huán)酸芽孢桿菌一直在不斷的探索中。

非熱殺菌技術(shù)由于其殺菌過程中的低溫特性，可以避免溫度對(duì)食品造成的不良影響，不僅能有效滅活微生物，而且能較大程度地保留食品固有的特質(zhì)[4-5]；因此，近年來在食品殺菌中備受關(guān)注。de Pascoli等[6]發(fā)現(xiàn)盾葉胡椒提取物可作為抑菌劑有效減少橙汁中初始脂環(huán)酸芽孢桿菌的數(shù)量。Porebska等[7]的研究表明，基于超高壓和溫?zé)幔?0 ℃）聯(lián)合處理的協(xié)同效應(yīng)對(duì)蘋果汁進(jìn)行殺菌后，蘋果汁中脂環(huán)酸芽孢桿菌孢子數(shù)量降低了3.7（lg（CFU/mL））。近年來出現(xiàn)的紫外殺菌技術(shù)也被認(rèn)為在食品工業(yè)中具有廣闊的應(yīng)用潛力。2000年，紫外光已被美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)作為巴氏殺菌的替代方法來處理新鮮果汁產(chǎn)品[8]。此外，紫外光已被印度和瑞士等一些國家批準(zhǔn)應(yīng)用于食品加工過程[9]。紫外發(fā)光二極管照射是近年來新興的一種非熱殺菌技術(shù)，與傳統(tǒng)的紫外汞燈相比具有可及時(shí)開關(guān)，無熱輻射、無汞、體積小、壽命長以及可發(fā)射特定波長的光的優(yōu)點(diǎn)，因此，在食品工業(yè)中具有更明顯的應(yīng)用潛力[10]。紫外發(fā)光二極管已經(jīng)被應(yīng)用于多種食品上多種微生物的滅活。使用波長為280 nm、照射劑量為720 mJ/cm2的短波紫外發(fā)光二極管（ultraviolet-C lightemitting diode，UVC-LED）分別處理蘋果濁汁和蘋果清汁，可使其中的Escherichia coliK12數(shù)量分別減少2、4.4（lg（CFU/mL））[11]。將波長為275 nm的UVC-LED應(yīng)用于蘋果汁和金槍魚的微生物安全控制中，當(dāng)照射劑量達(dá)到1 200 mJ/cm2時(shí)可使蘋果汁中的魯氏結(jié)合酵母降低5.64（lg（CFU/mL）），當(dāng)照射劑量達(dá)到4 000 mJ/cm2時(shí)，可使金槍魚表面的SalmonellaTyphimurium、Listeria monocytogenes以及Escherichia coliO157:H7數(shù)量分別減少1.31、1.86、1.77（lg（CFU/mL）），并且對(duì)蘋果汁和金槍魚的理化性質(zhì)無明顯影響[12-13]。

本課題組先前研究發(fā)現(xiàn)1 080 mJ/cm2UVC-LED（275 nm）處理可以有效滅活接種在橙汁中的脂環(huán)酸芽孢桿菌[14]，因此，本研究以純培養(yǎng)體系中的脂環(huán)酸芽孢桿菌為研究對(duì)象，評(píng)價(jià)照射劑量對(duì)滅活效果的影響，以及相同照射劑量對(duì)處于不同生長階段脂環(huán)酸芽孢桿菌的滅活作用，并通過分析蛋白、核酸的泄漏量，細(xì)胞膜的完整性，胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）累積水平以及處理后胞內(nèi)蛋白質(zhì)、DNA的損傷情況來探討脂環(huán)酸芽孢桿菌的滅活機(jī)理，以期為UVC-LED在食品工業(yè)中的應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脂環(huán)酸芽孢桿菌（Alicyclobacillus acidoterrestris）DSM 3922 廣東省微生物菌種保藏中心；BAT肉湯北京索萊寶科技有限公司；碘化丙啶（propidium iodide，PI）、2’,7’-二氯二氫熒光素二乙酸酯（2’,7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）、吖啶橙（acridine orange，AO） 生工生物工程股份有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UVC-LED設(shè)備（波長275 nm）由本實(shí)驗(yàn)室自制；NI-E熒光相差自動(dòng)顯微鏡 日本尼康公司；UV-1500紫外分光光度計(jì) 上海美析儀器有限公司；Spark多功能酶標(biāo)儀 瑞士Tecan公司；NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì) 美國Thermo?Fisher?Scientific公司；BWS465-785S便攜式拉曼光譜儀 美國B&W公司。

