張小琴　王友翠　謝俊霞

[摘要]目的 探討1-甲基-4-苯基吡啶離子（MPP⁺）對(duì)N2a細(xì)胞中環(huán)狀RNA小腦變性相關(guān)蛋白1反義轉(zhuǎn)錄物（CDR1as）基因表達(dá)的影響。方法 常規(guī)培養(yǎng)N2a神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞，給予100 μmol/L的MPP⁺分別處理3、6、9和12 h。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè) CDR1as基因的表達(dá)。結(jié)果 與用基礎(chǔ)培養(yǎng)液處理的對(duì)照組相比，經(jīng)MPP⁺處理3、6、9和12 h的N2a細(xì)胞CDR1as基因表達(dá)明顯降低（F=10.010，q=7.003～8.609，P<0.05）。結(jié)論 MPP⁺能誘導(dǎo)N2a細(xì)胞中 CDR1as基因的表達(dá)顯著降低，提示 CDR1as基因可能參與帕金森病的發(fā)病。

[關(guān)鍵詞]RNA，環(huán)狀;CDR1as;1-甲基-4-苯基吡啶;N2a細(xì)胞;帕金森病

[中圖分類號(hào)]R338.2[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A[文章編號(hào)]2096-5532（2022）03-0333-04

doi：10.11712/jms.2096-5532.2022.58.121

EFFECT OF 1-METHYL-4-PHENYLPYRIDINIUM ON EXPRESSION OF THE CEREBELLAR DEGENERATION-RELATED PROTEIN 1 ANTISENSE TRANSCRIPT GENE IN N2A CELLS

ZHANG Xiaoqin， WANG Youcui， XIE Junxia

（Department of Physiology and Pathophysiology， School of Basic Medicine， Qingdao University， Qingdao 266071， China）

[ABSTRACT] Objective To investigate the effect of 1-methyl-4-phenylpyridinium （MPP⁺） on the expression of the cerebellar degeneration-related protein 1 antisense transcript （CDR1as） gene in N2a cells.Methods Neuroblastoma N2a cells were cultured with conventional methods and then treated with 100 μmol/L MPP⁺for 3， 6， 9， and 12 h. Quantitative real-time PCR was used to measure the mRNA expression of CDR1as.Results Compared with the control group treated with the basal medium， the N2a cells treated with MPP⁺for 3， 6， 9， and 12 h had a significant reduction in the mRNA expression of CDR1as （F=10.010，q=7.003-8.609，P<0.05）.Conclusion MPP⁺induces a significant reduction in the expression of the CDR1as gene in N2a cells， suggesting that the CDR1as gene may be involved in the pathogenesis of Parkinsons disease.

[KEY WORDS] RNA， circular; CDR1as; 1-methyl-4-phenylpyridinium; N2a cells; Parkinson disease

帕金森病（PD）是僅次于阿爾茨海默病的第二大神經(jīng)退行性疾病[1-9]。PD主要的病理特征是中腦黑質(zhì)多巴胺（DA）能神經(jīng)元大量變性丟失，導(dǎo)致紋狀體內(nèi)DA含量減少，而變性丟失的 DA能神經(jīng)元內(nèi)均出現(xiàn)α-突觸核蛋白積聚[10-13]。環(huán)狀RNA是一類不具有5′末端帽子和3′末端 poly（A）尾巴、以共價(jià)鍵形成環(huán)形結(jié)構(gòu)的RNA分子。由于呈閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，對(duì)核酸外切酶不敏感，因此環(huán)狀RNA比線性RNA更為穩(wěn)定，且具有物種保守性、組織時(shí)序性及疾病表達(dá)特異性[14-20]。有文獻(xiàn)報(bào)道，環(huán)狀RNA小腦變性相關(guān)蛋白1反義轉(zhuǎn)錄物（CDR1as）可作為miR-7海綿調(diào)控miR-7靶基因的表達(dá)[21-22]。已有研究表明，α-突觸核蛋白基因的拷貝增加或點(diǎn)突變均可導(dǎo)致α-突觸核蛋白積聚，從而引發(fā)PD[23-24]。而miR-7可以與α-突觸核蛋白基因編碼 mRNA的3′UTR 區(qū)相互作用，從而抑制其翻譯[25-26]。這提示作為miR-7海綿的CDR1as基因可能參與了DA能神經(jīng)元的變性丟失。因此，闡明CDR1as基因在PD中發(fā)揮的作用至關(guān)重要。本研究旨在探討經(jīng)1-甲基-4-苯基吡啶離子（MPP⁺）處理的PD細(xì)胞模型中CDR1as基因的表達(dá)變化。

1材料與方法

1.1主要試劑及其來源

MPP⁺（M0896）由美國(guó)Sigma公司提供，用雙蒸水稀釋至10 mmol/L，分裝，-20 ℃避光保存;DMEM高糖基礎(chǔ)培養(yǎng)液（01-052-1ACS）購自BI公司;TRIzol購自ambion公司;PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（AG11711）和SYBR Green（AG11702）購自艾科瑞生物公司;胎牛血清（澳洲源，F(xiàn)ND500）購自依科賽公司;青霉素和鏈霉素混合雙抗液（F1400）購自索萊寶公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)

