柳菁菁 施松善 張彬鋒 Maeng Yoo Jae1

【摘 要】 目的： 測(cè)定市場(chǎng)上實(shí)際流通的商品胡桐淚藥材中多糖的含量并對(duì)其單糖組成進(jìn)行分析，以多糖為指標(biāo)評(píng)價(jià)藥材質(zhì)量。方法：采用苯酚-硫酸法對(duì)總多糖進(jìn)行含量測(cè)定;應(yīng)用核磁共振氫譜（1H-NMR）分析單糖組成;運(yùn)用高效凝膠滲透色譜（HPGPC）測(cè)定總多糖的分子量分布。結(jié)果：以葡萄糖計(jì)，4批新式胡桐淚總多糖含量平均值為（7.36±1.74）%，6批老式胡桐淚總多糖含量平均值為（1.53±0.99）%;新式與老式胡桐淚總多糖的單糖組成相似，主要由阿拉伯糖和半乳糖組成，還含有木糖、甘露糖、鼠李糖等，部分樣品尚含有較高含量的葡萄糖;新舊類型樣品總多糖在分子量分布上存在較大差異。結(jié)論：新式胡桐淚的總多糖含量平均值較老式高，以多糖含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)時(shí)，新式樣品總體質(zhì)量較老式更好;應(yīng)用核磁共振氫譜可以快速、準(zhǔn)確地鑒定單糖組成。

【關(guān)鍵詞】 胡桐淚;苯酚-硫酸法;多糖含量測(cè)定;核磁共振氫譜;糖組成分析;高效凝膠滲透色譜;中藥研究

【中圖分類號(hào)】R284.1?? 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A??? 【文章編號(hào)】1007-8517（2022）12-0031-07

Polysaccharide Contents Determination and Monosaccharide

Composition Analysis of Uygur Medicine Populus Euphratica Resins

LIU Jingjing1 SHI Songshan2 ZHANG Binfeng1* MAENG Yoojae1

1. Shanghai R&D Center， LG Household & Health Care， Ltd.， Shanghai 200233， China;

2. Shanghai University of Traditional Chinese Medicine， Shanghai 201203， China

Abstract：Objective To evaluate the qualities of Populus euphratica resins from commercial sources by determining their polysaccharide contents and analyzing their monosaccharide composition. Methods The polysaccharide contents were determined by phenol-sulfuric acid method; the monosaccharide compositions were analyzed by 1H-NMR technology; and the molecular weight distributions were determined by HPGPC. Results The average value of polysaccharide contents of the 4 new-type Populus euphratica resins was （7.36±1.74）%， while that of the 6 old-type ones was （1.53±0.99）%. Both the new-type and the old-type samples monosaccharide compositions were similar， which were mainly composed of arabinose and galactose， and a little xylose， mannose， and rhamnose. And some samples contained a little glucose also. HPGPC results showed that both type samples polysaccharides had very different molecular weight distributions. Conclusion The new-type Populus euphratica resins have the better qualities than the old-type ones based on their higher total polysaccharide contents. The proton NMR method can determine the monosaccharides accurately and quickly.

Populus euphratica Resins; Phenol-sulfuric Acid Method; Polysaccharide Content Determination;1H-NMR; Monosaccharide Composition Analysis; HPGPC; Traditional Chinese Medicine Research

胡桐淚，又名胡桐律，梧桐淚，梧桐律[1]，為楊柳科植物胡楊Populus euphratica的樹(shù)脂，主要分布于我國(guó)新疆、內(nèi)蒙古、甘肅、青海等地。胡桐淚是一種少用中藥和維吾爾族用藥，味苦、咸，性寒，主治牙痛、咽喉腫痛[2]。《本草綱目》中記載其 “今治口齒家多用，為最要之物”[3] ;《海藥本草》記載其“主風(fēng)疳齒，牙疼痛，骨槽風(fēng)勞”[4] 。胡桐淚主要有兩種常見(jiàn)性狀，一種外觀呈不規(guī)則的顆粒狀小塊或小薄片狀，多相互黏結(jié)成疏松的團(tuán)塊，表面棕黃色至棕色，具角質(zhì)樣光澤，質(zhì)脆易碎，習(xí)稱新式胡桐淚;另有一種樹(shù)脂入土?xí)r間較長(zhǎng)，呈大小不等的塊狀或粉末狀，土黃色，質(zhì)重而實(shí)，習(xí)稱老式胡桐淚[5] 。兩種胡桐淚均為胡楊樹(shù)脂流入土中留存多年而形成，區(qū)別在于樹(shù)脂入土?xí)r間長(zhǎng)短不同，但目前對(duì)兩種胡桐淚藥材現(xiàn)代研究及臨床區(qū)別的認(rèn)識(shí)卻十分有限。文獻(xiàn)檢索結(jié)果[6-7]顯示，胡桐淚的成分研究主要集中在萜類等化合物方面，而對(duì)其中的大分子多糖類的研究尚未見(jiàn)報(bào)道，故對(duì)市場(chǎng)上實(shí)際流通的商品胡桐淚藥材中的多糖進(jìn)行研究，以期為胡桐淚藥材系統(tǒng)質(zhì)量評(píng)價(jià)和在化妝品中的應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 ME104電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）;DHG-9030A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）;JP-300C高速多功能粉碎機(jī)（永康市久品工貿(mào)有限公司）;HWS-26電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）;N-1300D-WB旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（日本東京理化器械株式會(huì)社）;Milli-Q超純水儀;Spark多功能酶標(biāo)儀（瑞士TECAN公司）;Bruker Avance Ⅲ HD 600 MHz核磁共振波譜儀;Agilent 1100型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent）帶示差檢測(cè)器（RID）;色譜柱為Shodex KS-805、KS-804串聯(lián)柱。