1.3 方法

1.3.1 菌懸液的制備

將甘油管保存的脂環(huán)酸芽孢桿菌按照1%（體積分?jǐn)?shù)）的接種量接種至50 mL BAT肉湯中，在45 ℃下?lián)u床振蕩培養(yǎng)（180 r/min，下同）29 h，取培養(yǎng)物于3 500hg下離心10 min，收集菌體。加入10 mL無菌生理鹽水重懸菌體，3 500hg離心10 min后收集菌體，按此方法清洗3 遍，然后用無菌生理鹽水將菌懸液濃度調(diào)整為106CFU/mL備用。

1.3.2 UVC-LED處理脂環(huán)酸芽孢桿菌

UVC-LED設(shè)備如圖1所示，發(fā)射峰值為275 nm的UVC-LED燈以8 行8 列的形式排布在22 cmh22 cm的集成板上。UVC-LED照射劑量為照射功率/（mW/cm2）和處理時(shí)間/s的乘積[13]，單位為mJ/cm2。由于照射功率（450 mW/cm2）固定不變，通過改變處理時(shí)間來控制照射劑量。

圖1 UVC-LED處理脂環(huán)酸芽孢桿菌示意圖Fig. 1 Schematic diagram of UVC-LED treatment of A. acidoterrestris

將盛有20 mL菌懸液（106CFU/mL）的培養(yǎng)皿用不同劑量（0（未處理組）、10、20、30、40、50 mJ/cm2）UVC-LED進(jìn)行照射處理，處理后的菌液用生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋（10、102、103、104），以未處理組為對(duì)照，選取100 μL各梯度的菌液均勻涂布于BAT固體培養(yǎng)基上，每個(gè)梯度設(shè)置3 個(gè)平行，45 ℃培養(yǎng)48 h進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.3 存活曲線的模擬

利用log-linear和Weibull模型對(duì)細(xì)菌的存活曲線進(jìn)行動(dòng)力學(xué)模擬[14]，log-liner模型見公式（1），Weibull模型見公式（2）。

式中：N為一定劑量UVC-LED處理后存活的細(xì)菌數(shù)量/（CFU/mL）；N0為處理前樣品中細(xì)菌數(shù)量/（CFU/mL）；E為處理劑量/（mJ/cm2）；k為失活系數(shù)；D為微生物數(shù)量減少90%所需的處理劑量（mJ/cm2）；δ代表微生物數(shù)量減少90%所需的處理劑量/（mJ/cm2）；p為形狀參數(shù)。

1.3.4 UVC-LED對(duì)處于不同生長階段的脂環(huán)酸芽孢桿菌的滅活作用測定

參照文獻(xiàn)[15]，將1.5 mL處于對(duì)數(shù)生長期的脂環(huán)酸芽孢桿菌培養(yǎng)液接種于50 mL BAT肉湯中，45 ℃下?lián)u床振蕩培養(yǎng)24 h，按照6%（體積分?jǐn)?shù)）的接種量添加至300 mL新鮮BAT肉湯中，于45 ℃下?lián)u床振蕩培養(yǎng)。脂環(huán)酸芽孢桿菌在生長過程中會(huì)經(jīng)歷一段時(shí)間的遲緩期，逐漸進(jìn)入對(duì)數(shù)期，最終達(dá)到穩(wěn)定期。因此在2、4、8、12、16、24、29、32、36、39 h測定菌液600 nm波長處光密度值OD600nm；分別在2、4、24、29、32 h收集30 mL菌液，于3 500hg下離心10 min收集菌體，加入10 mL無菌生理鹽水3 500hg離心10 min后收集菌體，按此方法清洗3 遍，用生理鹽水將菌懸液濃度調(diào)整為105CFU/mL，取10 mL制備好的菌懸液于培養(yǎng)皿中，按照1.3.2節(jié)方法用20 mJ/cm2劑量的UVC-LED處理菌懸液并進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，計(jì)算細(xì)菌的存活率（N/N0h100%）。

