食品中恩諾沙星殘留檢測(cè)方法研究進(jìn)展

靳雨婷，陳金嬡，任濤濤，湯軼偉,*，王向紅，王 碩,3,*

（1.渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧 錦州 121013；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北 保定 071001；3.南開大學(xué)醫(yī)學(xué)院，天津市食品科學(xué)與健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300071）

恩諾沙星（enrofloxacin，ENR）是我國(guó)第一個(gè)食品動(dòng)物專用氟喹諾酮類藥物，其結(jié)構(gòu)式如圖1所示，該藥物可通過(guò)結(jié)合回旋酶亞基阻斷細(xì)菌DNA解鏈、切割與連接過(guò)程，從而實(shí)現(xiàn)抑菌和殺菌目的[1-2]。由于該藥物具有高效低毒、抗菌譜廣、耐藥交叉性小、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于畜禽及水產(chǎn)養(yǎng)殖過(guò)程[3]。然而，長(zhǎng)期、不規(guī)范或過(guò)量藥物使用造成食品和環(huán)境中ENR殘留量不斷增加，嚴(yán)重?fù)p害了生態(tài)環(huán)境和人類健康[4-5]。鑒于ENR藥物的潛在危害，我國(guó)制定了其在食品中的最大殘留限量（maximum residue limit，MRL）標(biāo)準(zhǔn)，規(guī)定動(dòng)物肌肉、脂肪及奶中ENR的MRL為100 μg/kg，牛、羊肝臟和家禽腎臟中ENR的MRL為300 μg/kg[6]。

圖1 ENR結(jié)構(gòu)式Fig. 1 Structural formula of enrofloxacin

準(zhǔn)確、便捷、穩(wěn)定的檢測(cè)方法是食品質(zhì)量安全的技術(shù)保障，綜述和分析近年國(guó)內(nèi)外食品中ENR藥物殘留最新檢測(cè)方法研究進(jìn)展具有重要意義。本文將從樣品前處理和食品中ENR殘留檢測(cè)方法兩方面進(jìn)行闡述。

1 樣品前處理方法

樣品前處理包括樣品制備、目標(biāo)物提取、凈化以及富集，是整個(gè)分析技術(shù)中的關(guān)鍵步驟，決定著檢測(cè)方法的準(zhǔn)確度、靈敏度和穩(wěn)定性。

1.1 樣品制備

動(dòng)物肌肉組織、臟器、水產(chǎn)品（去鱗、去皮或去殼）可食肌肉等樣品測(cè)定前需解凍、剪碎，經(jīng)組織勻漿機(jī)勻漿處理[7-8]；牛奶、奶粉等流體或粉末狀態(tài)樣品可直接進(jìn)行目標(biāo)物提取[9]。

1.2 提取、凈化和濃縮富集

ENR分子中含有羧基和哌嗪基結(jié)構(gòu)，易溶于酸性或堿性溶液。所以，食品樣品中ENR的提取溶劑多選用酸化乙腈或堿性乙腈。為提高目標(biāo)物的提取效率，楊金易等[10]以酸化乙腈為提取溶劑，分別研究了渦旋振蕩、搖床振蕩和超聲輔助提取方式對(duì)水產(chǎn)品中ENR提取效率的影響，結(jié)果顯示3種提取方式中渦旋振蕩提取效率最高，回收率為84.21%～91.07%?；|(zhì)效應(yīng)是影響分析結(jié)果準(zhǔn)確性的關(guān)鍵因素，消除基質(zhì)影響是檢測(cè)過(guò)程中的重要環(huán)節(jié)[11]。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（農(nóng)業(yè)部783號(hào)公告-2-2006）對(duì)水產(chǎn)品ENR等殘留藥物檢測(cè)中的基質(zhì)消除方法主要為液-液萃取法，通過(guò)目標(biāo)物與干擾物質(zhì)的溶解度不同而實(shí)現(xiàn)[7]。目前，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中樣品的ENR殘留提取、凈化和富集方法溶劑用量大、過(guò)程繁瑣。固相萃取技術(shù)是基質(zhì)影響消除的常用方法，該方法操作簡(jiǎn)便、快速、高效，回收率優(yōu)于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中液液萃取凈化方法[12]。李慧芳等[12]研究了C18材料、N-丙基乙二胺（primary secondary amine，PSA）吸附材料和氨基（－NH2）吸附材料在分散萃取中對(duì)魚肉樣品ENR等喹諾酮類藥物殘留吸附作用和凈化能力的影響，結(jié)果表明C18和PSA材料都具有較好的基質(zhì)凈化效果，但C18對(duì)目標(biāo)物的吸附作用會(huì)影響加標(biāo)回收率結(jié)果。