1.2 試藥 葡萄糖（D-Glc）、半乳糖（D-Gal）、阿拉伯糖（L-Ara）、甘露糖（D-Man）、木糖（D-Xyl）、鼠李糖（L-Rha）等單糖標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司;不同分子量的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自Shodex SHOWA DENKO公司。苯酚、濃硫酸、乙醇均為分析純?cè)噭?，?gòu)自國(guó)藥集團(tuán)上海試劑有限公司;重水購(gòu)自Damas-Beta公司;馬來(lái)酸購(gòu)自北京百靈威科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)藥材 實(shí)驗(yàn)樣品共10批，購(gòu)自中藥材市場(chǎng)，經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)吳立宏教授鑒定，按外觀分為新式胡桐淚HT1-HT4和老式胡桐淚HT5-HT10。實(shí)驗(yàn)標(biāo)本存放于樂(lè)金生活健康化妝品研發(fā)（上海）有限公司本草研究Team實(shí)驗(yàn)室。樣品信息見(jiàn)表1 。

2 方法

2.1 胡桐淚多糖含量測(cè)定

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 取葡萄糖對(duì)照品約10 mg，精密稱定，加去離子水溶解并定容至100 mL，搖勻，即得。標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖濃度為101.2 μg/mL。

2.1.2 供試品溶液的制備 取胡桐淚粉末（過(guò)四號(hào)篩）約0.5 g，精密稱定，置100 mL圓底燒瓶中，加入80%乙醇50 mL回流1 h取出，放冷，濾過(guò)，棄去濾液，殘?jiān)?0%乙醇50 mL洗滌5次后晾干。殘?jiān)?00 mL圓底燒瓶中，精密加水50 mL，稱定重量，回流提取1 h，取出，放冷，用水補(bǔ)足損失的重量，混勻，濾過(guò)。精密量取濾液40 mL，加水定容至50 mL，混勻，即得。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密量取對(duì)照品溶液0.0、0.1、0.2、0.3、0.5、0.8、1.0 mL于具塞試管中，分別加水補(bǔ)足至2.0 mL，精密加入6%苯酚溶液1.0 mL，渦旋后勻速加入98%濃硫酸5.0 mL，混勻，靜置至室溫。在490 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，以葡萄糖的質(zhì)量數(shù)y為縱坐標(biāo)，吸光度x為橫坐標(biāo)繪制回歸曲線（如圖1所示），得回歸方程為y=216.93x-17.546（相關(guān)系數(shù)R2=0.9994，線性范圍為0～202.4 μg）。計(jì)算結(jié)果表明，在實(shí)驗(yàn)條件下所得回歸方程線性關(guān)系良好。

2.1.4 樣品含量測(cè)定 取2.1.2項(xiàng)下的供試品溶液0.2 mL，加水稀釋至2 mL，照2.1.3項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度，依標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出供試品溶液中含葡萄糖的量（多糖含量以無(wú)水葡萄糖計(jì)）。