1.3.5 胞內(nèi)核酸和蛋白質(zhì)泄漏量的測定

分別取1 mL 1.3.2節(jié)不同劑量的UVC-LED處理后的菌液，于4 ℃、12 000 r/min離心5 min，收集上清液。用NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)分別在260 nm和280 nm波長處測定上清液的光密度值，計(jì)算核酸和蛋白質(zhì)的泄漏量，單位為μg/mL。

1.3.6 細(xì)胞膜損傷程度測定

分別取1 mL 1.3.2節(jié)不同劑量的UVC-LED處理后的菌液，于4 ℃、12 000 r/min離心5 min，棄去上清液。加入1 mL磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（0.1 mol/L、pH值為（7.2f0.2），后同）重懸菌體，4 ℃、12 000 r/min離心2 min后收集菌體，清洗兩遍后重懸于800 μL的PBS中，加入200 μL PI染液（3?μmol/L），室溫下避光反應(yīng)15 min，然后12 000 r/min離心2 min收集菌體。加入1 mL PBS重懸菌體，4 ℃、12 000 r/min離心2 min后收集菌體，洗滌3 次以去除未反應(yīng)的染液，最終將菌體懸于1 mL PBS中，在激發(fā)波長485 nm、發(fā)射波長635 nm條件下測定其熒光強(qiáng)度。細(xì)胞膜損傷程度以相對(duì)熒光強(qiáng)度表示，具體計(jì)算如公式（3）所示。

1.3.7 胞內(nèi)ROS水平的測定

采用DCFH-DA熒光探針測定ROS水平。分別取1 mL 1.3.2節(jié)不同劑量處理后的菌液，于4 ℃、12 000 r/min離心5 min，棄去上清液。加入1 mL無菌PBS重懸菌體，4 ℃、12 000 r/min離心2 min后收集菌體，清洗兩遍后重懸于800 μL PBS中，加入200 μL DCFH-DA染液（終濃度為10?μmol/L），37 ℃條件下避光反應(yīng)30 min，4 ℃、12 000 r/min離心2 min后收集菌體。加入1 mL無菌PBS重懸菌體，4 ℃、12 000 r/min離心2 min后收集菌體，清洗兩遍后重懸于1 mL PBS中。在激發(fā)波長為480 nm、發(fā)射波長為530 nm的條件下測定熒光強(qiáng)度，ROS水平以相對(duì)熒光強(qiáng)度表示，計(jì)算同式（3）。

1.3.8 脂環(huán)酸芽孢桿菌可溶性蛋白的測定

取對(duì)數(shù)期脂環(huán)酸芽孢桿菌培養(yǎng)液，按照6%（體積分?jǐn)?shù)）的接種量添加至300 mL BAT肉湯中，45 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)29 h，離心（3 500hg、10 min）收集菌體并用生理鹽水稀釋到106CFU/mL。按照1.3.2節(jié)方法采用不同劑量UVC-LED處理脂環(huán)酸芽孢桿菌，4 ℃、3 500hg下離心10 min，收集菌體后再重懸于10 mL生理鹽水中，400 W超聲破壁10 min，每超聲處理5 s間歇5 s。超聲處理后6 000hg離心15 min，收集上清液即為細(xì)菌的可溶性蛋白溶液。采用便攜式拉曼光譜分析細(xì)菌可溶性蛋白結(jié)構(gòu)的差異，激發(fā)波長為785 nm，功率為80 mW，曝光時(shí)間為60 s，掃描次數(shù)為4 次，掃描范圍400～2 000 cm－1。

