弩藥液的鎮(zhèn)痛作用及對(duì)炎性疼痛因子TNF-α、IL-6和PGE2的影響

梁瀟 劉嬌 胡濤 阮婧華 錢海兵

【摘 要】 目的：研究苗藥制劑弩藥液的鎮(zhèn)痛作用及作用機(jī)制，為弩藥液的臨床應(yīng)用提供藥理學(xué)基礎(chǔ)。方法：采用小鼠熱板實(shí)驗(yàn)，雄性ICR小鼠40只，隨機(jī)分為模型組，弩藥液高、中、低劑量組，每組10只，連續(xù)7d腹部涂抹給藥后測(cè)定末次給藥后小鼠30min、60min、90min痛閾值;采用小鼠扭體實(shí)驗(yàn)，ICR小鼠50只，雌雄各半，隨機(jī)分為模型組，弩藥液高、中、低劑量組，納絡(luò)酮+高劑量組，每組10只，連續(xù)7d腹部涂抹給藥后腹腔注射0.8%冰醋酸生理鹽水溶液，隨即記錄小鼠扭體潛伏期和15min內(nèi)扭體次數(shù);采用大鼠福爾馬林致痛實(shí)驗(yàn)，SD大鼠30只，雌雄各半，隨機(jī)分為空白組，模型組，弩藥液高、中、低劑量組，每組6只，連續(xù)7d腹部涂抹給藥后于大鼠右足底皮下注射5%福爾馬林生理鹽水溶液，隨即記錄大鼠第一時(shí)相和第二時(shí)相舔咬后足持續(xù)時(shí)間，并且檢測(cè)大鼠血清炎性疼痛因子TNF-α、IL-6和PGE2濃度。結(jié)果：熱板實(shí)驗(yàn)中，小鼠給藥后30min和60min高劑量組與模型組以及高劑量組給藥后60min和90min與給藥后30min痛閾值比較，均有顯著性差異（P<0.05）;扭體實(shí)驗(yàn)中，模型組、低劑量組及納絡(luò)酮+高劑量組與高劑量組潛伏期及扭體次數(shù)比較均有顯著性差異（P<0.05）;福爾馬林致痛實(shí)驗(yàn)中，各組大鼠舔咬后足持續(xù)時(shí)間第一時(shí)相無顯著性差異（P>0.05），高、中劑量組與模型組舔咬后足持續(xù)時(shí)間第二時(shí)相比較，有顯著性差異（P<0.05），空白組、高劑量組和中劑量組大鼠血清IL-6、PGE2濃度均與模型組比較，有顯著性差異（P<0.05），空白組血清TNF-α濃度與模型組比較，有顯著性差異（P<0.05），給藥組血清TNF-α濃度較模型組有所降低，但無顯著性差異（P>0.05）。結(jié)論：弩藥液對(duì)多種疼痛模型具有顯著鎮(zhèn)痛作用，可能作用于阿片類受體，作用機(jī)制可能與顯著下調(diào)炎性疼痛因子IL-6、PGE2有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 苗藥制劑;弩藥液;鎮(zhèn)痛作用

【中圖分類號(hào)】R285.5 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號(hào)】1007-8517（2022）13-0017-04

Analgesic Effect of Crossbow Liquid and its Effect on Inflammatory Pain Factors TNF-α， IL-6 and PGE2

LIANG Xiao1 LIU Jiao1 HU Tao1 RUAN Jinghua2 QIAN Haibing1*

1.Guizhou University of Traditional Chinese Medicine， Guiyang 550025，China;2.First Affiliated Hospital of Guizhou University of Traditional Chinese Medicine，Guiyang 550001，China

