鞣花酸和尿石素類代謝產(chǎn)物的生物活性及其對腸道健康的作用研究進(jìn)展

肖玉欣，王 楠，王 婧，譚碧娥

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128）

鞣花酸（ellagicacid，EA）是廣泛分布于石榴、草莓及覆盆子等水果或堅(jiān)果中的天然多酚類抗氧化劑，可由鞣花單寧（ellagitannin，ET）進(jìn)入體內(nèi)后水解生成。越來越多的動物模型和人類臨床試驗(yàn)證明，ET和EA具有抗炎、抗氧化、抗癌及調(diào)節(jié)腸道菌群的生理活性，對慢性疾病的發(fā)生發(fā)展具有潛在的預(yù)防、治療作用[1-3]。但ET和EA在腸道中不易被吸收，生物利用度低，部分未被吸收的EA則在動物和人體腸道內(nèi)代謝生成尿石素（urolithin，Uro）A、異尿石素（isourolithin，isoUro）A和Uro B等更易吸收的尿石素類物質(zhì)。因此，有報(bào)道認(rèn)為尿石素可能是ET和EA在體內(nèi)發(fā)揮生物活性的物質(zhì)基礎(chǔ)[4]。近年來，尿石素的結(jié)構(gòu)特征、理化性質(zhì)和生物活性等也日漸受到國內(nèi)外的廣泛關(guān)注。EA及其代謝產(chǎn)物尿石素的生物活性與其抗氧化能力和微生物調(diào)節(jié)作用密切相關(guān)。本文主要討論EA及尿石素的代謝途徑、生理活性和機(jī)制，及其在腸道疾病研究中的應(yīng)用。

1 EA的來源、提取方式及結(jié)構(gòu)特征

1.1 EA的來源

EA主要以游離單體、衍生物和復(fù)合ET形式存在于多種植物的液泡中，如石榴、藍(lán)莓、樹莓、草莓、胡桃等水果及堅(jiān)果[5]。ET和EA屬于一類具有生物活性的多酚化合物，其中ET是可水解單寧類多酚，可被酸或堿水解后釋放六羥基二苯酸，六羥基二苯酸可自發(fā)形成內(nèi)酯從而生成EA[6]。不同種類的植物中，ET和EA的含量及種類存在差別。石榴中含有豐富的安石榴苷，草莓、樹莓和圓葉葡萄中有較高含量的地榆素H6和游離EA，核桃中主要含有花梗鞣素、纈草酸雙內(nèi)酯和大麻黃素[7]。據(jù)研究人員統(tǒng)計(jì)，在薔薇科漿果中，游離EA占總EA含量的40%～50%，總EA含量范圍為47 mg/g（以紅樹莓鮮質(zhì)量計(jì)）～90 mg/g（以黑樹莓鮮質(zhì)量計(jì)），總ET的含量范圍為0.65 mg/g（以草莓鮮質(zhì)量計(jì)）～3.90 mg/g（以北極樹莓鮮質(zhì)量計(jì)）；在圓葉葡萄中，游離EA含量為49.1 mg/kg，總EA含量為86.9 mg/kg；在堅(jiān)果中，核桃的EA總含量約為0.33～0.59 mg/g；而在其他水果或堅(jiān)果中（如蘋果、臍橙、葡萄柚、梨、桃、獼猴桃、花生和腰果等），EA的含量低于高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）系統(tǒng)的檢測閾值[8]。不同植物來源EA間的活性差異鮮見報(bào)道。

1.2 EA的結(jié)構(gòu)特征

EA分子式為C14H6O8，含有2 個內(nèi)酯基團(tuán)和4 個羥基基團(tuán)（圖1），這使EA在不同條件下均可發(fā)揮重要的抗氧化活性[9]。EA及其衍生物的抗氧化效率與它們的羥基化程度直接相關(guān)，并隨著糖基的存在而降低[10]。EA難溶于水，可溶于甲醇、乙醇、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）等有機(jī)溶劑，與三氯化鐵的顯色反應(yīng)呈藍(lán)色，遇硫酸呈黃色。

圖1 EA結(jié)構(gòu)Fig. 1 Structure of ellagic acid

1.3 EA的提取方式

EA可從水果果實(shí)、果汁、果皮和籽中提取。在樹莓、草莓等漿果類水果籽中EA含量為6.7～32.0 mg/g（以鮮質(zhì)量計(jì)），占總EA含量的80%[11]?？茖W(xué)家們常利用富含EA的果汁、果皮粉末或籽油作為營養(yǎng)添加劑研究其對人體與動物的生物活性。根據(jù)植物的提取部位不同，EA的活性可能存在差異。有研究表明，與石榴汁相比，石榴皮粉末提取物表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗氧化和抗菌能力[12]。此外，研究人員將石榴汁與其等量的純化EA進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)石榴汁較純化的EA具有更高的生物利用度和生物活性，但在尿石素產(chǎn)物含量、血脂水平、和炎性因子表達(dá)等生理活性上的差異并不明顯[13]。