2.1.5 樣品水分含量測(cè)定 取胡桐淚藥材粉末約2 g，精密稱定，照中國(guó)藥典2020版四部[8]通則0832水分測(cè)定法第二法（烘干法）測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.1.6 方法學(xué)考察 ①精密度試驗(yàn)：取胡桐淚樣品約0.5 g，精密稱定，按2.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1.3項(xiàng)下方法連續(xù)測(cè)定6次，記錄吸光度值，計(jì)算吸光度值的RSD為0.84%，表明儀器精密度良好; ②重復(fù)性試驗(yàn)：取HT4樣品6份，每份約0.5 g，精密稱定，按2.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1.3項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度值，并計(jì)算多糖含量，6份平均含量為5.97%，RSD為2.66%，表明重復(fù)性良好;③穩(wěn)定性試驗(yàn)： 對(duì)同一供試品溶液，分別于30、40、50、60、90 min測(cè)定吸光度，計(jì)算吸光度值的RSD為1.16%，表明供試品溶液在90 min內(nèi)穩(wěn)定; ④加樣回收率試驗(yàn)：取HT4樣品6份，每份約0.25 g，精密稱定，分別加入無(wú)水葡萄糖對(duì)照品約14.8 mg，按2.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1.3項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度，計(jì)算含量和回收率，結(jié)果如表3。

2.2 糖組成分析方法

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)單糖圖譜測(cè)定步驟 ①分別取單糖標(biāo)準(zhǔn)品（葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖、木糖、鼠李糖、巖藻糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸）1～2 mg，各加入72%的硫酸20 μL，重水200 μL，濃硫酸10 μL和內(nèi)標(biāo)溶液10 μL，混勻，轉(zhuǎn)移入3 mm核磁管中; ②于600 MHz核磁共振儀上，設(shè)定采樣溫度20 ℃，測(cè)定氫譜，放大水峰區(qū)域，準(zhǔn)確測(cè)量水峰中心頻率，精確到0.1 Hz; ③另測(cè)一個(gè)氫譜，脈沖程序改為zgcppr，D1設(shè)為10 s，掃描次數(shù)16次， O1值設(shè)為前述水峰精確頻率值，采集實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù); ④圖譜以馬來(lái)酸峰（6.4734 ppm）為參照校準(zhǔn)化學(xué)位移; ⑤分別記錄分析每種單糖所有構(gòu)型的H1α和H1β，記錄化學(xué)位移值δ、計(jì)算耦合常數(shù)J以及各單糖α-和β-構(gòu)型端基氫的積分面積，計(jì)算不同構(gòu)型的比例。所收集的10個(gè)樣品均未檢出巖藻糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸，其余6個(gè)標(biāo)準(zhǔn)單糖異頭碳上端基氫信號(hào)區(qū)域（約4.50～5.40 ppm）重疊模式圖譜和種類歸屬如圖2所示，數(shù)據(jù)歸屬詳見(jiàn)表4。

2.2.2 樣品溶液制備與氫譜測(cè)定步驟 ①稱取多糖樣品2～3 mg，加72%硫酸20 μL，混勻，室溫靜置過(guò)夜;② 加重水200 μL，混勻;③ 轉(zhuǎn)入5 mL安瓿瓶中，封口，100 ℃水解4～5 h; ④取出，放冷至室溫，加濃硫酸10 μL，內(nèi)標(biāo)溶液10 μL，混勻;⑤? 離心，取上清液200 μL轉(zhuǎn)入3 mm核磁管中;后續(xù)測(cè)定同2.2.1項(xiàng)下②～⑤步驟。將樣品數(shù)據(jù)與標(biāo)準(zhǔn)糖數(shù)據(jù)比對(duì)，確定單糖種類并計(jì)算各單糖之間的相對(duì)比例以其各自H1總峰面積之比計(jì)算即為摩爾比。

2.3 HPGPC分析方法 采用不同標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖分子量的對(duì)數(shù)值與保留時(shí)間制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)總多糖樣品中各峰的保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照，采用GPC軟件自動(dòng)計(jì)算其分子量。分別選取新式樣品和老式樣品多糖含量較高的代表性樣品HT1和HT6制備總多糖溶液，分別進(jìn)樣20 μL至Aglient 1100型高效液相色譜儀，色譜柱Shodex KS-805、KS-804串聯(lián)柱，流動(dòng)相為0.22 μm濾膜過(guò)濾過(guò)的0.2 mol/L NaCl水溶液，流速為0.8 mL/min，柱溫為40 ℃，檢測(cè)器為示差檢測(cè)器，記錄圖譜，計(jì)算各峰分子量。

3 結(jié)果

3.1 胡桐淚樣品總多糖的含量測(cè)定結(jié)果 取2.1.2項(xiàng)下供試品溶液，按2.1.4項(xiàng)下方法計(jì)算胡桐淚樣品中的總多糖含量（以葡萄糖計(jì)）。結(jié)果見(jiàn)表3。 新式胡桐淚樣品HT1多糖含量較高，為9.49%;老式胡桐淚樣品中HT6多糖含量較高，為2.39%。表5實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，新式胡桐淚中的多糖含量均值明顯高于老式胡桐淚。

