芹菜苷對葡聚糖硫酸鈉誘導小鼠結腸炎的緩解作用

夏圣坤，王 輝，陳曉敏，陳春華，周文淦，黃曉君，聶少平

（南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，中加食品科學技術聯合實驗室，江西 南昌 330047）

炎癥性腸病（inflammatory bowel disease，IBD）包括克羅恩?。–rohn’s disease，CD）和潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC），是病因不明的特發(fā)性腸道炎癥。IBD的臨床表現主要為腹瀉、直腸出血、腹痛和體質量減輕等癥狀，常常給患者帶來巨大的痛苦[1]。此外，已有研究表明，除了腸道，IBD還會累及全身各器官，進而引發(fā)關節(jié)炎、口腔潰瘍、皮膚黏膜損害、眼部、肝腎臟等病變[2]。IBD發(fā)病率仍持續(xù)上升，已成為全球關注的健康問題。目前，治療IBD的藥物種類大多為糖皮質激素、氨基水楊酸、免疫抑制劑和生物制劑等[3-4]。除藥物醫(yī)治外，現有研究發(fā)現一些非藥物類方法也具有改善作用，包括基因治療及糞便移植等。但是這些療法都有其局限性，并非對所有患者都有效。此外，皮質類固醇和免疫抑制劑還具有一定副作用，可引起多種不良反應。因此，尋找新的手段用于緩解患者癥狀迫在眉睫[5]。

芹菜（Apium graveolensLinn.）屬于傘形花科的草本植物，適宜生長在肥沃的土壤，主要分布于南北美洲、南歐、非洲、亞洲[6]。芹菜具有優(yōu)良的食療效果，已被用于緩解炎癥、便秘、高血壓和高血脂、肝臟病變等疾病[7-9]。黃酮類化合物是植物次生代謝產物，在植物界廣泛分布，大量報道顯示其在細胞和嚙齒動物模型中具有抗氧化和抗炎活性[10-11]。芹菜中的黃酮類化合物是其重要活性成分之一。目前，芹菜黃酮的研究熱點主要集中在芹菜素，已有研究報道芹菜素具有抗氧化[12]、抗炎[13]、抗腫瘤[14]的生理活性。然而黃酮在植物中主要以其衍生物的形式存在，而非苷元。作為芹菜苷苷元的芹菜素在芹菜中含量較低，質量分數僅為0.003%～0.088%[15]。芹菜苷作為芹菜中芹菜素的主要存在形式之一，其含量是芹菜素的10～20 倍[16]，然而其相關的功能活性鮮有報道。

因此，本研究以芹菜苷作為對象，對葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium，DSS）誘導的結腸炎小鼠給予芹菜苷干預，利用現代生物技術手段評價芹菜苷緩解結腸炎的效果，以期提高芹菜的綜合利用，并可為結腸炎患者膳食選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

5周齡雄性近交系C57BL/6J小鼠（（18f2）g）購自北京維通利華實驗動物技術有限公司（生產許可證號：SCXK（京）2016-0006），在清潔級動物房中進行飼養(yǎng)，條件為室溫（25.0f0.5）℃、相對濕度（50f5）%、光/暗循環(huán)為12 h/12 h。

芹菜苷（芹菜苷（67.85f0.89）%、3-甲氧基芹菜苷（9.76f0.23）%和木樨草素-7-O-芹糖苷（10.22f0.05）%）由南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室提供，其結構如圖1所示。

圖1 芹菜苷及其衍生物結構圖Fig. 1 Structures of apiin and its derivatives

DSS 美國MP Biomedical公司；0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（pH 7.2～7.4）、4%多聚甲醛溶液 上海碧云天生物技術有限公司；蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）、阿利新藍（alcian blue，AB）-過碘酸席夫（periodic acid Schiff，PAS）染色試劑盒 武漢賽維爾生物有限公司；髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）、誘導型一氧化氮合酶（inducable nitric oxide synthase，iNOS）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α與白細胞介素（interleukin，IL）-6酶聯免疫吸附試驗（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒 南京森貝伽生物科技有限公司；其他化學試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