通過精進(jìn)提取方法提高天然植物提取物中EA等活性物質(zhì)的含量是降低加工成本、減少生物廢棄物和環(huán)境污染的有效途徑。不同的提取方法可影響植物中EA的提取效率。有研究表明，140 ℃種子焙燒15 min可提高冷榨樹莓、草莓和櫻桃籽油中EA的含量[14]。由于EA難溶于水，其提取溶劑多為丙酮和甲醇等有機(jī)溶劑。Panichayupakaranant等[15]利用10%甲醇、乙酸乙酯和2%醋酸水溶液將石榴皮中EA的提取效率從7.06%提高至13.63%，并發(fā)現(xiàn)石榴皮EA干粉較其水溶液更穩(wěn)定。Markom等[16]比較了不同提取溶劑類型和提取方法對提取珠子草中EA的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在一定溫度下，水-乙醇溶劑萃取法提取EA的效果最好，且EA含量隨水含量的增加而增加；而加壓水提取法可在最短時間內(nèi)提取出最大量的EA，并表明兩種溶劑提取方式中助溶劑混合物的選擇以及溫度時間等參數(shù)仍需進(jìn)一步優(yōu)化[16]。然而，有機(jī)溶劑提取法耗能高、污染環(huán)境且提取效率低，因此，環(huán)保、高效率的提取方式亟待開發(fā)。近期，An Juanyan等[17]利用反溶劑沉淀法優(yōu)化低共熔溶劑（deep eutectic solvents，DES），將板栗皮中EA的回收率提高至94.4%，且提取純度較乙醇提取法提高2 倍以上，高達(dá)85.6%；同時，證實(shí)了優(yōu)化的DES提取法回收的EA具有較高的抗氧化活性和抑菌活性[17]，DES法還可顯著提高草莓和樹莓殘?jiān)蠩A的提取與回收效率[18]。因此，DES可作為一種綠色、高效的提取和回收EA等高價值酚類化合物的方法。

2 EA的代謝

人體攝入180 mL石榴汁1 h后，血液中EA的濃度達(dá)到最大值（0.1 μmol/L），隨后在4 h內(nèi)快速消除[4]。ET難以被胃腸道直接吸收，其在小腸微生物或生理pH值的作用下水解釋放EA，游離的EA可在小腸被吸收[4]。EA在腸道上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)載體尚未被確定，通常認(rèn)為EA的吸收過程是由濃度梯度驅(qū)動的被動擴(kuò)散[19]。人[4]和大鼠[20]攝入石榴汁后，均在其血漿和尿液中檢測到了Uro A、B、C以及二甲基葡糖醛酸內(nèi)酯。未被消化吸收的ET和EA到達(dá)結(jié)腸后，由微生物代謝產(chǎn)生一系列EA代謝產(chǎn)物，統(tǒng)稱為尿石素[21]。尿石素的羥基數(shù)量因其代謝途徑而不同，并依次命名為Uro A～D。EA打開一個內(nèi)酯環(huán)脫去羧基生成Uro D，Uro D通過脫去1、2或3 個羥基分別生成Uro C、Uro A或isoUro A、Uro B[22]（圖2）。尿石素被腸道上皮細(xì)胞吸收后與葡糖醛酸結(jié)合，隨后進(jìn)入體循環(huán)到達(dá)各靶器官[6,21]。有研究表明，人體攝入石榴汁后，尿石素以游離或復(fù)合的形式出現(xiàn)在體循環(huán)中，在24～48 h內(nèi)達(dá)到最高濃度，最長存在時間為72 h[22]。葡萄糖醛酸化Uro A和Uro A硫酸鹽是血漿和尿液中主要的EA代謝產(chǎn)物，其次是葡萄糖醛酸化Uro B和Uro C以及Uro B和Uro C硫酸鹽[19-20]。在大鼠和小鼠實(shí)驗(yàn)中，尿石素在前列腺和腸道中富集，少量分布在肝臟和腎臟組織中[20,23]。因此，EA及其微生物代謝產(chǎn)物進(jìn)入體循環(huán)主要通過3 個過程：1）飲食中游離的EA在胃部和近端小腸被吸收；2）ET在小腸水解釋放EA，部分EA被小腸上皮細(xì)胞吸收；3）未被吸收的EA和ET進(jìn)入結(jié)腸，被微生物代謝產(chǎn)生尿石素，尿石素被腸上皮細(xì)胞吸收進(jìn)入體循環(huán)。

圖2 EA代謝途徑[24]Fig. 2 Metabolic pathway of EA[24]