Abstract：Objective To study the analgesic effect and possible mechanism of Nuyaoye， miao medicine preparation， to provide pharmacological basis for clinical application of Nuyaoye.Methods Forty Female ICR mice were randomly divided into model group， high-dose， medium-dose and low-dose groups with 10 mice in each group. The pain threshold of 30min，60min and 90min after the last administration was measured after 7 days of abdominal smear.A total of 50 ICR mice （Male and female half） were randomly divided into model group， high-dose， medium-dose and low-dose naloxone + high-dose groups， with 10 mice in each group. After 7 days of abdominal administration，0.8% glacial acetic acid normal saline solution was intraperitoneally injected. The latency period of writhing and the number of writhing within 15 minutes were recorded.Using rats foer Ma Linzhi pain experiment， 30 SD rats（Male and female half） were randomly divided into blank group， model group， crossbows， solution of high， middle， low dose group， each group of six， seven d rats after abdominal daub to right plantar subcutaneous injection of 5% formalin saline solution， then record first and 2 in the first phase of rats lick bite after sufficient duration， Serum concentrations of inflammatory pain factors TNF-α， IL-6 and PGE2 were detected.Results In the hot plate experiment， there were significant differences between the pain threshold of the high-dose group and the model group 30min and 60min after administration， and the pain threshold of the high-dose group 60min and 90min after administration and 30min after administration （P<0.05）. In the writhing experiment， there were significant differences in latency and writhing times between the model group， low-dose group， naloxone + high-dose group and high-dose group （P<0.05）. In the formalin-induced pain experiment， there was no significant difference in the first phase of the licking hind foot duration among all groups （P>0.05）， but there was a significant difference in the second phase of the licking hind foot duration between the high-dose and medium-dose groups and the model group （P<0.05）. The serum concentrations of IL-6 and PGE2 in blank group， high-dose group and medium-dose group were significantly different from those in model group （P<0.05）. The serum concentrations of TNF-α in blank group were significantly different from those in model group （P<0.05）. The serum concentrations of TNF-α in administration group were decreased compared with that in model group， but there was no significant difference （P>0.05）.Conclusion The miaoyao preparation Nuyaoye has significant analgesic effects on various pain models， which may act on opioid receptors， and the mechanism of action may be related to the significant down-regulation of inflammatory pain factors IL-6 and PGE2.

Key words：Miaoyao Preparation;Nuyaoye;Analgesic

國際疼痛研究學(xué)會(huì)將疼痛定義為“一種與實(shí)際或潛在組織損傷相關(guān)的感覺、情感、認(rèn)知和社會(huì)維度的痛苦體驗(yàn)”[1]，疼痛反應(yīng)嚴(yán)重影響患者的生活。我國民族藥藥物資源豐富，且有多種鎮(zhèn)痛藥物及制劑應(yīng)用于臨床并取得顯著的效果，從傳統(tǒng)藥物中尋找副作用小且鎮(zhèn)痛效果顯著的藥物已成為當(dāng)前研究熱點(diǎn)。苗藥弩藥液為外用制劑，具有活血化瘀-祛風(fēng)止痛的功效，臨床用于骨關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕等引起的關(guān)節(jié)疼痛，亦可用于癌性疼痛輔助治療，主要由大血藤、飛龍掌血、透骨香、白屈菜和黑骨藤組方而成，實(shí)驗(yàn)研究[2-6]表明，以上藥物對(duì)多種疼痛模型均具有顯著鎮(zhèn)痛作用。

本研究采用熱板實(shí)驗(yàn)、醋酸扭體實(shí)驗(yàn)和福爾馬林致痛實(shí)驗(yàn)，以行為學(xué)和血清疼痛因子水平為指標(biāo)，研究弩藥液的鎮(zhèn)痛作用以及可能的作用受體及機(jī)制，旨在闡明弩藥液對(duì)不同疼痛模型的作用，為其臨床應(yīng)用提供藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 ICR小鼠（雌性75，雄性25），體質(zhì)量（20±2）g;SD大鼠（雌性15，雄性15），體質(zhì)量（200±20）g。所有動(dòng)物購于長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK（湘）2019-0014，適應(yīng)性喂養(yǎng)7d后參照文獻(xiàn)[7-8]進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥物及試劑 弩藥液由貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供，取原液為高劑量、稀釋一倍為中劑量、稀釋兩倍為低劑量;納絡(luò)酮（批號(hào)：MB5693，大連美侖生物技術(shù)有限公司），配制成5mg/kg的納絡(luò)酮生理鹽水溶液;福爾馬林（批號(hào)：20170204，重慶江川化工集團(tuán)有限公司），配制成5%福爾馬林生理鹽水溶液;冰醋酸（批號(hào)：20190221，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），配制成0.8%冰醋酸生理鹽水溶液;大鼠IL-6（Interleukin 6，批號(hào)：KKSX3XLXAQ）、TNF-α（Tumor Necrosis Factor Alpha，批號(hào)：CFDS7MDM1E）、PGE2（Prostaglandin E2，批號(hào)：F21MQ8N8J6）ELISA試劑盒。