新型吸附材料制備技術(shù)的發(fā)展為食品中ENR殘留的提取和凈化提供了新的選擇。Li Zhaoqian等[13]合成了磁性金屬有機(jī)骨架/氧化石墨烯復(fù)合材料Fe3O4/MIL-100(Fe)/GO，用于牛奶樣品中ENR殘留的提取和凈化，首先樣品經(jīng)乙腈提取目標(biāo)物，用正己烷去除脂肪，再以合成的Fe3O4/MIL-100(Fe)/GO為吸附材料通過(guò)磁性分散萃取方法吸附提取液中的目標(biāo)物，然后用含有15%甲酸的甲醇溶液洗脫吸附的ENR用于熒光分析。分子印跡聚合物（molecularly imprinted polymers，MIPs）是對(duì)目標(biāo)物具有特異吸附能力的高分子化合物，已廣泛用于樣品前處理。Wang Xiaoxiao等[14]以ENR為模板分子，甲基丙烯酸為功能單體制備了ENR分子印跡聚合物，并建立了提取牛奶中ENR殘留的固相萃取方法，最優(yōu)條件下方法的加標(biāo)回收率為94.6%～109.6%，與C18固相萃取柱相比，樣品的加標(biāo)回收率顯著提高。表1為食品中ENR殘留的提取凈化方法。

表1 食品中ENR殘留提取凈化方法Table 1 Methods for extraction and purification of enrofloxacin residues in food samples

2 檢測(cè)方法

HPLC、色譜-質(zhì)譜聯(lián)用、毛細(xì)管電泳、免疫分析、熒光光譜等分析方法在ENR檢測(cè)中的應(yīng)用已有報(bào)道[15-16]。近年來(lái)，新型功能材料的應(yīng)用和檢測(cè)方法的創(chuàng)新大大豐富了食品中ENR殘留的檢測(cè)技術(shù)，提高了分析方法的靈敏度、便捷度或檢測(cè)速度。

2.1 熒光檢測(cè)法

碳基熒光材料具有制備簡(jiǎn)單、毒性低、熒光信號(hào)穩(wěn)定、生物兼容性好、易修飾等優(yōu)點(diǎn)，是近些年新興的熒光材料[17]。Guo Xingjia等[18]以蘋果酸和甘氨酸為原料制備了表面富含羧基和氨基的碳量子點(diǎn)，研究顯示該量子點(diǎn)熒光可被Cu2＋以電子轉(zhuǎn)移方式猝滅，當(dāng)檢測(cè)系統(tǒng)中含有ENR時(shí)，Cu2＋從碳量子點(diǎn)上脫離，然后與ENR結(jié)合，體系熒光得到恢復(fù)，基于該原理建立了ENR檢測(cè)方法，最優(yōu)條件下該方法的線性范圍為1.0～15.0 μg/mL，最低檢出限（limit of detection，LOD）為0.16 μg/mL。氧化石墨烯是石墨烯的一種重要衍生物，能高效猝滅ENR、熒光染料、熒光納米顆粒等材料的熒光（圖2）。Dolati等[19]利用氧化石墨烯的廣譜熒光淬滅特性和篩選出的ENR特異性核酸適配體，建立了牛奶中ENR殘留的熒光檢測(cè)方法，最優(yōu)條件下該檢測(cè)方法的線性范圍為5～250 nmol/L、LOD為3.7 nmol/L、加標(biāo)回收率為94.1%～108.5%，該方法簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)，適合現(xiàn)場(chǎng)牛奶樣品中藥物殘留檢測(cè)。