將EA與人類糞便懸液經(jīng)體外厭氧培養(yǎng)后，可檢測到尿石素；在服用300 g樹莓的回腸造瘺患者回腸液中回收到241%的EA，但其尿液中僅檢測到低于1%的EA而未檢測到尿石素，這進(jìn)一步證實(shí)了EA主要在胃部和小腸段水解釋放，而后腸段微生物在EA代謝和尿石素生成過程中發(fā)揮重要作用[19,25]。雖然科學(xué)家們提出了微生物介導(dǎo)尿石素的合成，但在這一過程中涉及到的特定細(xì)菌仍是未知的。并且尚不清楚ET釋放EA的過程中是否有腸道微生物的參與，以及微生物的參與是否可以使ET不通過EA而直接代謝合成尿石素。最近，從人類糞便樣品中分離出兩株產(chǎn)生尿石素的細(xì)菌，這些細(xì)菌屬于科氏桿菌科并被命名為Gordonibacter urolithinfaciens（DSM 27213T）和Gordonibacter pamelaeae（DSM 19378T）[26-27]。經(jīng)高效液相色譜-質(zhì)譜（high performance liquid chromatographymass spectrometry，HPLC-MS）分析顯示，這些微生物依次產(chǎn)生Uro-M5、Uro-M6和Uro C，但是未在培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)Uro A、isoUro A和Uro B。研究人員認(rèn)為尿石素最終的分解代謝需要其他Gordonibacterspp的參與，或者體內(nèi)的生理環(huán)境對于Gordonibacter urolithinfaciens（DSM 27213T）和Gordonibacter pamelaeae（DSM 19378T）的去羥基作用和產(chǎn)生Uro A和Uro B至關(guān)重要。因此，為了完善EA代謝產(chǎn)生尿石素的生理過程，仍然需要后續(xù)的微生物分離與研究。

此外，腸道菌群的細(xì)菌類型和多樣性組成在不同人群中存在差異[26-27]，這也暗示了不同人群具有不同的EA分解代謝能力。研究人員根據(jù)攝入ET或EA后產(chǎn)生尿石素的定量和定性分析，將人群分為3種尿石素代謝表型，即尿石素代謝A、B和O型[28]（圖3）。按受試者尿石素排泄水平分類，將受試者分為高濃度尿石素生產(chǎn)者、低濃度尿石素生產(chǎn)者和極低濃度尿石素生產(chǎn)者，極低濃度尿石素生產(chǎn)者因?yàn)樯a(chǎn)尿石素濃度過低相當(dāng)于非生產(chǎn)者[2]。代謝A型人群的微生物可代謝產(chǎn)生Uro A及其軛合物；代謝B型人群的微生物可代謝產(chǎn)生Uro B及其軛合物；代謝O型人群的微生物無法代謝產(chǎn)生尿石素。長期服用或短期高劑量服用ET或者EA可使部分代謝O型人群（非生產(chǎn)者中的應(yīng)答者）轉(zhuǎn)化為代謝A型或B型[29]。

圖3 3種尿石素代謝表型Fig. 3 Three metabotypes of urolithins

3 EA及其尿石素類代謝產(chǎn)物的生物活性

近年來，國內(nèi)外許多科研人員對EA及其代謝產(chǎn)物的生物活性進(jìn)行了深入的探討與研究。本文結(jié)合體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、體內(nèi)動物模型以及人體臨床試驗(yàn)的研究結(jié)果，主要總結(jié)了3 個EA的生物活性特性：抑菌性和益生元特性、抗氧化特性、抗炎特性（表1）。

表1 EA的生理功能Table 1 Physiological functions of EA

3.1 調(diào)節(jié)腸道菌群

人們普遍認(rèn)為腸道對ET和EA的吸收利用度較低，而被腸道微生物分解代謝生成的尿石素則更容易被吸收。2005年，Cerda?等[30]首次證明了在攝入富含ET和EA的核桃提取物后，人類腸道微生物可生成尿石素類代謝產(chǎn)物。尹培培等[31]研究表明，在誘導(dǎo)結(jié)腸炎模型前20 d給予石榴提取物（可水解生成EA）和Uro A處理后，觀察到乳酸桿菌豐度顯著增加，揭示了EA及Uro A潛在的益生元活性。

3.1.1 EA調(diào)節(jié)腸道菌群

EA對一系列病原微生物具有生長抑制作用。板栗雄花序中提取出的EA對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有一定的抑制效果[32]。此外，EA對從消化道潰瘍患者腸道內(nèi)分離出的幽門螺桿菌（Helicobacter pylori）具有劑量依賴性抑制作用[33]；同時，EA對其他病原微生物的生長抑制作用也有報(bào)道，如霍亂弧菌（Vibrio cholerae）、痢疾志賀氏菌（Shigella dysenteriae）和彎曲桿菌（Campylobacterspp）[6]。反之，EA對益生菌和大部分雙歧桿菌不存在抑制作用。

3.1.2 尿石素類代謝產(chǎn)物調(diào)節(jié)腸道菌群

除EA之外，Uro A和Uro B具有通過抑制微生物群體感應(yīng)來抑制病原微生物的重要能力。群體感應(yīng)是一種微生物間的溝通機(jī)制，該機(jī)制可響應(yīng)小分子和自誘導(dǎo)物。細(xì)菌能通過該機(jī)制感應(yīng)種群密度、調(diào)節(jié)基因表達(dá)并控制與感染進(jìn)程相關(guān)的關(guān)鍵因素，如毒力、生物膜生成和運(yùn)動性[24]。

