張慧芳 孫文
摘 要:建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS)測定牛奶中9種磺胺類藥物的數(shù)學(xué)模型,并對測定過程的不確定度進(jìn)行了評估。當(dāng)牛奶中磺胺二甲嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺吡啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲異嘧啶、磺胺甲氧嘧啶、磺胺甲基異噁唑、磺胺異噁唑和磺胺二甲氧基嘧啶的含量分別為21.272 μg·L-1、22.336 μg·L-1、19.352 μg·L-1、21.312 μg·L-1、20.840 μg·L-1、22.680 μg·L-1、20.456 μg·L-1、21.816 μg·L-1和18.208 μg·L-1時,擴(kuò)展不確定度分別為0.323 2 μg·L-1、0.255 8 μg·L-1、0.093 8 μg·L-1、0.127 4 μg·L-1、0.127 4 μg·L-1、0.167 6 μg·L-1、0.155 2 μg·L-1、0.083 4 μg·L-1和0.321 8 μg·L-1(k=2)。結(jié)果表明,影響檢測結(jié)果的主要因素是標(biāo)準(zhǔn)工作曲線,其次是重復(fù)性。
關(guān)鍵詞:高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法;磺胺;牛奶;不確定度
Uncertainty Evaluation of 9 Sulfonamides Residues in Milk by HPLC-MS Method
ZHANG Huifang, SUN Wen*
(Institute of Food and Grain Inspection Technology, Shanxi Inspection and Testing Center,?Taiyuan 030012, China)
Abstract: A mathematical model for the determination of nine sulfonamides in milk by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS) was established, and the uncertainty of the determination process was evaluated. When the contents of sulfadimidine, sulfadiazine, sulfapyridine, sulfamerazine, sulfisomidine, sulfameter, sulfamethoxazole, sulfisoxazole and sulfadimethoxine in milk were 21.272 μg·L-1, 22.336 μg·L-1,?19.352 μg·L-1, 21.312 μg·L-1, 20.840 μg·L-1, 22.680 μg·L-1, 20.456 μg·L-1, 21.816 μg·L-1 and 18.208 μg·L-1,?the expanded uncertainties were 0.323 2 μg·L-1, 0.255 8 μg·L-1, 0.093 8 μg·L-1, 0.127 4 μg·L-1, 0.127 4 μg·L-1,0.167 6 μg·L-1, 0.155 2 μg·L-1, 0.083 4 μg·L-1 and 0.321 8 μg·L-1(k=2). The results showed that the main sources of?uncertainty arose from the standard curve fitting and repeatability.
Keywords: high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry; sulfonamides; milk; uncertainty
磺胺類藥物(Sulfonamides)由于具有較廣的抗菌譜以及低廉的成本,在各類養(yǎng)殖行業(yè)被廣泛用于抑制細(xì)菌感染導(dǎo)致的各類疾病[1]。目前,檢測磺胺類藥物的常用方法是高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[2]。文中測定方法參考《牛奶中磺胺類藥物殘留量的測定》(農(nóng)業(yè)部781號公告—12—2006)[3],對文件規(guī)定的9種磺胺類藥物進(jìn)行檢測。根據(jù)《化學(xué)分析測量不確定度評定》(JJF 1135—2005)[4]和《測量不確定度評定與表示》(JJF 1059.1—2012)[5]評定牛奶中9種磺胺類藥物殘留檢測結(jié)果的不確定度并分析不確定度的影響因素。
1 材料與方法
1.1 材料與試劑
磺胺二甲嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺吡啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲異嘧啶、磺胺甲氧嘧啶、磺胺甲基異噁唑、磺胺異噁唑和磺胺二甲氧基嘧啶的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(100 μg·mL-1,純度均大于99.5%,北京曼哈格公司)和13C6-磺胺甲噁唑(純度均大于99.5%,德國Dr.Ehrenstorfer公司);甲酸、甲醇、乙腈均為色譜純(德國默克公司);牛奶選用磺胺類陰性備用樣品。