圖2 基于氧化石墨烯和核酸適配體的ENR檢測(cè)示意圖Fig. 2 Schematic representation of the sensing mechanism of graphene oxide and aptamer-based label-free assay for ENR detection

上轉(zhuǎn)換熒光納米材料具有反斯托克斯（Stocks）發(fā)光特性，其發(fā)射光譜窄、熒光壽命長(zhǎng)、基質(zhì)干擾小，是當(dāng)前熒光檢測(cè)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)[20]。Liu Xiuying等[21]以核酸適配體修飾磁性納米材料，互補(bǔ)核酸鏈修飾上轉(zhuǎn)換熒光納米材料構(gòu)建了雜交型ENR檢測(cè)熒光探針，并建立了魚樣中ENR殘留檢測(cè)方法，結(jié)果顯示樣品的加標(biāo)回收率為85.1%～98.5%、LOD為0.06 ng/mL，該方法簡(jiǎn)單、快速、靈敏、抗基質(zhì)干擾能力強(qiáng)。為了提高ENR分子印跡上轉(zhuǎn)換熒光探針的特異性，Liu Xiuying等[22]首先將核酸適配體偶聯(lián)于上轉(zhuǎn)換納米材料表面，再加入目標(biāo)物ENR，待ENR與核酸適配體結(jié)合后再以甲基丙烯酸為功能單體在材料表面合成分子印跡膜，制備上轉(zhuǎn)換熒光探針。該熒光探針中甲基丙烯酸和核酸適配體的雙識(shí)別位點(diǎn)提高了探針的選擇性，檢測(cè)結(jié)果顯示魚樣中ENR加標(biāo)回收率為87.05%～96.24%、LOD為0.04 ng/mL。Tang Yiwei等[23]以上轉(zhuǎn)換納米材料的內(nèi)熒光為引發(fā)能量構(gòu)建了核殼可控型分子印跡上轉(zhuǎn)換熒光探針，通過(guò)控制聚合時(shí)間實(shí)現(xiàn)了探針分子印跡殼厚度的控制，該探針對(duì)ENR等喹諾酮類藥物具有廣譜識(shí)別特性，對(duì)ENR檢測(cè)的線性范圍為1.03 nmol/L～0.28 μmol/L。

鑭系離子可與多種抗菌類化合物形成螯合物，分子內(nèi)能量從有機(jī)配體的三重態(tài)轉(zhuǎn)移到鑭系離子，使熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，這種鑭系敏化的熒光檢測(cè)方法已用于食品安全檢測(cè)。Ershadi等[24]在鋱敏化熒光基礎(chǔ)上，利用Ag納米離子再次放大體系熒光信號(hào)建立了牛奶中ENR殘留的快速檢測(cè)方法，最優(yōu)條件下該方法的線性范圍為0.05～0.60 mg/L、LOD為0.021 mg/L。

Accublue是一種熒光染料，游離或與單鏈DNA共存時(shí)，熒光強(qiáng)度弱，與雙鏈DNA共存時(shí)，其熒光信號(hào)顯著增強(qiáng)[25]。劉若冰等[26]利用Accublue的這種特性與ENR核酸適配體及其互補(bǔ)鏈建立了ENR熒光檢測(cè)方法，最優(yōu)條件下該方法的檢測(cè)線性范圍為20～1 000 μg/L、LOD為9.96 μg/L，對(duì)奶粉、蝦肉和牛肉樣品檢測(cè)的加標(biāo)添加回收率為76.54%～98.79%。

比率熒光傳感檢測(cè)方法具有自校準(zhǔn)特性，可有效消除由于光源波動(dòng)、探針濃度改變及環(huán)境變化對(duì)檢測(cè)結(jié)果帶來(lái)的影響，提高檢測(cè)方法的穩(wěn)定性。Wang Zhongxia等[27]以三聚氰胺為原料，通過(guò)水熱反應(yīng)制備了碳熒光納米探針，研究發(fā)現(xiàn)該探針的最大熒光發(fā)射波長(zhǎng)為290 nm，恰是目標(biāo)物ENR的熒光激發(fā)波長(zhǎng)。基于內(nèi)濾效應(yīng)，ENR可有效猝滅該熒光探針的熒光（290 nm），同時(shí)又可發(fā)射熒光（412 nm），在此基礎(chǔ)上建立了比率熒光（FL412nm/FL290nm）檢測(cè)牛奶中ENR殘留的標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性范圍為0.05～200.00 μmol/L、LOD為22.43 nmol/L。實(shí)際牛奶樣品只需過(guò)膜（0.45 μm）、離心，取上清液用Tris-HNO3緩沖液稀釋后即可檢測(cè)。