Giménez-Bastida等[35]研究表明，Uro A和Uro B在較低濃度（4 μmol/L）下可降低腸道病原菌耶爾森菌（Yersinia enterocolitica）生物膜的生物量以及其游動活力。且Giménez-Bastida等[35]認(rèn)為，Uro A和Uro B的抑菌作用主要是通過降低細(xì)菌?；呓z氨酸內(nèi)酯的釋放，并改變細(xì)菌的基因表達(dá)水平從而影響其內(nèi)酯與鞭毛的合成。以上研究表明，尿石素類代謝產(chǎn)物通過抑制病原菌、促進(jìn)或不影響有益菌群的生長來維持腸道微生物菌群的平衡，可作為潛在的對抗病原菌感染的抗生素替代品。

3.2 抗氧化性

氧化應(yīng)激會破壞蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸，引起慢性炎癥，是導(dǎo)致多種疾病的重要因素。諸多研究表明，EA作為一種有效清除自由基的強(qiáng)氧化劑，對維持機(jī)體氧化還原穩(wěn)態(tài)、氧化應(yīng)激損傷修復(fù)具有重要的調(diào)節(jié)作用[24]。作為EA的代謝產(chǎn)物，尿石素保留了一定的抗氧化活性，其抗氧化能力與酚羥基數(shù)目有關(guān)[7]。在體外抗氧化實(shí)驗(yàn)中，僅具有兩個酚羥基的Uro A的抗氧化能力（1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl- 2-picryhydrazyl，DPPH）自由基清除能力和2,2’-連氮基-雙-(3-乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azinobis-3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonic acid，ABTS）陽離子自由基清除能力）明顯低于其前體物質(zhì)[36]。然而，在氧自由基吸收能力（oxygen radical absorbance capacity，ORAC）抗氧化實(shí)驗(yàn)中，與抗壞血酸相比，Uro A是尿石素類中抗氧化能力最強(qiáng)大的代謝產(chǎn)物[36]。由此可見，尿石素的抗氧化性高于人們對其最初的認(rèn)識，其抗氧化活性取決于不同的測定方式；鑒于自由基在不同疾病模型中發(fā)揮著重要作用，尿石素的抗氧化活性需結(jié)合不同的動物和疾病模型進(jìn)行深入研究。

3.2.1 EA通過脂質(zhì)過氧化作用發(fā)揮抗氧化性

活性氧自由基引起的脂質(zhì)過氧化是導(dǎo)致許多器官發(fā)病的共同誘因。MDA的含量可反映機(jī)體或器官脂質(zhì)過氧化的程度。在不同的動物和細(xì)胞模型中，EA和尿石素可顯著降低機(jī)體或器官的脂質(zhì)過氧化損傷。Yonar等[37]以彩虹鱒魚為研究對象，分別檢測了50、100、150 mg/kgmbEA的抗氧化活性，結(jié)果表明，3種濃度的EA均可降低肝、腎和脾臟中MDA的水平，并提高SOD、CAT和GSH活性。同時，在不同動物模型中，EA對特定條件下多種化學(xué)物質(zhì)和藥物誘發(fā)的臟器損傷具有保護(hù)作用。在亞砷酸鈉誘導(dǎo)大鼠心臟和血液毒性的模型中，EA（10 mg/kgmb和30 mg/kgmb）顯著降低了大鼠血液中MDA和一氧化氮（NO）的含量，提高了大鼠心臟GSH含量、CAT、SOD和谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GPx）活性[38]。在硫代乙酰氨基誘導(dǎo)的大鼠肝毒性模型中，EA顯著降低了血清中丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartate amino transferase，AST）和堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活力并抑制了肝臟中纖維化相關(guān)基因（基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）2和MMP9基因）的表達(dá)，同時降低了肝臟中MDA水平，增加了GPx活性[39]。在不同強(qiáng)氧化劑誘導(dǎo)的細(xì)胞模型中，Uro A、B、C和D似乎也表現(xiàn)出了降低細(xì)胞內(nèi)活性氧含量和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的活性。研究人員用尿石素混合物（Uro A、B、C和D）處理人類結(jié)腸癌細(xì)胞Caco-2細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生減少，氧化應(yīng)激減輕[40]。Qiu Zhengpeng等[41]通過測定膀胱癌T24細(xì)胞內(nèi)的ROS、MDA水平和SOD活性來驗(yàn)證EA和Uro A的抗氧化活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)EA和Uro A均可降低H2O2誘導(dǎo)的膀胱癌T24細(xì)胞中的ROS和MDA水平，并增加SOD活性，表明Uro A與其前體EA均可緩解T24細(xì)胞的氧化應(yīng)激。在H2O2誘導(dǎo)氧化損傷的HepG2細(xì)胞中，Uro A（150 μmol/L）處理細(xì)胞12 h后顯著降低了胞內(nèi)MDA、ROS、SOD和GPx水平[42]。此外，用Uro A和Uro B孵育降低了肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞增殖，這可能與尿石素具有細(xì)胞膜穿透性，從而引起細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)有關(guān)[43]。在順鉑誘導(dǎo)的腎臟損傷小鼠模型中，Jing Taile等[44]觀測到Uro A（100 mg/kgmb）預(yù)處理有效緩解了小鼠體內(nèi)GSH的消耗并降低了還原型輔酶II氧化酶2（reduced form of nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 2，NOX2）基因的表達(dá)。