1.3.9 胞內(nèi)DNA損傷情況的觀察

分別取1 mL 1.3.2節(jié)經(jīng)0、30、50 mJ/cm2劑量UVC-LED處理后的菌液，離心（4 ℃、12 000 r/min，5 min）收集菌體，然后加入1 mL PBS于4 ℃、12 000 r/min離心2 min清洗菌體，重復(fù)清洗兩遍后將菌體重懸于500?μL?PBS中，加入500?μL?AO染液（終質(zhì)量濃度為0.1 mg/L），室溫避光反應(yīng)10 min，12 000 r/min離心2 min收集菌體，按上述條件（4 ℃、12 000 r/min離心2 min）用PBS清洗3 次去除未反應(yīng)的染液，然后將菌體懸于200?μL?PBS中，立即在熒光相差自動(dòng)顯微鏡（40 倍物鏡）下觀察。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實(shí)驗(yàn)設(shè)置3 個(gè)平行，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)均采用Excel軟件進(jìn)行處理，采用GraphPad Prism 9.0.0軟件繪制柱狀圖，采用Origin 2018軟件繪制曲線圖。通過SPSS 21.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，采用Duncan多重比較進(jìn)行顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 UVC-LED劑量對(duì)脂環(huán)酸芽孢桿菌的滅活效果

脂環(huán)酸芽孢桿菌的初始菌落數(shù)為6.0（lg（CFU/mL）），隨著UVC-LED照射劑量的增加，脂環(huán)酸芽孢桿菌的存活數(shù)量逐漸減少（圖2）。當(dāng)照射劑量達(dá)到50 mJ/cm2時(shí)，可使存活的細(xì)菌數(shù)量降低4.6（lg（CFU/mL）），與Murashita等[16]研究結(jié)果相似，證明UVC-LED能夠有效滅活細(xì)菌，劑量越大滅活效果越強(qiáng)。有研究表明，用UVC-LED處理冰中的SalmonellaTyphimurium、Listeria monocytogenes、Escherichia coliO157:H7，當(dāng)紫外劑量達(dá)到40 mJ/cm2時(shí)可將Listeria monocytogenes完全滅活，而劑量增加到100 mJ/cm2時(shí)，SalmonellaTyphimurium和Escherichia coliO157:H7仍有存活[16]。由此可知，細(xì)菌類型會(huì)影響殺菌效果，微生物的生理狀態(tài)包括細(xì)胞壁的厚度、細(xì)胞的大小、照射產(chǎn)生的光生成物以及DNA修復(fù)能力都會(huì)影響細(xì)胞對(duì)UVC-LED的敏感程度，進(jìn)而造成滅活效果的差異[17-18]。

圖2 UVC-LED處理下脂環(huán)酸芽孢桿菌的存活曲線Fig. 2 Survival curve of A. acidoterrestris treated by UVC-LED

存活曲線的模擬結(jié)果如表1所示，UVC-LED對(duì)生理鹽水中脂環(huán)酸芽孢桿菌的殺滅作用既符合log-linear模型又符合Weibull模型，兩個(gè)模型的R2均大于0.990 0。UVC-LED對(duì)橙汁中脂環(huán)酸芽孢桿菌的殺滅作用更符合Weibull模型[14]，且使細(xì)菌總量減少90%所需的照射劑量（39.36 mJ/cm2）也遠(yuǎn)大于生理鹽水中所需的照射劑量（9.79、10.26 mJ/cm2），可能的原因?yàn)榧?xì)菌所在基質(zhì)的組成和理化特性對(duì)UVC-LED的殺菌存在影響[19]。因此，UVC-LED對(duì)不同基質(zhì)中細(xì)菌的殺菌效果不同，還需更深入的具體研究。

表1 生理鹽水中脂環(huán)酸芽孢桿菌經(jīng)UVC-LED處理后的存活曲線模型及相關(guān)參數(shù)Table 1 Evaluation of survival curve models of A. acidoterrestris in saline solution after UVC-LED treatment