熒光分析是一種靈敏度高、所用設(shè)備簡(jiǎn)單的分析方法。適配體、MIPs、上轉(zhuǎn)換熒光納米材料的應(yīng)用以及比率熒光檢測(cè)方法的建立改善了傳統(tǒng)熒光分析方法在復(fù)雜食品樣品中對(duì)ENR檢測(cè)的特異性、選擇性或穩(wěn)定性。

2.2 表面增強(qiáng)拉曼散射光譜法

表面增強(qiáng)拉曼散射技術(shù)（surface enhancement of Raman scattering，SERS）是目前食品潛在危害物超痕量檢測(cè)研究的熱點(diǎn)。Li Hongji等[28]通過(guò)抽吸過(guò)濾法將制備的粗糙Ag顆粒固定于聚偏二氟乙烯薄膜表面，該Ag-SERS傳感膜對(duì)ENR鹽酸鹽具有超靈敏度，最佳檢測(cè)條件下建立的SERS檢測(cè)方法對(duì)目標(biāo)物檢測(cè)的線性范圍為1～200 nmol/L、LOD為0.01 nmol/L。Ag-SERS傳感膜的構(gòu)建及SERS檢測(cè)方法的建立為食品中痕量ENR殘留的痕量檢測(cè)奠定了基礎(chǔ)。Chen Jie等[29]以納米纖維素纖維多孔膜（nanocellulose fibers，NCF）為模板制備了Ag-NCF基質(zhì)膜，Ag納米粒子原位生長(zhǎng)于纖維素交叉處形成敏感銀團(tuán)簇提供高密度“熱點(diǎn)”，使電磁場(chǎng)顯著增強(qiáng)，制備的Ag-NCF基質(zhì)膜對(duì)食品中潛在危害物具有靈敏的SERS檢測(cè)信號(hào)，ENR檢測(cè)的LOD為0.069 mg/kg，制備的Ag-NCF膜可用于魚樣中ENR殘留的原位檢測(cè)，檢出量可達(dá)1 mg/kg，該膜的制備為食品中抗生素殘留的現(xiàn)場(chǎng)快速SERS檢測(cè)提供了新型信號(hào)增強(qiáng)基底材料。

基底信號(hào)放大材料制備技術(shù)和新材料的開發(fā)提高了SERS檢測(cè)方法靈敏度，也為實(shí)現(xiàn)食品中ENR殘留原位檢測(cè)奠定了基礎(chǔ)。

2.3 微生物檢測(cè)法

基于抗生素對(duì)微生物生長(zhǎng)、代謝及其他生理機(jī)能抑制建立的微生物檢測(cè)法是食品中抗生素殘留測(cè)定的常用方法[30]。Tumini等[31]以地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformisATCC14580）為指示微生物，以三苯基四唑和甲苯胺藍(lán)為氧化還原指示劑，選擇550 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，直接在微孔酶標(biāo)板中建立了牛奶中ENR殘留檢測(cè)方法，結(jié)果顯示該方法的反應(yīng)時(shí)間為5.5 h，牛奶樣品的LOD為109 μg/L。葡萄糖是細(xì)菌生長(zhǎng)需要的重要能量源之一，其濃度與體系中微生物的數(shù)量和生長(zhǎng)速率密切相關(guān)。Kwon等[32]將牛奶樣品與含有大腸桿菌（E. coliATCC 11303）和葡萄糖的LB培養(yǎng)基混合培養(yǎng)，通過(guò)血糖儀測(cè)定細(xì)菌代謝消耗的葡萄糖濃度，樣品中抗生素ENR含量越多，葡萄糖的消耗量越低，結(jié)果表明該方法的LOD為5 ng/mL、測(cè)定時(shí)間為2 h，用葡萄糖試紙進(jìn)行高通量篩選時(shí)，可通過(guò)肉眼定性分析葡萄糖濃度的變化。圖3A為基于血糖儀和葡萄糖試紙檢測(cè)ENR殘留示意圖。