3.2.2 EA通過調(diào)控線粒體功能發(fā)揮抗氧化性

ROS的增加與線粒體功能障礙有關(guān)，線粒體受損促使線粒體膜通透性迅速增加，導(dǎo)致線粒體膜電位崩潰、氧化磷酸化解耦聯(lián)以及線粒體滲透腫脹[45]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，EA和尿石素在不同動物和細(xì)胞模型中可通過維持線粒體功能緩解氧化應(yīng)激。Hwang等[46]對VK3誘導(dǎo)氧化損傷的人體肝臟細(xì)胞CHL細(xì)胞進(jìn)行10 mmol/L EA預(yù)處理，發(fā)現(xiàn)EA降低了線粒體膜電位缺失細(xì)胞的百分比；將VK3換成線粒體呼吸鏈復(fù)合體I的抑制劑魚藤酮，EA同樣可以阻止線粒體膜去極化，維持線粒體功能，緩解細(xì)胞氧化損傷。在慶大霉素誘導(dǎo)的大鼠腎臟損傷模型中，EA降低了線粒體ROS的含量，阻止了線粒體膜電位的缺失，減少了線粒體腫脹并降低了Cyt c的釋放，證明EA可通過保護(hù)線粒體功能緩解慶大霉素誘導(dǎo)的腎臟損傷[47]。Ryu等[48]對比Uro A在幼年蠕蟲（1 日齡）和老年蠕蟲（10 日齡）中對線粒體功能的調(diào)節(jié)作用，研究發(fā)現(xiàn)短期的Uro A處理（1 d）會暫時降低線粒體含量，但隨著時間的延長（10 d），Uro A激活了線粒體的生物合成，顯著增加了線粒體的含量以及呼吸鏈配體的基因與蛋白的表達(dá)，從而延長了蠕蟲的壽命。同時，Andreux等[49]首次在人體臨床試驗(yàn)中驗(yàn)證了Uro A的安全性（連續(xù)4周每天服用500 mg或1 000 mg Uro A），并報(bào)道了Uro A可通過調(diào)節(jié)老年人骨骼肌線粒體基因的表達(dá)改善其線粒體功能。然而，Yin?Peipei等[50]發(fā)現(xiàn)Uro C似乎與EA的生物活性不同，EA促進(jìn)了大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞的增殖，而Uro C顯著增加了PC12細(xì)胞中MDA和ROS的含量，刺激乳酸脫氫酶的釋放和線粒體膜去極化，并導(dǎo)致細(xì)胞停滯在S期，促進(jìn)細(xì)胞凋亡；Uro C還導(dǎo)致了B淋巴細(xì)胞瘤2凋亡家族（b-cell lymphoma-2/bcl2-associated X，Bcl-2/Bax）比值失衡，觸發(fā)了一系列半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase）級聯(lián)反應(yīng)。

線粒體自噬是線粒體的選擇性清除。線粒體自噬控制線粒體質(zhì)量，通過消除受損的線粒體來抑制ROS的過量累積，從而防止細(xì)胞過氧化損傷[51]。Shida等[52]研究發(fā)現(xiàn)線粒體自噬可通過調(diào)控線粒體的分裂與融合以清除功能受損的線粒體并抑制ROS的過量積累，對預(yù)防氧化損傷相關(guān)疾病的發(fā)生具有重要作用。Ryu等[48]對幼齡蠕蟲進(jìn)行短期Uro A處理（1 d），發(fā)現(xiàn)蠕蟲的線粒體含量顯著降低，但卻維持了最大呼吸能力，這一現(xiàn)象可能與Uro A誘導(dǎo)的線粒體自噬相關(guān)；與對照組相比，Uro A處理組促進(jìn)了線粒體自噬基因和線粒體分裂基因的表達(dá)，并通過敲除多個線粒體自噬相關(guān)基因（如Pink1、常染色體顯性O(shè)PA-1、自噬效應(yīng)蛋白（beclin1）基因）對此進(jìn)行了驗(yàn)證，進(jìn)一步在哺乳動物細(xì)胞系中驗(yàn)證Uro A對線粒體自噬的調(diào)控。在小鼠成肌細(xì)胞C2Cl2細(xì)胞和小鼠腸道上皮細(xì)胞Mode-K腸道細(xì)胞中，Uro A激活了參與自噬啟動的關(guān)鍵酶AMPKα以及張力蛋白同源物誘導(dǎo)的Pink-1和LC-3，并增加了激光共聚焦顯微鏡下分裂的線粒體網(wǎng)格形態(tài)[48]。此外，Ryu等[48]還證明了Uro A可提高小鼠肌肉功能，主要體現(xiàn)在增加了約9%的握力和57%的自發(fā)運(yùn)動量。與此同時，Lin Jialiang等[53]也驗(yàn)證了Uro A預(yù)處理可通過激活A(yù)MPKα誘導(dǎo)線粒體自噬，從而減少椎間盤內(nèi)側(cè)髓核（nucleus pulposus，NP）細(xì)胞的凋亡。