Feica APERIO LV1型病理切片掃描儀、倒置熒光顯微鏡德國徠卡顯微系統公司；3K15冷凍離心機 美國Sigma-Aldrich公司；Varioshan Flash多功能酶標儀、702型－80 ℃冰箱 美國賽默飛世爾科技公司。

1.3 方法

1.3.1 動物實驗設計

1.3.1.1 小鼠飼料配方的確定

AIN93G飼料定制于上海帆泊生物技術有限公司。飼料成分如表1所示，芹菜苷飲食配方基于AIN93G飼料進行調整。以小鼠3 g/d的飲食劑量為參照，芹菜苷劑量為25 mg/kgmb，相當于人的劑量為2.75 mg/kgmb[17]。

表1 飲食成分表Table 1 Ingredients of experimental diets

1.3.1.2 動物實驗分組及模型建立

參照文獻[18]方法并適當修改，利用DSS誘導建立小鼠結腸炎模型。靜養(yǎng)1周后，選用30只C57BL/6小鼠為實驗對象，將小鼠隨機分成3 組（n＝10）：正常組、模型組、芹菜苷組。正常組和模型組全程給予AIN93G正常飼料，芹菜苷組全程給予根據AIN93G飼料配方調整的芹菜苷定制飼料。飼喂7 d后，模型組和芹菜苷組的飲水更換為含質量分數3% DSS的無菌水進行腸炎造模；正常組依然給予正常無菌水。造模6 d后，停止給予DSS無菌水（正常組也停止給予無菌水），24 h后，小鼠稱質量后脫頸處死，眼眶取血，室溫下靜置1 h，3 000 r/min離心20 min，取上清液（血清），－80 ℃凍存待用。量取升結腸到直腸末端的距離作為小鼠結腸長度，稱量脾臟質量并記錄，收集小鼠各器官部分保存于－80 ℃冰箱或多聚甲醛溶液中。實驗期間記錄每天小鼠的體質量和飲食量。本研究中涉及動物的所有程序均按照國家衛(wèi)生研究院實驗動物護理和使用指南進行，并經南昌大學實驗動物護理和使用委員會批準。

1.3.2 疾病活動指數測定

從第8天開始到動物飼養(yǎng)結束，參照文獻[19]的方法，對小鼠的糞便形態(tài)、便血情況和體質量下降率3 個方面進行評分，評分標準如表2所示。疾病活動指數（disease activity index，DAI）為以上3 個指標得分總和的平均值。

表2 DAI評分標準Table 2 Scoring criteria for DAI

1.3.3 脾臟指數測定

稱取小鼠脾臟質量并記錄，按如下公式計算小鼠脾臟指數。

1.3.4 炎癥因子水平測定

根據ELISA試劑盒操作說明，測定小鼠血清中炎癥因子TNF-α與IL-6的質量濃度。

1.3.5 氧化應激指標測定

稱取適量結腸樣本，向其中加入預冷（4 ℃）的PBS勻漿，4 ℃、3 000 r/min離心10 min獲得結腸上清液，根據ELISA試劑盒操作說明，測定小鼠結腸中MPO及iNOS活力。

1.3.6 結腸組織病理學分析

4%多聚甲醛固定結腸組織樣本，石蠟包埋后，經切片、脫蠟、覆水、蘇木精染色、乙酸分化、伊紅染色、脫水和封片后，在病理切片掃描儀下觀察各組的結腸組織學形態(tài)，并用相機采集圖像。結腸組織學損傷評分標準如表3所示，組織損傷評分為各項指標評分的總和[20]。

表3 結腸組織學損傷評分標準Table 3 Scoring criteria for colonic histological injury

1.3.7 結腸杯狀細胞觀察

AB可以將唾液黏蛋白、硫黏蛋白和蛋白多糖染成藍色，而PAS可以將既含中性黏蛋白又含酸性黏蛋白的組織和細胞染成深淺不同的紫色，因此常用AB-PAS技術研究腸道杯狀細胞的生長狀況[21]。根據AB-PAS染色試劑盒說明書，對結腸切片進行AB-PAS染色。石蠟切片脫蠟復水，使用染液進行浸染，切片用無水乙醇脫水、中性樹膠封片。在病理切片掃描儀下采集切片圖像信息。采用Image pro plus 6.0軟件對切片中杯狀細胞面積占結腸總面積的百分比（杯狀細胞面積占比）進行計算。