Lee等[33]以大腸桿菌（Escherichia coliATCC 11303）為指示微生物，基于樣品中抗生素含量與細(xì)菌呼吸產(chǎn)生CO2量（通過(guò)毛細(xì)管中紅墨水上升的高度顯示CO2的產(chǎn)生量）的關(guān)系建立了牛奶中ENR殘留檢測(cè)方法，該方法操作簡(jiǎn)單，不需要分析儀器，最優(yōu)條件下該方法的LOD為10 ng/mL、反應(yīng)時(shí)間為2 h。圖3B為基于CO2產(chǎn)生量檢測(cè)ENR方法示意圖。

基于微生物的ENR殘留檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)單，不需要復(fù)雜的分析儀器，但該方法的靈敏度、選擇性、精密度相對(duì)較低，適合食品中ENR等抗生素殘留的廣譜篩查監(jiān)測(cè)。

圖3 基于血糖儀和葡萄糖試紙檢測(cè)ENR殘留示意圖（A）和基于CO2產(chǎn)生量檢測(cè)ENR方法示意圖（B）Fig. 3 Schematic diagram of enrofloxacin detection using a personal glucose meter with glucose test strips (A) and schematic diagram of the enrofloxacin detection method based on CO2 production during Escherichia coli respiration (B)

2.4 電化學(xué)分析法

電化學(xué)分析法通常以電極或以抗體、適配體、酶、分子印跡聚合物等生物分子或高分子聚合物為分子識(shí)別元件修飾的電極為基礎(chǔ)，通過(guò)測(cè)定電阻、電位、電流等信號(hào)變化實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)物的定量分析[34]。Liu Yuting等[35]通過(guò)將CdS納米顆粒修飾于電極表面，該修飾顯著增大了電極的表面積、提高了電子傳輸速率、縮短了響應(yīng)時(shí)間，最優(yōu)條件下該電極對(duì)ENR檢測(cè)的LOD為9.5h10－8mol/L，檢測(cè)時(shí)間小于40 s。

共價(jià)有機(jī)骨架（covalent organic frameworks，COFs）是一種新型晶體多孔材料，具有表面積大、孔穴結(jié)構(gòu)規(guī)則、機(jī)械穩(wěn)定性強(qiáng)、易于修飾等特點(diǎn)，是目前電化學(xué)傳感器研究的熱點(diǎn)[36]。Wang Minghua等[37]以1,3,6,8-4(4-甲?；交?芘與三聚氰胺為原料通過(guò)縮合聚合反應(yīng)制備了COFs，然后將該骨架修飾于Au電極表面，再通過(guò)π-π堆積作用和靜電吸附作用偶聯(lián)ENR核酸適配體，結(jié)果顯示，基于該電極建立的電化學(xué)檢測(cè)方法對(duì)ENR具有超高的靈敏度、寬的線性范圍（0.01～2 000.00 pg/mL）和極低的檢出限（6.07 fg/mL），適合食品中超痕量ENR殘留的快速檢測(cè)分析。Song Yingpan等[38]基于CoNi和2,3,6,7,10,11-六氨基三苯合成金屬有機(jī)骨架（metalorganic frameworks，MOFs），該MOFs具有類似石墨烯的二維片狀結(jié)構(gòu)，在水溶液中穩(wěn)定、電化學(xué)活性好，修飾于電極后偶聯(lián)核酸適配體，建立的電化學(xué)檢測(cè)方法對(duì)ENR檢測(cè)的線性范圍為0.001～1.000 pg/mL、LOD為0.2 fg/mL，實(shí)驗(yàn)中構(gòu)建的MOFs電極穩(wěn)定性、選擇性、重現(xiàn)性較好。