1.3 儀器 熱板測(cè)痛儀（由貴州中醫(yī)藥大學(xué)提供）、JJ224BF型電子天平（常熟市雙杰測(cè)試儀器廠，編號(hào)：W162419080116）、80-1醫(yī)用離心機(jī)（江蘇新康醫(yī)療器械有限公司）、Infinite M200酶標(biāo)儀（北京新風(fēng)機(jī)電技術(shù)公司）。

1.4 小鼠熱板舔足實(shí)驗(yàn) 雌性ICR小鼠50只，置于55℃熱板測(cè)痛儀上，以小鼠初次舔咬后足反應(yīng)潛伏期為痛閾指標(biāo)即痛閾值（s），間隔20min測(cè)定兩次，取平均值作為基礎(chǔ)痛閾值，隨機(jī)選擇40只基礎(chǔ)痛閾值在5～30s內(nèi)且無跳躍反應(yīng)小鼠進(jìn)入實(shí)驗(yàn)，隨機(jī)分為模型組、高劑量組、中劑量組和低劑量組，每組10只。小鼠腹部以給藥面積1.5cm2備皮，模型組涂抹生理鹽水，高、中、低劑量組分別均勻涂抹相應(yīng)藥物，2次/d，連續(xù)7d，末次給藥后30min、60min、90min各組小鼠分別測(cè)定痛閾值（s），計(jì)算痛閾提高百分率=（給藥后痛閾值-基礎(chǔ)痛閾值）×100%/基礎(chǔ)痛閾值。

1.5 小鼠納絡(luò)酮拮抗-醋酸扭體實(shí)驗(yàn) ICR小鼠50只，雌雄各半，隨機(jī)分為模型組、高劑量組、中劑量組、低劑量組、納絡(luò)酮+高劑量組，每組10只。除模型組外，其余各組按1.3項(xiàng)下方法給藥，末次給藥后45min，除納絡(luò)酮+高劑量組腹腔注射納絡(luò)酮溶液（5mg/kg，0.1mL/10g）外，其余各組均腹腔注射生理鹽水（0.2mL/只），15min后，模型組和納絡(luò)酮組涂抹生理鹽水，其余各組分別涂抹相應(yīng)藥物，40min后各組均腹腔注射0.8%冰醋酸生理鹽水溶液（0.1mL/10g），立即觀察并記錄各組小鼠初次出現(xiàn)扭體反應(yīng)時(shí)間即扭體潛伏期（s）和15min內(nèi)出現(xiàn)扭體反應(yīng)的次數(shù)，15min內(nèi)未出現(xiàn)扭體的，潛伏期記為900s，計(jì)算鎮(zhèn)痛百分率=（模型組扭體次數(shù)-給藥組扭體次數(shù)）×100%/模型組扭體次數(shù)。

1.6 大鼠福爾馬林致痛實(shí)驗(yàn) SD大鼠30只，雌雄各半，隨機(jī)分為空白組、模型組、高劑量組、中劑量組和低劑量組，每組6只，按1.3項(xiàng)下方法給藥（空白組參照模型組給藥方式），末次給藥30min后，除空白組外，其余各組大鼠右側(cè)后足皮下注射5%福爾馬林100μL，以皮丘形成為注射成功，立即觀察并記錄各組大鼠第一時(shí)相（0～5min）和第二時(shí)相（15～60min）舔咬后足持續(xù)時(shí)間（s），作為疼痛評(píng)價(jià)指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)完成后，各組大鼠采用腹主動(dòng)脈取血，于離心機(jī)分離血清，按照ELISA試劑盒說明書分別測(cè)定IL-6、TNF-α和PGE2濃度。

1.7統(tǒng)計(jì)分析 數(shù)據(jù)采用平均值加減標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，SPSS 26.0進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 小鼠熱板舔足實(shí)驗(yàn) 各組小鼠基礎(chǔ)痛閾值相比較無顯著性差異（P>0.05），給藥后30min和60min高劑量組與模型組痛閾值相比有顯著性差異（P<0.05）;高劑量組給藥后60min和90min的痛閾值與給藥后30min相比均有顯著性差異（P<0.05），各組給藥后60min和90min的痛閾值相比無顯著性差異（P>0.05）。見表1。