2.2 UVC-LED對(duì)不同生長階段脂環(huán)酸芽孢桿菌的滅活作用

由圖3可知，脂環(huán)酸芽孢桿菌在0～6 h間處于遲緩期，7～30 h為對(duì)數(shù)生長期，之后進(jìn)入穩(wěn)定期。由圖3和表2可知，用相同劑量的UVC-LED處理不同生長時(shí)期的細(xì)菌，處于遲緩期和剛進(jìn)入穩(wěn)定期的菌體對(duì)UVC-LED處理的耐受性最強(qiáng)，存活率較高；而處于對(duì)數(shù)期的菌體對(duì)UVC-LED比較敏感，存活率相對(duì)較低，此時(shí)殺菌效果最好。錢靜亞[20]在對(duì)枯草芽孢桿菌進(jìn)行脈沖磁場處理時(shí)也發(fā)現(xiàn)，微生物處于不同生長階段時(shí)對(duì)脈沖磁場處理的敏感性不同，處于對(duì)數(shù)期的枯草芽孢桿菌殘留率較低。分析認(rèn)為，處在不同生長階段的脂環(huán)酸芽孢桿菌對(duì)于UVC-LED敏感程度不同，這與細(xì)菌自身的狀態(tài)有直接的關(guān)系，細(xì)胞的生長與自身對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性密切相關(guān)。處于遲緩期的細(xì)菌，由于環(huán)境的突然改變使其基本呈現(xiàn)不生長的狀態(tài)；適應(yīng)環(huán)境之后細(xì)菌進(jìn)入對(duì)數(shù)期，迅速繁殖生長；一段時(shí)間之后，由于環(huán)境中營養(yǎng)物質(zhì)消耗以及代謝產(chǎn)物累積再次限制了細(xì)菌的生長，進(jìn)入穩(wěn)定期。一般當(dāng)面對(duì)外部壓力時(shí)，例如環(huán)境的改變，細(xì)菌會(huì)通過表達(dá)相關(guān)基因并降低細(xì)胞膜的流動(dòng)性等方式進(jìn)行損傷修復(fù)、保護(hù)或適應(yīng)。這可能是遲緩期和剛進(jìn)入穩(wěn)定期時(shí)菌體對(duì)UVC-LED抵抗性增強(qiáng)的原因[15]。

圖3 脂環(huán)酸芽孢桿菌的生長曲線Fig. 3 Growth curve of A. acidoterrestris

表2 不同生長時(shí)期脂環(huán)酸芽孢桿菌經(jīng)相同劑量UVC-LED處理后存活率Table 2 Survival rates of A. acidoterrestris treated with the same dose of UVC-LED at different growth stages

2.3 UVC-LED處理對(duì)脂環(huán)酸芽孢桿菌胞內(nèi)核酸和蛋白質(zhì)泄漏量的影響

通過測定UVC-LED照射處理后胞內(nèi)核酸和蛋白質(zhì)的泄漏情況來評(píng)估脂環(huán)酸芽孢桿菌細(xì)胞膜通透性的變化。如圖4所示，隨著UVC-LED照射劑量的增加，細(xì)菌胞內(nèi)核酸和蛋白質(zhì)泄漏量呈顯著增加趨勢。由此說明，UVC-LED處理可以改變細(xì)胞膜的通透性，造成胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)的泄漏。王哲[21]在對(duì)大腸桿菌進(jìn)行UVC-LED處理時(shí)也有類似發(fā)現(xiàn)，短時(shí)間的照射破壞了大腸桿菌細(xì)胞膜以及細(xì)胞壁，造成核酸泄漏，OD260nm略有增加；同時(shí)在對(duì)處理3 min和5 min的大腸桿菌進(jìn)行掃描電子顯微鏡觀察中發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌表面略有變形，但變化程度不大。細(xì)胞膜以及細(xì)胞壁的破損會(huì)導(dǎo)致內(nèi)容物的流出，影響細(xì)胞活性，但是整體變化趨勢較小，因此內(nèi)容物的泄漏不足以成為UVC-LED致死細(xì)菌的主要原因。

圖4 UVC-LED處理后脂環(huán)酸芽孢桿菌胞內(nèi)核酸（A）和蛋白質(zhì)（B）的泄漏量Fig. 4 Amounts of nucleic acid (A) and protein (B) leaked out of A. acidoterrestris cells after UVC-LED treatments

2.4 UVC-LED處理對(duì)脂環(huán)酸芽孢桿菌細(xì)胞膜的影響

PI具有不透膜性，對(duì)于未受損的細(xì)胞而言，PI不能夠正常進(jìn)入胞內(nèi)，當(dāng)細(xì)胞膜遭到破壞，PI進(jìn)入胞內(nèi)并與核酸結(jié)合在熒光下顯現(xiàn)紅色。因此，可通過測定UVC-LED照射后細(xì)胞內(nèi)PI的相對(duì)熒光強(qiáng)度評(píng)估細(xì)胞膜的完整性。圖5反映了不同照射劑量處理后脂環(huán)酸芽孢桿菌胞內(nèi)PI的累積情況，照射后細(xì)胞的PI相對(duì)熒光強(qiáng)度顯著高于未處理的細(xì)胞，不同劑量的處理對(duì)PI的相對(duì)熒光強(qiáng)度影響不顯著。結(jié)果表明，照射處理對(duì)細(xì)胞膜完整性有一定程度的影響。據(jù)報(bào)道，波長不高于275 nm的紫外光能夠破壞C－H鍵和C－C鍵[22]，因此，275 nm波長的紫外光處理能夠損傷膜蛋白，從而破壞膜的完整性[23]。