硼摻雜金剛石電極（boron-doped diamond，BDD）是一種新型電極，具有電化學(xué)勢(shì)窗寬、析氧過(guò)電位高、耐腐蝕等優(yōu)點(diǎn)，在電化學(xué)傳感器具有良好的應(yīng)用前景[39]。Donmez等[40]以BDD為工作電極，在表面活性劑十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）（0.9 μmol/L）信號(hào)增敏作用下建立了ENR電化學(xué)檢測(cè)方法，最優(yōu)條件下，響應(yīng)信號(hào)與ENR濃度在0.025～1.000 μg/mL之間呈線性關(guān)系，LOD為0.005 7 μg/mL。

用CdS、COFs、MOFs等材料修飾電極，通過(guò)增加電極表面積、提高電子傳輸速率可顯著增加電化學(xué)檢測(cè)方法的靈敏度；在電極表面修飾分子識(shí)別元件酸適配體可提高檢測(cè)方法的特異性和選擇性。

2.5 免疫分析法

酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）操作簡(jiǎn)單、高效快速，是食品安全快速篩查檢測(cè)的常用方法之一。為提高ELISA檢測(cè)生牛乳中ENR殘留的靈敏度，Hu Song等[41]使用分子描述符輔助篩選出適合用于檢測(cè)的異源競(jìng)爭(zhēng)吸附抗原，結(jié)果顯示以沙氟沙星-牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）為包被原，以酶標(biāo)二抗為探針建立的ELISA方法對(duì)牛奶中ENR殘留檢測(cè)的靈敏度是ENR-BSA為包被原的6 倍，該研究通過(guò)分析包被原表位的靜電電位分布解釋了吡哌酸-BAS、達(dá)氟沙星-BSA、普盧利沙星-BSA、培氟沙星-BSA等包被原與單克隆抗體識(shí)別的機(jī)制，為ELISA方法中異源包被原的選擇提供了理論基礎(chǔ)。

熒光偏振免疫分析方法（fluorescence polarization immunoassay，F(xiàn)PIA）是利用熒光偏振原理，基于與抗體競(jìng)爭(zhēng)吸附機(jī)制建立的檢測(cè)小分子物質(zhì)檢測(cè)方法，具有檢測(cè)成本低、速度快、高通量等優(yōu)點(diǎn)[42]。Shen Xing等[43]以ENR偶聯(lián)熒光素硫代氨基甲酰己二胺為示蹤探針，與目標(biāo)物ENR競(jìng)爭(zhēng)吸附多克隆抗體，檢測(cè)體系中熒光偏振強(qiáng)度與目標(biāo)物濃度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，最優(yōu)條件下該FPIA對(duì)ENR檢測(cè)的半抑制濃度（half-maximal inhibition concentration，IC50）為21.49 μg/kg，最低檢測(cè)限為1.68 μg/kg，豬肝和雞肉樣品的加標(biāo)回收率為91.3%～112.9%，檢測(cè)時(shí)間為8 min。

以熒光材料代替膠體金構(gòu)建免疫層析試紙，建立熒光免疫層析檢測(cè)方法可以大大提高膠體金試紙檢測(cè)的靈敏度和穩(wěn)定性。Sheng Wei等[44]以ZnCdSe/ZnS量子點(diǎn)標(biāo)記抗體為熒光探針、以ENR-卵清白蛋白（ovalbumin，OVA）為包被原固定于硝酸纖維素（nitrocellulose filter，NC）膜為檢測(cè)線（test line，T）線、以羊抗兔二抗固定于NC膜為控制線（control line，C）線構(gòu)建了ENR熒光免疫層析試紙，目標(biāo)物ENR與T線的ENR-OVA競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合量子點(diǎn)標(biāo)記抗體，樣品中ENR濃度越高，結(jié)合到T線的量子點(diǎn)標(biāo)記抗體越少，T線熒光強(qiáng)度越低，最優(yōu)條件下該試紙對(duì)動(dòng)物組織中ENR殘留的目測(cè)臨界含量為5 μg/kg，對(duì)牛奶中ENR殘留的目測(cè)臨界質(zhì)量濃度為10 μg/L，該試紙條可在20 min內(nèi)得出檢測(cè)結(jié)果，適合食品安全現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。Li Shijie等[45]基于熒光能量共振轉(zhuǎn)移原理設(shè)計(jì)構(gòu)建了熒光猝滅免疫層析試紙條，試紙條以熒光量子點(diǎn)-OVA偶聯(lián)物（熒光供體）固定于C線、以ENR-OVA和熒光量子點(diǎn)-OVA的混合物固定于T線、以納米金-抗體偶聯(lián)物為熒光受體，熒光受體首先與樣品提取液混合孵育，然后在毛細(xì)管作用下依次流經(jīng)T線和C線，當(dāng)提取液中不含ENR時(shí)，納米金-抗體偶聯(lián)物與T線處的ENR-OVA結(jié)合，量子點(diǎn)與納米金-抗體間發(fā)生熒光能量共振轉(zhuǎn)移使熒光猝滅，當(dāng)樣品中ENR含量足夠多時(shí)，T線熒光強(qiáng)度增強(qiáng)到與C線熒光強(qiáng)度相同，最優(yōu)條件下該試紙條對(duì)牛奶ENR殘留檢測(cè)的目測(cè)臨界濃度為2.5 μg/kg。