1.4 數據處理與分析

通過Graph Pad Prism 8.0軟件繪制統計圖表，采用SPSS Statistics 23軟件對數據通過單因素方差分析進行最小顯著差異（least significant difference，LSD）的事后分析檢驗，結果以平均值±標準誤表示。

2 結果與分析

2.1 各處理組小鼠飲食狀況

對各處理組小鼠飲食量進行統計，并計算平均每只小鼠飲食量，結果如圖2所示，在第2～9天，各處理組小鼠飲食量之間沒有明顯差異，均穩(wěn)定在2.1～3.2 g之間，而從第10天開始，模型組和芹菜苷組小鼠飲食量開始逐漸下降，這可能是DSS處理使得小鼠腸道損傷所引起的。

圖2 各處理組小鼠飲食量Fig. 2 Food intake of mice in each treatment group

2.2 芹菜苷對小鼠體質量的影響

為評估芹菜苷對DSS誘導的結腸炎小鼠體質量的影響，對小鼠體質量進行統計。從圖3A可以看出，在第1～8天，各組小鼠體質量均緩慢上升，而在給予DSS后，模型組和芹菜苷組小鼠體質量逐漸下降。對比模型組，芹菜苷可減緩體質量降低，且在第14天時，芹菜苷組小鼠體質量顯著高于模型組（P＜0.05）。為消除前7 d芹菜苷干預對體質量的影響，以第8天小鼠體質量為基準，計算8～14 d的體質量與第8天體質量的比值（相對體質量）（圖3B）。結果發(fā)現，在第14天，模型組的體質量降至第8天時的89.34%，而芹菜苷可顯著緩解由DSS誘導的體質量降低（P＜0.05）。

圖3 芹菜苷對小鼠體質量的影響Fig. 3 Effect of apiin on body mass in mice

2.3 芹菜苷對小鼠脾臟指數的影響

脾臟是最大的免疫器官，炎癥反應會使脾臟發(fā)生腫大，導致質量增加。如圖4所示，模型組小鼠脾臟指數與正常組小鼠相比高度顯著升高（P＜0.001），芹菜苷可高度顯著降低腸炎小鼠脾臟指數（P＜0.001）。

圖4 芹菜苷對小鼠脾臟指數的影響Fig. 4 Effect of apiin on spleen index in mice

2.4 芹菜苷對小鼠DAI的影響

為判斷小鼠結腸炎的嚴重程度，對小鼠DAI進行評分，結果如圖5所示。在造模期間，正常組DAI基本保持為0。給予3% DSS 2 d（第10天）后，與正常組相比，模型組DAI顯著升高（P＜0.05），且在第14天DAI達到約3.5。而芹菜苷可顯著降低結腸炎小鼠的DAI，芹菜苷組在第14天DAI為2，高度顯著低于模型組（P＜0.001）。

圖5 芹菜苷對小鼠DAI的影響Fig. 5 Effect of apiin on DAI in mice

2.5 芹菜苷對小鼠結腸長度的影響

結腸炎會引起結腸長度縮短，因此結腸長度變化是評價小鼠結腸炎嚴重程度的又一重要參數[22]。如圖6所示，正常小鼠結腸長度為6.5 cm，而模型組小鼠的結腸平均長度僅為5.0 cm，高度顯著低于正常組（P＜0.001），而芹菜苷飲食干預可極顯著緩解結腸炎小鼠的結腸縮短（P＜0.01）。

圖6 芹菜苷對小鼠結腸長度的影響Fig. 6 Effect of apiin on colonic length

2.6 芹菜苷對小鼠氧化應激的影響

為評價芹菜苷對氧化應激的調節(jié)能力，測定了結腸中MPO及iNOS的活力，結果如圖7所示。正常組的MPO和iNOS活力分別為15 U/μg和0.75 U/μg，DSS的攝入會引起小鼠氧化應激反應，表現為模型組小鼠的MPO和iNOS活力顯著增加（P＜0.001、P＜0.01），然而芹菜苷的攝入可以高度顯著抑制MPO與iNOS活力的增加（P＜0.001），說明芹菜苷具有較強的調節(jié)氧化應激能力。