由以上研究可見，EA和尿石素對機(jī)體氧化應(yīng)激的調(diào)節(jié)機(jī)制主要包括：1）緩解脂質(zhì)過氧化，提高抗氧化酶的活性；2）維持線粒體功能，促進(jìn)線粒體生物合成；3）誘導(dǎo)線粒體自噬，清除功能受損的線粒體。然而，在不同的疾病模型和體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中，EA和Uro A的抗氧化調(diào)節(jié)機(jī)制存在差異，如短期的Uro A處理可能會誘導(dǎo)線粒體自噬，維持線粒體呼吸功能，而長期的Uro A處理則更傾向于促進(jìn)線粒體生物合成[48]。關(guān)于EA和Uro A對于線粒體自噬的調(diào)節(jié)作用仍需要更多的體內(nèi)體外研究進(jìn)行深入探討。

3.3 抗炎

許多研究已經(jīng)證實(shí)了酚類化合物的抗炎作用和免疫調(diào)節(jié)作用。EA的抗炎活性在多種疾病模型中得到驗(yàn)證，但其具體機(jī)制尚未明確。在結(jié)腸癌大鼠模型中，EA表現(xiàn)出化學(xué)保護(hù)作用，并通過抑制核轉(zhuǎn)錄因子kappa B（nuclear factor kappa B，NF-κB）的表達(dá)下調(diào)了一氧化氮合成酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、環(huán)氧化酶2（cyclooxyganese-2，COX-2）、TNF-α和IL-6的水平[54]。在糖尿病胰腺炎小鼠模型中，灌胃EA顯著降低了促凋亡蛋白cleaved-caspase 3、硫氧還蛋白相互作用蛋白（thioredoxin interacting protein，TNXIP）和IL-1β的水平，升高了血漿抗炎因子IL-10的水平[7]。同時，EA顯著減少了脂多糖誘導(dǎo)的小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞RAW264.7中IL-6，NO和前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE-2）的產(chǎn)生[1]。目前，EA抗炎活性的人類臨床研究較少，且實(shí)驗(yàn)結(jié)果并不完全一致。Shishehbor等[55]研究發(fā)現(xiàn)，40 位二型糖尿病患者連續(xù)4周每天服用50 g濃縮石榴汁后，血清中IL-6的水平顯著降低，而TNF-α水平并未改變。在透析病人中，連續(xù)12 個月每天服用100 mL石榴汁顯著降低了病人血液IL-6和TNF-α的水平；而在另一個臨床試驗(yàn)中，透析病人連續(xù)6 個月每天服用1 g石榴提取物，并未出現(xiàn)炎癥因子水平顯著的變化。上述臨床試驗(yàn)證據(jù)表明，服用大劑量的EA或長期服用時，可以減緩全身的炎癥反應(yīng)。除了石榴，EA同樣是黑莓中的最主要成分，在胃腸道消化環(huán)境體外模型中發(fā)現(xiàn)，添加黑莓提取物的消化液能夠抑制HepG2細(xì)胞中氨基酸誘導(dǎo)的ROS和超氧陰離子自由基生成，并且顯著提高SOD和CAT活性[56]。在脂多糖誘導(dǎo)的炎癥小鼠模型中，黑莓籽粉提取物對炎性因子IL-1β有明顯的抑制作用，并提示黑莓籽粉中的EA可能是其發(fā)揮抗炎作用的主要物質(zhì)[57]。

有研究人員認(rèn)為富含EA的食物（如石榴汁）攝入機(jī)體后在抗炎過程中發(fā)揮主導(dǎo)作用的物質(zhì)主要為EA和ET，而并不依賴食物中所含的其他酚類[58]。而EA在機(jī)體內(nèi)的利用和活性的發(fā)揮至少部分依賴于其代謝產(chǎn)物尿石素類。近年來，科研人員在不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭袑δ蚴仡惖目寡谆钚赃M(jìn)行了研究。在這些研究中，尿石素主要通過兩種方式調(diào)節(jié)抗炎反應(yīng)：1）降低調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)關(guān)鍵因子的表達(dá)與含量，如MCP-1、IL-6、IL-1、IL-8和TNF-α[25,59]；2）減弱成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的遷移以及單核細(xì)胞的黏附[60]，這些都是與炎癥功能障礙相關(guān)的關(guān)鍵步驟。然而，體循環(huán)中尿石素含量較低，許多體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中對于免疫應(yīng)答有效的尿石素工作濃度高達(dá)10～60 μmol/L，超過了血漿中這些代謝產(chǎn)物的生理濃度[21]。尿石素類軛合物在體循環(huán)中的含量高于游離的尿石素，其更適合在不同細(xì)胞模型中進(jìn)行體外驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。有報(bào)道稱，生理濃度的糖基化Uro A可抑制內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和單核細(xì)胞的黏附作用[60]；低濃度的糖基化Uro B可降低心肌細(xì)胞中MCP-1、CX3趨化因子配體1（chemokine C-X3-C motif ligand 1，CX3CL1）和血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的基因表達(dá)[58]。在動物模型中，Uro A對小鼠足水腫具有急性抗炎作用，這與其抗氧化活性相關(guān)[35]。同時，Uro A在尿道炎大鼠中可降低IL-1β的表達(dá)與PGE-2的水平[60-61]。然而，尿石素類的體內(nèi)研究報(bào)道有限，仍然需要進(jìn)一步的體內(nèi)動物實(shí)驗(yàn)和臨床研究，從而證明EA能通過抑制MAPK激酶的激活控制炎癥。