李詩(shī)潔等[46]將偶聯(lián)ENR抗體的瓊脂糖凝膠裝入固相萃取小柱制成免疫親和凝膠檢測(cè)柱，以ENR-OVA-量子點(diǎn)偶聯(lián)物為競(jìng)爭(zhēng)熒光探針，基于ENR、熒光探針與抗體的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合反應(yīng)建立了免疫親和凝膠柱快速檢測(cè)新方法，該方法可通過(guò)目測(cè)檢測(cè)柱的熒光強(qiáng)弱定性和半定量檢測(cè)食品中ENR殘留，最優(yōu)條件下該檢測(cè)柱對(duì)雞牛肉、羊肉、豬肝、三文魚、蝦等動(dòng)物源食品中ENR殘留的檢測(cè)限為20 μg/kg。與儀器方法相比，免疫親和凝膠柱檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)時(shí)間短、結(jié)果易判斷，在食品ENR殘留監(jiān)測(cè)篩選工作中有較廣的應(yīng)用前景。

基于DNA重組技術(shù)和蛋白質(zhì)工程技術(shù)發(fā)展的基因工程抗體制備周期短，可定向改造抗體，使之更符合免疫分析檢測(cè)法的需求。Leivo等[47]利用寡核苷酸靶向隨機(jī)誘變技術(shù)獲得了對(duì)喹諾酮類藥物具有高親和力和特異性的廣譜抗體，開發(fā)了時(shí)間分辨熒光免疫分析方法，該方法可從全乳樣品中檢測(cè)ENR、二氟沙星、沙氟沙星、環(huán)丙沙星、達(dá)氟沙星、諾氟沙星、氟甲喹、馬波沙星8種氟喹諾酮類藥物殘留，有效地縮短檢測(cè)時(shí)間。

MIPs具有類似生物抗體的特異性且制備簡(jiǎn)單、耐有機(jī)溶劑、可重復(fù)使用，是生物抗體的理想替代材料。Wang Jing等[48]以ENR為模板分子、甲基丙烯酸為功能單體、乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯(lián)劑、偶氮二異丁腈為引發(fā)劑、甲醇-二甲基甲酰胺混合溶劑為致孔劑，直接在96 孔酶標(biāo)板中合成分子印跡膜并建立了直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)ENR方法，該方法的LOD為1.1 ng/mL，靈敏度（IC50）為85.7 ng/mL。呂春暉等[49]采用同樣方法，以甲醇-甲苯混合溶劑為致孔劑制備了ENR分子印跡膜并建立了ELISA檢測(cè)ENR方法。分子印跡仿生ELISA檢測(cè)方法的準(zhǔn)確度、精密度及特異性能滿足檢測(cè)要求，與傳統(tǒng)ELISA方法相比省時(shí)經(jīng)濟(jì)，可以應(yīng)用于實(shí)際樣品中ENR殘留的快速檢測(cè)。