3.2 單糖組成分析結(jié)果 按2.2項(xiàng)下方法步驟，分別測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)單糖和各樣品的氫譜（如圖3所示）。HT7和H10兩個(gè)樣品不含多糖，未做分析。通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)糖譜圖比對(duì)測(cè)定值（見(jiàn)表4），鑒定出8個(gè)樣品HT1、HT2、HT3、HT4、HT5、HT6、HT8和HT9中均含有較高含量的半乳糖和阿拉伯糖，及少量的木糖、鼠李糖和甘露糖;其中，HT5、HT8、HT9樣品中檢測(cè)出了較高含量的葡萄糖。利用峰面積歸一化法測(cè)定了各單糖組分的相對(duì)摩爾比。見(jiàn)表6。

3.3 HPGPC分析結(jié)果 按2.3項(xiàng)下的方法對(duì)新式和老式胡桐淚的代表性樣品HT1和HT6總多糖的分子量與分子量分布進(jìn)行了測(cè)定。色譜圖如圖4所示，分子量計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表7。

4 討論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，新式胡桐淚中多糖含量明顯高于老式胡桐淚，且多糖分子量及分子量分布差異較大。推測(cè)可能與老式藥材入土?xí)r間較長(zhǎng)有關(guān)，隨著時(shí)間的推移受土壤中微生物的作用而降解，從而多糖含量較低?；趦煞N類型胡桐淚的這些差異，以及其明顯的外觀區(qū)別，建議分開(kāi)使用。胡桐淚總多糖的糖組成分析結(jié)果表明，不同產(chǎn)地不同性狀胡桐淚樣品的糖組成相似，主要由阿拉伯糖和半乳糖組成，且含量比例接近1∶1，推測(cè)胡桐淚中的多糖可能主要為AG型果膠多糖（阿拉伯半乳聚糖）。10份市場(chǎng)流通中的胡桐淚樣品中，HT5、HT8、HT9樣品糖組成較其他樣品稍有差異，均檢測(cè)出葡萄糖成分，推測(cè)是產(chǎn)地原因造成的差異。

文獻(xiàn)報(bào)道糖組成的測(cè)定方法主要有薄層色譜法、紙色譜法、液相色譜法、氣相色譜法、核磁共振氫譜法[9-10]等。與其他幾種色譜法相比，實(shí)驗(yàn)采用的核磁共振氫譜法在數(shù)分鐘內(nèi)即可完成采樣分析，與相同條件下的單糖標(biāo)準(zhǔn)品譜圖對(duì)照即可明確鑒定所含單糖種類，對(duì)各單糖特征峰積分即可獲得不同單糖的組成比例，而在水解液中加入一定量的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，即可對(duì)每一種單糖進(jìn)行絕對(duì)定量。

參考文獻(xiàn)

[1]肖雄，石雨.胡桐淚（律）與梧桐淚（律）之考辨[J].中醫(yī)文獻(xiàn)雜志，2019，37（4）：1-5.

[2]劉勇民.胡桐淚的生藥學(xué)研究[J].中藥通報(bào)，1988，13（8）：8-9，61.

[3]李時(shí)珍.本草綱目[M].北京：中國(guó)中醫(yī)藥出版社，1998：840.

[4]石翠，馬瑞麗，馬桂芝，等.胡桐淚與胡桐水中6種金屬元素含量及小鼠急性毒性的比較研究[J].中南藥學(xué)，2020，18（5）：801-805.

[5]國(guó)家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會(huì).中華本草-維吾爾藥卷[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1999：261.

[6]LIU K， QIN D， ZHU Y， et al. Populeuphrines A and B， two new cembrane diterpenoids from the resins of Populus euphratica [J]. Natural Product Research， 2019， 34（21）： 1-9.

[7]LIU K， ZHU Y， YAN Y， et al. Discovery of populusone， a skeletal stimulator of umbilical cord mesenchymal stem cells from Populus euphratica exudates [J]. Org. Lett， 2019， 21（6）： 1837-1840.

[8]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（2020年版）：四部[M].北京：中國(guó)科技醫(yī)藥出版社，2020：114-115.

[9]MERKX D W H， WESTPHAL Y， VELZEN E J JV，et al.Quantification of food polysaccharide mixtures by 1H NMR [J]. Carbohydrate Polymers，2018（179）：379-385.

[10]BOSE S K， BARBER V A， ALVES E F，et al. An improved method for the hydrolysis of hardwood carbohydrates to monomers [J]. Carbohydrate Polymers， 2009（78）：396-401.

（收稿日期：2021-09-06 編輯：陶希睿）