1.2 儀器與設(shè)備
5500 QTRAP高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國SCIEX公司);KDC-140HR臺式高速冷凍離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器公司);BSA124S-CW電子天平(瑞士梅特勒-托利多集團(tuán))。
1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制與加標(biāo)樣制備
乙腈溶解13C6-磺胺甲噁唑固體配制100 μg·mL-1的內(nèi)標(biāo)儲備溶液,再用乙腈稀釋得100 ng·mL-1的內(nèi)標(biāo)工作液。用超純水稀釋內(nèi)標(biāo)工作液得到12.5 ng·mL-1的內(nèi)標(biāo)稀釋液,用內(nèi)標(biāo)稀釋液稀釋4種磺胺類混合標(biāo)準(zhǔn)液得到含有磺胺標(biāo)準(zhǔn)品濃度為0.5 ng·mL-1、1.0 ng·mL-1、2.0 ng·mL-1、5.0 ng·mL-1、10.0 ng·mL-1、20.0 ng·mL-1、50.0 ng·mL-1、100.0 ng·mL-1和200.0 ng·mL-1,內(nèi)標(biāo)濃度為12.5 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液。將不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液加入磺胺陰性牛奶中充分溶解獲得加標(biāo)牛奶樣品,冷藏備用。
1.4 樣品前處理
參照《牛奶中磺胺類藥物殘留量的測定》(農(nóng)業(yè)部781號公告—12—2006)中的處理方法。
1.5 儀器條件
液相色譜條件:C18色譜柱(100 mm×2.1 mm,3.5 μm);流速0.8 mL·min-1;柱溫35 ℃;進(jìn)樣量
2 μL;流動相0.02%甲酸水+0.02%甲酸乙腈,梯度洗脫。質(zhì)譜條件:電噴霧離子源正模式;掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測模式;脫溶劑氣溫度500 ℃;氣簾氣壓力50 psi;霧化氣壓力50 psi;內(nèi)標(biāo)法定量。
2 結(jié)果與分析
2.1 數(shù)學(xué)模型
9種磺胺含量的計算公式為
式中:X為樣品中被測物質(zhì)含量,μg·L-1;,C為試液中被測物質(zhì)濃度,ng·mL-1;V為試液的定容體積,mL;f為樣品溶液稀釋倍數(shù);V為樣品體積,mL。
2.2 不確定度來源
根據(jù)測量過程和建立的數(shù)學(xué)模型,該檢測方法的不確定來源主要有:①配制標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的不確定度;②樣品量取引入的不確定度;③擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的不確定度;④重復(fù)性引入的不確定度。
2.3 不確定度的評定
2.3.1 配制標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur(s)
該過程引入的不確定度由稱量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)以及標(biāo)準(zhǔn)溶液移取體積的不確定分量組成。
稱量使用電子天平由檢定證書得到最大允差為0.000 3 g,假定符合均勻分布,包含因子,則有標(biāo)準(zhǔn)不確定度為u(m)=0.000 173 2 g,稱取13C6-磺胺甲噁唑質(zhì)量為0.01 g,其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為ur(p)=u(m)/m=0.017 32。
標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制過程見1.3描述,構(gòu)成體積的不確定度分量由3個分量構(gòu)成。
(1)100 mL容量瓶體積V1有體積和溫度兩個分量。體積提供的分量為0.01 mL,溫度提供的分量為0.395 mL。故兩分量的合成不確定度u(V1)=0.399 mL,由定容體積V1引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為ur(V1)=0.003 99。
(2)1 mL移液槍體積V2只包含體積分量。由1 mL移液槍體積V2引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為ur(V2)=0.005 774。
(3)200 μL移液槍體積V3只包含體積分量。由200 μL移液槍體積V3引入的相對不確定為ur(V3)=0.002 309 4。100 mL容量瓶使用兩次,1 mL的移液槍和200 μL