4 EA及其尿石素類代謝產(chǎn)物在腸道疾病研究中的應(yīng)用

近年來，炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）和結(jié)腸癌在我國的發(fā)病率一直呈上升趨勢，嚴(yán)重影響著人體健康。正確的日常飲食對結(jié)腸癌和炎癥性腸病的預(yù)防和患者的調(diào)護(hù)至關(guān)重要。研究證明，EA和尿石素在胃腸道可達(dá)到生物活性濃度[24]，并通過其抗菌、抗炎及抗氧化活性發(fā)揮對炎癥性腸病和結(jié)直腸癌的有效治療作用[62]。

4.1 炎癥性腸病

流行病學(xué)研究結(jié)果顯示，IBD和結(jié)直腸癌在世界范圍內(nèi)具有相似的流行率，提示長期的腸道炎癥與結(jié)直腸癌發(fā)病率密切相關(guān)[63]。Singh等[64]研究發(fā)現(xiàn)EA可降低葡聚糖硫酸鈉（dextran sulphate sodium，DSS）誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）小鼠中結(jié)腸過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）的含量，并通過防止結(jié)腸肥大細(xì)胞膜脫顆粒和抑制組胺釋放，發(fā)揮其預(yù)防炎癥和阻止結(jié)腸炎擴(kuò)散的作用。Marín等[65]驗(yàn)證了EA在急性和慢性UC模型中的抗炎作用，結(jié)果顯示EA可輕微改善高濃度DSS誘導(dǎo)的急性UC的嚴(yán)重程度并推遲發(fā)病時間，同時降低了炎癥因子IL-6、TNF-α和INF-γ的分泌；在1%和2% DSS誘導(dǎo)的長期慢性UC模型中，EA減少了潰瘍的擴(kuò)散及結(jié)腸質(zhì)量與長度之比。Marín等認(rèn)為EA緩解UC的主要機(jī)制包括抑制COX-2和iNOS的表達(dá)、調(diào)節(jié)p38MAPK、NF-κB以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄因子3（signal transduction and activator of transcription 3，STAT3）信號通路，并提出EA可作為治療UC的理想選擇[65]。在三硝基苯磺酸（trinitro-benzene-sulfonic acid，TNBS）誘導(dǎo)的小鼠克羅恩腸病（Crohn’s disease，CD）模型中，Rosillo等[66-67]發(fā)現(xiàn)EA可顯著降低MPO及促炎癥因子的含量與表達(dá)；同時，EA抑制了MAPK的磷酸化和NF-κB的易位，從而緩解了TNBS對小鼠腸道造成的損傷。同樣在小鼠CD模型中，研究人員發(fā)現(xiàn)Uro A可顯著降低結(jié)腸炎小鼠腸道通透性和過氧化物酶MPO的含量，并減少小鼠全身炎癥因子（IL-6、TNF-α、IL-1β）的產(chǎn)生，提示Uro A通過芳香烴受體（Ahr）-Nrf2通路途經(jīng)調(diào)節(jié)腸道黏膜結(jié)構(gòu)，緩解腸道損傷[68]。此外，富含EA的石榴汁和石榴提取物也被研究人員廣泛應(yīng)用在IBD疾病治療和研究中。有報(bào)道稱，石榴汁和石榴提取物可顯著降低DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎大鼠血清和黏膜中促炎癥因子PGE2、IL-18、IL-1β和NF-κB的水平、腸道黏膜損傷指數(shù)和疾病活性指數(shù)，從而降低疾病的嚴(yán)重程度[69-70]。綜合各項(xiàng)IBD疾病模型的研究發(fā)現(xiàn)，EA、Uro A和石榴提取物的作用機(jī)制強(qiáng)調(diào)了其對炎癥細(xì)胞因子PGE-2、TNF-ɑ、IL-1β等的調(diào)節(jié)作用，以及對p38 MAPK、NF-κB和STAT3信號通路的抑制作用。