圖5 不同劑量UVC-LED處理后胞內(nèi)PI相對(duì)熒光強(qiáng)度Fig. 5 Effect of UVC-LED treatments on relative fluorescence intensity of intracellular propidium iodide

2.5 UVC-LED處理對(duì)脂環(huán)酸芽孢桿菌胞內(nèi)ROS水平的影響

如圖6所示，脂環(huán)酸芽孢桿菌經(jīng)低劑量的UVC-LED照射后，胞內(nèi)ROS水平?jīng)]有明顯變化，當(dāng)劑量提高到40、50 mJ/cm2時(shí)，其胞內(nèi)ROS的水平略有提高，但與處理組仍不存在顯著性差異（P＞0.05）。這些結(jié)果表明，UVC-LED照射處理沒有造成細(xì)菌胞內(nèi)ROS的累積，胞內(nèi)的ROS不是造成細(xì)菌死亡的主要原因。Song Kai等[24]在用UVC輻照大腸桿菌的研究中加入相應(yīng)的ROS清除劑，未觀察到大腸桿菌死亡率的改變，說明UVC對(duì)大腸桿菌的滅活不涉及超氧自由基、羥自由基和過氧化氫等ROS的參與。研究表明，UVA主要被發(fā)色團(tuán)的分子吸收，可產(chǎn)生氧化中間物如ROS，繼而破壞蛋白、DNA以及細(xì)胞膜等，從而造成細(xì)菌死亡[25]，而UVC導(dǎo)致的細(xì)菌失活與ROS沒有直接的關(guān)系。

圖6 不同劑量UVC-LED處理對(duì)ROS水平的影響Fig. 6 Effect of UVC-LED treatment on ROS levels

2.6 UVC-LED處理對(duì)脂環(huán)酸芽孢桿菌可溶性蛋白的影響

經(jīng)不同劑量UVC-LED處理后，細(xì)菌可溶性蛋白結(jié)構(gòu)的差異可通過拉曼光譜反映，拉曼位移和強(qiáng)度的改變反映了蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)及微環(huán)境的改變。未處理和經(jīng)不同劑量UVC-LED處理后的菌體可溶性蛋白在400～2 000 cm－1范圍內(nèi)的拉曼吸收強(qiáng)度如圖7所示。經(jīng)UVC-LED處理后細(xì)菌可溶性蛋白的拉曼光譜存在差異。1 665 cm－1附近的酰胺I帶和位于1 250 cm－1的酰胺III帶能夠間接反映蛋白質(zhì)主鏈的結(jié)構(gòu)，涉及蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)包括α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角以及無規(guī)卷曲[26]。根據(jù)實(shí)驗(yàn)所得拉曼光譜圖看出，經(jīng)處理后兩個(gè)譜帶的吸收峰值發(fā)生一定變化。表明紫外光破壞了蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)，從而改變二級(jí)結(jié)構(gòu)包括α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角以及無規(guī)卷曲的含量。譜線中特征峰大部分屬于氨基酸譜線，呈現(xiàn)不規(guī)則的波動(dòng)。側(cè)鏈氨基酸的改變主要是微環(huán)境的變化引起的。經(jīng)照射處理后的譜線在830 cm－1和850 cm－1附近酪氨酸殘基的特征雙峰中的峰值均高于未處理組，這可能是由于UVC-LED處理改變了菌體可溶性蛋白存在的微環(huán)境，使酪氨酸逐漸暴露。位于760 cm－1處色氨酸的峰值變化可以反映檢測微環(huán)境的極性，有研究發(fā)現(xiàn)，色氨酸殘基從疏水的環(huán)境中暴露于極性溶劑中，拉曼位移在760 cm－1處的強(qiáng)度會(huì)發(fā)生下降。圖7譜線中經(jīng)UVC-LED處理后760 cm－1處強(qiáng)度有所增加，表明在疏水環(huán)境中的色氨酸殘基被進(jìn)一步包埋，紫外照射使得微環(huán)境向非極性轉(zhuǎn)變。1 450 cm－1附近脂肪族氨基酸峰值也有所提高，這歸因于照射處理破壞了原來的聚集體，更多更小的聚集體的形成增加了疏水基團(tuán)暴露[27-29]。整體而言，UVC-LED處理后菌體可溶性蛋白的拉曼強(qiáng)度發(fā)生波動(dòng)，由于部分蛋白在280 nm波長處有吸收峰[21]，處理過程中菌體的蛋白結(jié)構(gòu)吸收紫外光后發(fā)生不同程度的降解和重組，同時(shí)UVC-LED處理對(duì)菌體中蛋白所處的微環(huán)境產(chǎn)生了影響。