移液槍各使用了8次,根據(jù)不確定度合成公式,配制標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur(s)為0.025 32。
2.3.2 樣品量取引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur(V)
樣品用200 μL移液槍量取定容,其產(chǎn)生的不確定度有體積和重復(fù)性兩個分量。
(1)體積。根據(jù)JJG 646—2006規(guī)定,200 μL移液器容量允差為±0.4%,即±0.000 8 mL,近似于矩形分布,=0.000 461 88 mL,由移液槍體積V1引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為ur(V1)=0.002 309 4 mL。
(2)重復(fù)性。JJG 646—2006給出6次測定的RSD≤0.2%。得標(biāo)準(zhǔn)偏差S≤0.2×0.2%=0.000 4 mL。
兩分量合成不確定度為u(V)=0.002 34 mL。
因此,由樣品量取定容體積V引入的相對不確定度為ur(V)=0.011 7。
2.3.3 擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的不確定度ur(curve)
校準(zhǔn)工作曲線線性回歸方程為A=B1ρ+B0,回歸曲線由儀器軟件計算得到。
由此樣品溶液中磺胺類含量的標(biāo)準(zhǔn)不確定度計算公式為
式中:u(ρ)為樣品溶液中被測組分的標(biāo)準(zhǔn)不確定度;s為校準(zhǔn)工作曲線殘余標(biāo)準(zhǔn)偏差;m為樣品溶液濃度x的測量次數(shù),為2;n為校準(zhǔn)工作曲線的測量次數(shù),
為6;ρ為樣品溶液中被測組分濃度與內(nèi)標(biāo)濃度比的平均值(取2倍定量限濃度):ρ(xz)為工作標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度與內(nèi)標(biāo)濃度比的平均值,ρ(xz)=3.453;ρi為第i個校準(zhǔn)溶液的濃度與內(nèi)標(biāo)濃度比,i=9;校準(zhǔn)工作曲線引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度公式為
由上述公式計算得到的9種磺胺類藥物校準(zhǔn)工作曲線引入的不確定度計算結(jié)果分別為0.229 7、0.172 1、
0.068 1、0.084 1、0.083 0、0.109 3、0.112 3、0.049 8和0.267 4。
2.3.4 重復(fù)性實驗引入的不確定度ur(rep)
對陰性樣品以2倍定量限加標(biāo)(加標(biāo)樣的理論濃度為2.50 ng·mL-1)后,加標(biāo)樣品6次重復(fù)測定。按正態(tài)分布計算,重復(fù)性的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為。因此,重復(fù)性測定的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為。由上述公式計算得到9種磺胺相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.023 4、0.019 1、0.009 5、0.022 7、0.026 7、0.007 9、0.009 3、0.013 1和0.030 5。
2.3.5 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度和擴(kuò)展不確定度U
合成不確定度為,,取包含因子k=2,擴(kuò)展不確定度為,由上述公式計算得到磺胺類藥物的不確定度評定結(jié)果如表1所示。
3 結(jié)論
通過對高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定牛奶中9種磺胺類物質(zhì)含量的不確定來源進(jìn)行分析,對不確定度分量進(jìn)行量化和合成,當(dāng)牛奶中9種磺胺類物質(zhì)含量分別為21.272 μg·L-1、22.336 μg·L-1、19.352 μg·L-1、21.312 μg·L-1、20.840 μg·L-1、22.680 μg·L-1、20.456 μg·L-1、21.816 μg·L-1和18.208 μg·L-1時,擴(kuò)展不確定度分別為0.323 2 μg·L-1、0.255 8 μg·L-1、0.093 8 μg·L-1、0.127 4 μg·L-1、0.127 4 μg·L-1、0.167 6 μg·L-1、0.155 2 μg·L-1、0.083 4 μg·L-1和0.321 8 μg·L-1(k=2)。在實際操作過程中應(yīng)提高標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的測定頻率、增加重復(fù)次數(shù)、盡量使用混標(biāo),減少單標(biāo)混合引起的誤差、選擇精度較高的吸量容器,從而確保標(biāo)準(zhǔn)曲線具有良好的線性和穩(wěn)定性,實驗數(shù)據(jù)具有良好的重復(fù)性。
參考文獻(xiàn)
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