2.1.2 小鼠納絡(luò)酮拮抗-醋酸扭體實(shí)驗(yàn) 模型組、低劑量組及納絡(luò)酮+高劑量組與高劑量組潛伏期及扭體次數(shù)相比均有顯著性差異（P<0.05）。見表2。

2.1.3 大鼠福爾馬林致痛實(shí)驗(yàn) 各組大鼠舔咬后足持續(xù)時(shí)間第一時(shí)相相比無顯著性差異（P>0.05），高、中劑量組與模型組舔咬后足持續(xù)時(shí)間第二時(shí)相相比有顯著性差異（P<0.05）。見表3。

2.2 血清指標(biāo) 空白組、高劑量組和中劑量組大鼠血清IL-6濃度均與模型組相比有顯著性差異（P<0.05）;空白組血清TNF-α濃度與模型組相比有顯著性差異（P<0.05）;空白組、高劑量組和中劑量組血清PGE2濃度與模型組相比有顯著性差異（P<0.05）。見表4。

3 討論

疼痛是炎癥和癌癥等病理狀態(tài)下機(jī)體的主要反應(yīng)[9]。本實(shí)驗(yàn)采用物理刺激和化學(xué)刺激兩種致痛模型，以行為學(xué)和血清致痛因子濃度為指標(biāo)研究弩藥液的鎮(zhèn)痛作用。

熱板法是篩選鎮(zhèn)痛藥物的一個(gè)經(jīng)典的熱刺激致痛法[10]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示弩藥液能夠顯著降低小鼠熱板致痛模型末次給藥后30min和60min的痛閾值，高劑量組在末次給藥后30min的痛閾值與末次給藥后60min和90min均有顯著性差異，說明弩藥液對(duì)小鼠熱板致痛模型具有顯著鎮(zhèn)痛作用，且在末次給藥后30min的鎮(zhèn)痛作用最為顯著。

醋酸扭體法是篩選鎮(zhèn)痛藥物的一個(gè)常用化學(xué)刺激致痛法[10]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示弩藥液能夠顯著減少小鼠醋酸扭體致痛模型扭體潛伏期和15min內(nèi)的扭體次數(shù)，說明弩藥液對(duì)小鼠醋酸扭體致痛模型具有顯著鎮(zhèn)痛作用，實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步加入納絡(luò)酮拮抗組，結(jié)果顯示納絡(luò)酮能顯著拮抗弩藥液的鎮(zhèn)痛作用，納絡(luò)酮是阿片類受體拮抗劑，說明弩藥液的鎮(zhèn)痛作用可能作用于阿片類受體。

福爾馬林致痛法是經(jīng)典的炎癥致痛模型，第二時(shí)相為體內(nèi)炎癥因子大量產(chǎn)生而導(dǎo)致疼痛的時(shí)期[10]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示弩藥液能夠顯著減輕大鼠福爾馬林致痛模型第二時(shí)相舔咬后足反應(yīng)的持續(xù)時(shí)間，說明弩藥液對(duì)大鼠福爾馬林致痛模型具有顯著鎮(zhèn)痛作用，且可能與下調(diào)炎癥因子表達(dá)有關(guān)。

炎性疼痛是疼痛的主要類型[11]，IL-6、TNF-α和PGE2是與疼痛相關(guān)的炎癥細(xì)胞因子，福爾馬林致炎后大鼠體內(nèi)炎癥細(xì)胞因子濃度升高，促進(jìn)疼痛產(chǎn)生[12]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠血清IL-6、TNF-α和PGE2濃度均顯著升高，說明造模成功，弩藥液高劑量組和中劑量組血清中IL-6和PGE2濃度與模型組相比均顯著性降低，TNF-α濃度與模型組相比呈降低趨勢(shì)但差異不顯著，即弩藥液可顯著降低血清中IL-6和PGE2濃度，降低TNF-α濃度，說明弩藥液的對(duì)大鼠福爾馬林致痛模型的鎮(zhèn)痛作用可能與顯著下調(diào)IL-6、PGE2濃度有關(guān)，而與TNF-α濃度相關(guān)性不大。

綜上所述，弩藥液可能是阿片類鎮(zhèn)痛藥，對(duì)多種疼痛模型具有顯著鎮(zhèn)痛作用，且對(duì)炎性疼痛模型的作用可能與下調(diào)炎性因子表達(dá)有關(guān)，但具體機(jī)制仍需實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

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（收稿日期：2021-11-02 編輯：陶希睿）