圖7 UVC-LED處理后脂環(huán)酸芽孢桿菌可溶性蛋白拉曼光譜圖Fig. 7 Raman spectra of soluble proteins of A. acidoterrestris treated with UVC-LED

2.7 UVC-LED處理對(duì)脂環(huán)酸芽孢桿菌的DNA損傷情況

AO能夠透過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞并與DNA或RNA結(jié)合，在特定條件下呈現(xiàn)綠色或桔色熒光。未處理組中，細(xì)菌懸浮于生理鹽水中處于靜止期，與高效繁殖的細(xì)菌相比基本處于不活動(dòng)的生理狀態(tài)，此時(shí)核酸主要以DNA雙鏈為主，AO與DNA雙鏈結(jié)合后熒光顏色以綠色為主（圖8）；UVC-LED處理組中，由于處理劑量的不同，熒光顏色呈現(xiàn)不同程度的橙色，經(jīng)50 mJ/cm2的劑量處理之后，細(xì)菌呈現(xiàn)的熒光顏色以橙色為主。這說明UVC-LED處理造成了脂環(huán)酸芽孢桿菌DNA雙鏈的斷裂、變性及單鏈的產(chǎn)生，處理劑量越大，DNA雙鏈的損傷程度越大[30]。分析認(rèn)為，細(xì)胞內(nèi)DNA由于其堿基能夠直接吸收UVC而成為輻射的直接目標(biāo)，導(dǎo)致DNA分子受到損傷。紫外處理過程中能夠形成有毒物質(zhì)（如環(huán)丁烷嘧啶二聚體、（6-4）光產(chǎn)物及其杜瓦價(jià)鍵異構(gòu)體）、致突變性DNA損傷甚至造成DNA鏈斷裂，如果不修復(fù)這種紫外線引起的損傷，最終會(huì)發(fā)生突變和細(xì)胞死亡[20,31-32]。UVC-LED處理脂環(huán)酸芽孢桿菌造成的DNA直接損傷程度較高，可能是引起細(xì)胞死亡的主要原因。

圖8 不同劑量UVC-LED處理脂環(huán)酸芽孢桿菌AO染色后的熒光顯微鏡圖像（×400）Fig. 8 Fluorescence microscopic images of AO stained A. acidoterrestris treated with different doses of UVC-LED (× 400)

3 結(jié) 論

研究證明UVC-LED能夠有效滅活脂環(huán)酸芽孢桿菌，特別是處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)菌對(duì)UVC-LED處理更加敏感。UVC-LED處理增大了細(xì)胞膜通透性，導(dǎo)致胞內(nèi)核酸和蛋白質(zhì)出現(xiàn)一定程度的泄漏，胞內(nèi)蛋白的結(jié)構(gòu)有所改變，而與未處理組相比胞內(nèi)ROS水平?jīng)]有顯著變化（P＞0.05）。AO染色后熒光分析結(jié)果表明UVC-LED對(duì)DNA雙鏈結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，從而破壞微生物的生理功能，導(dǎo)致死亡。綜上，UVC-LED主要通過損傷DNA來滅活脂環(huán)酸芽孢桿菌，本研究可為UVC-LED的應(yīng)用提供理論參考。