圖7 芹菜苷對小鼠氧化應激的影響Fig. 7 Effect of apiin on oxidative stress in mice

2.7 芹菜苷對小鼠炎癥因子分泌水平的影響

結腸炎患者常伴有嚴重的炎癥反應，進而體內產生高濃度的促炎因子[23]，為了評價芹菜苷的抗炎能力，本實驗測定了血清中TNF-α與IL-6的質量濃度，結果如圖8所示。與正常組相比，模型組小鼠血清中促炎因子TNF-α和IL-6分泌水平顯著升高（P＜0.05），質量濃度分別達到493 ng/L、99 pg/mL，而芹菜苷干預可顯著降低血清中這兩種炎癥因子質量濃度（P＜0.001、P＜0.01），并達到與正常組相近的水平。

圖8 芹菜苷對小鼠血清TNF-α（A）和IL-6（B）質量濃度的影響Fig. 8 Effect of apiin on serum TNF-α (A) and IL-6 (B) levels in mice

2.8 芹菜苷對結腸組織病理的影響

為評價芹菜苷對DSS誘導的結腸炎小鼠結腸組織結構和形態(tài)的影響，對小鼠結腸組織進行HE染色及組織病理學綜合評分。如圖9A所示，正常組小鼠結腸上皮及隱窩結構正常，且無炎癥細胞浸潤發(fā)生；模型組小鼠結腸出現嚴重的腸上皮損傷、隱窩結構變形或消失，以及大范圍的炎癥浸潤；芹菜苷組小鼠結腸結構較為完整，組織損傷輕微，黏膜上皮結構較為完整，隱窩結構基本完整與規(guī)則。如圖9B所示，與模型組相比，芹菜苷組結腸組織損傷得分高度顯著降低（P＜0.001），說明芹菜苷可顯著減輕DSS引起的小鼠結腸組織損傷。

圖9 芹菜苷對小鼠結腸病理組織的影響Fig. 9 Effect of apiin on colonic damage score in mice

2.9 芹菜苷對結腸組織中杯狀細胞的影響

與正常組相比，模型組小鼠組織學檢查結果顯示隱窩結構變形或消失，這表明芹菜苷可能通過刺激杯狀細胞分泌黏液對腸道上皮細胞產生有益作用。因此用ABPAS進行特異性染色，以評估芹菜苷處理后的小鼠杯狀細胞的生長情況。如圖10A所示，在模型組小鼠結腸中，杯狀細胞萎縮且?guī)缀醣煌耆茐模鄄塑战M小鼠結腸杯狀細胞數量眾多并均勻地分布在隱窩當中，且分泌有大量黏液。如圖10B所示，與模型組相比，芹菜苷處理小鼠杯狀細胞的AB-PAS染色面積百分比顯著更高（P＜0.05），這表明芹菜苷的攝入對杯狀細胞具有明顯的保護作用。

圖10 芹菜苷對結腸組織中杯狀細胞的影響Fig. 10 Effect of apiin on number of goblet cells in colon tissue

3 討 論

DSS誘導的小鼠結腸炎具有與人類UC相似的病理特征，表現為體質量減輕、糞便出血、腸上皮細胞丟失和中性粒細胞浸潤等病理改變[24]。在本研究中，通過連續(xù)6 d在雄性C57BL/6小鼠的飲水中添加3%的DSS誘導急性結腸炎。模型組體質量急劇下降，肛門可見血便，組織病理改變，結腸組織出現隱窩破壞、杯狀細胞的丟失、黏膜下水腫和上皮結構損傷以及大范圍的炎癥浸潤等現象。而芹菜苷能減輕DSS處理小鼠的結腸炎癥狀和炎癥反應，維持正常的腸道形態(tài)結構。