與傳統(tǒng)酶標(biāo)記、膠體金標(biāo)記免疫分析方法相比，熒光免疫分析方法靈敏度高、抗基質(zhì)干擾能力強(qiáng)、穩(wěn)定性好，將是未來(lái)幾年免疫分析檢測(cè)研究的熱點(diǎn)，基因重組抗體可定向改造抗體性能，應(yīng)用范圍更廣。用MIPs膜代替生物抗體建立仿生ELISA方法是ENR殘留檢測(cè)方法的創(chuàng)新探索，具有較廣的應(yīng)用前景。

2.6 石英晶體微天平檢測(cè)方法

石英晶體微天平（quartz crystal microbalance，QCM）是一種基于石英集體壓電效應(yīng)的高靈敏質(zhì)量檢測(cè)儀器，具有檢測(cè)簡(jiǎn)單、快速、高精度等優(yōu)點(diǎn)[50]。Pan Mingfei等[51]以ENR為模板分子、3-氨丙基三乙氧基硅烷為功能單體、四乙氧基硅烷為交聯(lián)劑、N,N-二甲基甲酰胺為致孔劑，熱引發(fā)聚合制備了ENR分子印跡聚合物，然后將該印跡聚合物修飾于Au電極表面構(gòu)建QCM壓電傳感器，最優(yōu)條件下該傳感器對(duì)動(dòng)物源食品中ENR殘留具有較低的檢出限（牛奶為0.31 μg/L、雞蛋為0.44 μg/kg、雞肉為0.54 μg/kg、豬肉為0.57 μg/kg），該傳感器至少可重復(fù)使用30 次。

3 結(jié) 語(yǔ)

ENR抗菌藥物在畜禽及水產(chǎn)養(yǎng)殖過(guò)程中的廣泛應(yīng)用大大增加了環(huán)境污染和食品安全的風(fēng)險(xiǎn)水平。復(fù)雜的食品基質(zhì)使樣品前處理技術(shù)的改良勢(shì)在必行，嚴(yán)格的獸藥殘留限量標(biāo)準(zhǔn)對(duì)檢測(cè)技術(shù)提出了更高的要求。與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)相比，吸附材料Oasis HLB、C18、PSA、Fe3O4/MIL-100(Fe)/GO和MIPs在樣品前處理中的應(yīng)用顯著提高了食品中ENR殘留的提取效率，縮短了樣品前處理時(shí)間。新型功能材料（量子點(diǎn)、上轉(zhuǎn)換納米熒光材料、MIPs、MOFs等）在熒光檢測(cè)方法、電化學(xué)檢測(cè)方法、免疫分析方法、表面增強(qiáng)拉曼散射光譜法中的應(yīng)用大大提高了原有檢測(cè)方法的靈敏度、穩(wěn)定性或精密度。QCM檢測(cè)和基于微生物的新型檢測(cè)方法建立豐富了我國(guó)食品安全檢測(cè)方法，為食品中ENR殘留檢測(cè)提供了新的技術(shù)支持。

食品中ENR殘留檢測(cè)取得了一定進(jìn)展，但依然不能完全滿足當(dāng)下食品行業(yè)或市場(chǎng)監(jiān)管檢測(cè)需求。因此，食品中ENR檢測(cè)方法的研究可在以下幾個(gè)方面突破：1）制備高特異性ENR吸附材料用于樣品前處理，提高樣品前處理過(guò)程的自動(dòng)化程度，建立標(biāo)準(zhǔn)化前處理方法，提高檢測(cè)方法穩(wěn)定性；2）利用光譜檢測(cè)，結(jié)合數(shù)據(jù)處理和圖像分析技術(shù)，開發(fā)ENR殘留原位無(wú)損快速檢測(cè)技術(shù)；3）研發(fā)基于熒光比色的可視化、便攜化、小型化、智能化檢測(cè)平臺(tái)，為現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)ENR開拓前景；4）創(chuàng)新MIPs合成方法，提高批次間ENR分子印跡仿生抗體的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性，建立化學(xué)發(fā)光、熒光等新型仿生免疫分析方法。

開展食品中ENR殘留的快速、簡(jiǎn)便、靈敏的檢測(cè)技術(shù)成為提高食品品質(zhì)的重要手段，只有不斷改進(jìn)和完善樣品前處理級(jí)檢測(cè)技術(shù)，才能確保消費(fèi)者健康和動(dòng)物源食品安全。