4.2 結(jié)腸癌

科研人員將富含EA的石榴汁或石榴提取物應(yīng)用在結(jié)腸癌患者的臨床研究中，以期改善結(jié)腸癌患者的疾病活性指標(biāo)和術(shù)后恢復(fù)情況。35 名結(jié)腸癌患者連續(xù)每天服用900 mg富含EA的石榴提取物，并對比手術(shù)前后結(jié)腸組織中結(jié)腸癌相關(guān)基因的表達(dá)，結(jié)果顯示，石榴提取物調(diào)節(jié)了結(jié)腸組織中CD44、CTNNB1、CDKN1A、EGFR和TYMs基因表達(dá)水平[71]。在另一項(xiàng)臨床研究中，術(shù)前連續(xù)每天服用石榴提取物可顯著降低患者血液中內(nèi)毒素標(biāo)志物脂多糖結(jié)合蛋白的水平[72]。在臨床研究上初步得到了富含EA的石榴提取物對結(jié)腸癌的調(diào)控作用，研究人員進(jìn)一步在結(jié)腸癌細(xì)胞系模型中分析其具體的作用機(jī)制。近年來，研究人員在不同結(jié)腸癌細(xì)胞系（HT-29、HCT-116、SW480和SW620）中分別驗(yàn)證了EA對癌細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用[73]。EA和Uro A、Uro B的混合物被證實(shí)對Caco-2細(xì)胞的增殖具有抑制作用，這種抑制作用主要是通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)基因（細(xì)胞蛋白周期B1（cyclin B1，CCNB1）和人源重組蛋白1（cyclin B1 interacting protein，CCNB1IP1）基因）將癌細(xì)胞阻滯在S和G2/M期，同時抑制癌癥發(fā)展的相關(guān)基因（細(xì)胞癌基因c-Myc、磷酸化癌基因Fos、成纖維細(xì)胞生長因子受體2（fibroblast growth factor receptor 2，F(xiàn)GFR2）基因和表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）基因）的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[74]。石榴汁和石榴提取物能夠降低HT-29人結(jié)腸癌細(xì)胞系中TNF-α介導(dǎo)的COX-2蛋白表達(dá)水平以及NF-κB與絲蘇氨酸蛋白激酶（protein kinase B，AKT）的結(jié)合激活[75]。并且，Bai Chongfei等[76]首次證實(shí)了三甲基鞣花酸通過上調(diào)Bax、磷酸化Caspase 3以及下調(diào)Bcl-2抑制結(jié)腸癌細(xì)胞SW620細(xì)胞的生長，且發(fā)現(xiàn)該過程與VEGF/磷脂酰肌醇-3-激酶/AKT/雷帕霉素靶蛋白通路有關(guān)。在HCT-15結(jié)腸癌細(xì)胞中，其他研究人員發(fā)現(xiàn)了類似的EA和尿石素抑癌作用，并提示了該機(jī)制與絲裂素活化蛋白激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（extracellular signal-regulated kinase1/2，ERK1/2）途徑相關(guān)[77-78]。EA和尿石素靶向調(diào)控結(jié)腸癌的另一種可能是Wnt途徑[79-80]。EA（63 μmol/L）和Uro A（39 μmol/L）在可達(dá)到生理濃度下均可以抑制HEK T293結(jié)腸癌細(xì)胞中的Wnt途徑[79]。近期，有研究人員在結(jié)腸癌細(xì)胞系模型（HCT-116、Caco-2和HT-29）中發(fā)現(xiàn)Uro A，而非其他尿石素類代謝產(chǎn)物，能夠通過上調(diào)p43增加衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶的活性，從而發(fā)揮其抗癌作用；同時提出該實(shí)驗(yàn)中Uro A的抗癌作用可能與細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡無關(guān)[81]?？偨Y(jié)以上研究，EA和Uro A靶向調(diào)節(jié)結(jié)腸癌的可能機(jī)制為：1）調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和凋亡相關(guān)基因，但該作用可能與劑量相關(guān)；2）調(diào)控細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，如抑制AKT、ERK1/2、Wnt通路以及NF-κB磷酸化。

5 結(jié) 語

腸道微生物可將EA代謝為尿石素，尿石素通常比EA具有更高的吸收率和生物活性。反過來，EA與微生物間的相互作用也可增加微生物菌群多樣性、刺激有益菌群的生長并延緩致病菌株的感染。EA和尿石素可通過降低脂質(zhì)過氧化、增加抗氧化酶活性以及促進(jìn)抗炎癥因子的分泌、抑制炎癥因子的表達(dá)，同時還可調(diào)節(jié)相關(guān)的代謝途徑的表達(dá)，如Nrf2、TNF-α、NF-κB等發(fā)揮抗氧化和抗炎活性。但是，關(guān)于EA和尿石素在腸道疾病中作用機(jī)制的研究尚存空白。目前，對尿石素的直接生物學(xué)活性研究較少，主要集中在體外細(xì)胞模型中，而動物模型尤其是人體臨床試驗(yàn)的研究還不充足。并且，多數(shù)的體外模型實(shí)驗(yàn)中尿石素的活性濃度遠(yuǎn)高于機(jī)體生理?xiàng)l件下可達(dá)到的濃度。因此，應(yīng)繼續(xù)研究生理濃度下，EA及尿石素對腸道疾病模型的作用，或靶向研究腸道組織中兩者的代謝途徑和生理功能。此外，還需要深入研究微生物與EA和尿石素之間的相互作用以及確認(rèn)與該代謝途徑直接相關(guān)的微生物群落。EA和尿石素的生物特性以及其與腸道微生物的互作可有效地預(yù)防和緩解腸道疾病的發(fā)生與發(fā)展，未來仍需進(jìn)一步探究EA和尿石素的抗炎、抗氧化及其他潛在特性，以提高EA和尿石素的生物利用度，推廣其在臨床營養(yǎng)和腸道疾病治療中的應(yīng)用。