氧化應激和氧化細胞損傷是結腸炎的標志之一。氧化應激酶活力升高會導致自由基大量生成，而自由基會與腸細胞膜上脂類物質發(fā)生相互作用，導致脂質過氧化，從而破壞腸道黏膜屏障，加重炎癥反應[25-26]。MPO是一種中性粒細胞溶酶體中富含的酶，其活性與炎癥直接相關，在特定條件下，MPO催化反應生成過量的氧化自由基，會導致氧化應激和氧化性組織損傷[27]。iNOS是催化NO生成的協助巨噬細胞在免疫系統中對抗病原體的一類氧化應激酶。研究發(fā)現，結腸炎患者內NO含量超過正常值時，iNOS表達合成量升高[28]。本研究發(fā)現，與正常組相比，DSS處理的模型組小鼠MPO和iNOS活力顯著升高，而添加芹菜苷處理后，這兩種酶活力恢復至正常水平，表明芹菜苷具有較強的調節(jié)機體氧化應激能力。賈佳等[29]在對芹菜苷體外活性研究中發(fā)現，芹菜苷具有強抗氧化能力，能減緩油脂過氧化。

炎癥因子是一類主要由免疫系統細胞分泌的具有許多強大生物學效應的內源性多肽，可介導單核細胞等炎癥細胞浸潤腸組織，從而引起腸組織損傷[29]。TNF-α是炎癥反應過程中出現的最早、最重要的炎性介質，能激活中性粒細胞和淋巴細胞，使血管內皮細胞通透性增加。IL-6能誘導B細胞分化和產生抗體，并誘導T細胞活化增殖、分化，參與機體免疫應答，是炎癥反應的促發(fā)劑[30]。IL-6水平常與結腸炎患者疾病的嚴重程度呈正相關[31]。研究結果表明，促炎因子（如TNF-α和IL-6）的表達量升高可促使腸道炎癥發(fā)生，導致疾病惡化和組織破壞[32]。也有研究發(fā)現，TNF-α可以通過調節(jié)核因子（nuclear factor，NF）-κB誘導激酶和抑制酶比例（NF-κB-inducing kinase/inhibitory-κB kinase α，NIK/IKK-α）激活NF-κB通路促進腸道通透性增加[33]。據報道，NO產量的增加與促炎細胞因子釋放的增加成正比，而iNOS活力增加會導致產生大量的NO[34]。因此，本研究利用ELISA法測定血清中的TNF-α及IL-6的質量濃度，結果表明，DSS誘導能顯著提高血清中這些炎癥因子的質量濃度，而芹菜苷可顯著抑制這些細胞因子的表達，提示芹菜苷可以緩解全身性的炎癥。

腸道黏液層作為腸道屏障的重要組成部分，主要由杯狀細胞及其分泌的黏蛋白組成。黏蛋白是一類糖蛋白，其結合位點可與腸上皮細胞上的結合位點競爭，以阻止細菌與腸上皮結合，使細菌處于黏液層，以利于腸蠕動時被清除，以維護腸道內環(huán)境穩(wěn)態(tài)[35]。結腸組織中過多的炎癥細胞因子會引起杯狀細胞凋亡，從而導致黏膜屏障完整性嚴重被破壞[36]。因此，利用AB-PAS進行特異性染色，以評估芹菜苷處理后的杯狀細胞生長情況，結果發(fā)現，芹菜苷組小鼠的杯狀細胞數量顯著高于模型組，這表明芹菜苷可能通過刺激杯狀細胞增殖分泌黏液對腸道屏障產生有益作用。也有研究表明，一些黃酮具有上調黏蛋白和保護結腸黏液層完整性的功能[37]，與本實驗研究結果相似。

芹菜苷作為芹菜素的天然存在形式，其結構上比芹菜素多連有兩個糖苷；且與芹菜素相比，芹菜苷在體外幾乎不被細胞吸收，并且沒有表現出明顯抗炎活性[38]。這表明芹菜苷發(fā)揮抗炎作用可能涉及到其他機制，如機體代謝及腸道菌群的改變，有待進一步研究。

綜上所述，芹菜苷可以緩解結腸炎小鼠的體質量降低和結腸縮短，降低DAI；并減弱DSS誘導小鼠結腸炎的組織病理學改變。此外，芹菜苷能抑制結腸炎小鼠血清中促炎細胞因子表達水平的增加，調節(jié)結腸氧化應激酶MPO及iNOS活力，促進杯狀細胞增殖，保護腸道屏障完整性，修復結腸炎導致的腸道損傷。因此，芹菜苷可作為緩解結腸炎的潛在天然活性物質。