小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤N2a細(xì)胞培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)0.05胎牛血清、100 kU/L青霉素和100 mg/L鏈霉素混合雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)液中，在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)0.05 CO₂條件下培養(yǎng)。

1.3四甲基偶氮唑鹽（MTT）法檢測(cè)細(xì)胞活力

將N2a細(xì)胞接種于96孔板中，每孔細(xì)胞懸液200 μL（細(xì)胞數(shù)為8×104個(gè)），培養(yǎng)24 h后，棄上清，對(duì)照組直接加入新鮮基礎(chǔ)培養(yǎng)液，MPP⁺組加入終濃度為100 μmol/L的MPP⁺，分別處理3、6、9和12 h。細(xì)胞處理結(jié)束后，每孔加入5 g/L的MTT 20 μL，培養(yǎng)4 h后取出培養(yǎng)板，棄上清，每孔加入100 μL的二甲基亞砜（DMSO），振蕩10 min。用酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)570 nm處的吸光度（A）值，計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR）檢測(cè)CDR1as基因表達(dá)

將傳代N2a細(xì)胞接種于12孔板，分為對(duì)照組（A組）和100 μmol/L MPP⁺處理3、6、9、12 h組（B、C、D、E組）。采用TRIzol法冰上裂解各組細(xì)胞5 min。按照PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑說明書操作，提取細(xì)胞總RNA。取1 μg的總RNA，加入1 μL gDNA Clean Reagent、2 μL 5×gDNA Clean Buffer，用RNA free water補(bǔ)至10 μL，42 ℃變性2 min;隨后向上述反應(yīng)體系中加入Evo M-MLV RTase Enzyme Mix 1 μL、RT Primer Mix 1 μL、5×RTase Reaction Buffer Mix Ⅰ 4 μL、RNA free water 4 μL，37 ℃作用15 min，繼以85 ℃、5 s逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。采用SYBR Green染料法相對(duì)定量測(cè)定CDR1as基因的表達(dá)。RT-PCR 檢測(cè)所用引物及其序列見表1。應(yīng)用2-ΔΔCt方法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用Graph Pad Prism 6軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。實(shí)驗(yàn)所得計(jì)量資料結(jié)果以x±s形式表示，兩組均數(shù)比較采用t檢驗(yàn);多組均數(shù)比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA檢驗(yàn)），繼以Tukey法進(jìn)行進(jìn)一步組間兩兩比較。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1MPP⁺作用不同時(shí)間對(duì)N2a細(xì)胞存活率影響

與對(duì)照組相比較，經(jīng)100 μmol/L MPP⁺作用3、6、9和12 h的N2a細(xì)胞存活率均有明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.283～11.430，P<0.05）。見表2。

2.2MPP⁺作用不同時(shí)間后N2a細(xì)胞中CDR1as基因的表達(dá)變化

RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，A、B、C、D、E組N2a細(xì)胞中CDR1as基因的表達(dá)水平分別為1.070±0.338、0.207±0.034、0.290±0.039、0.354±0.121和0.368±0.137（n=6）。與對(duì)照組比，經(jīng)100 μmol/L MPP⁺作用3、6、9和12 h的N2a細(xì)胞CDR1as基因表達(dá)水平明顯降低，差異均具有顯著意義（F=10.010，q=7.003～8.609，P<0.05）。

3討論

PD是世界上第二大常見的神經(jīng)退行性疾病，隨著人口老齡化加劇，發(fā)病人數(shù)逐年增加[1-9]。PD主要病理學(xué)特征是黑質(zhì)區(qū)DA能神經(jīng)元進(jìn)行性丟失，紋狀體DA含量降低。臨床上主要表現(xiàn)為肌僵直、靜止性震顫、姿勢(shì)不穩(wěn)、運(yùn)動(dòng)遲緩，影響了病人的生活質(zhì)量[27]。左旋多巴是治療PD的常用藥物，但大多數(shù)病人長(zhǎng)期服用左旋多巴后出現(xiàn)不自主運(yùn)動(dòng)、認(rèn)知障礙、癡呆等副作用[28]。因此，尋找新的治療靶點(diǎn)具有重要的意義。近期研究發(fā)現(xiàn)，CDR1as參與PD的發(fā)病進(jìn)程，但其確切的機(jī)制尚未闡明。

研究表明，CDR1as基因在人和小鼠腦組織中可有效地環(huán)化，而檢測(cè)不到線性CDR1as[29]。人源CDR1as基因序列含有74個(gè)miR-7結(jié)合位點(diǎn)，小鼠CDR1as基因序列含有130個(gè)miR-7結(jié)合位點(diǎn)，且在不同物種間高度保守[21-22，29]。CDR1as與miR-7共同高表達(dá)于腦組織神經(jīng)元的胞體和突起，在小腦、中腦、海馬、嗅球神經(jīng)元中均能檢測(cè)到CDR1as基因的表達(dá)[29-30]。研究發(fā)現(xiàn)，CDR1as基因在興奮性

神經(jīng)元中表達(dá)水平較高，CDR1as基因敲除小鼠表現(xiàn)出興奮性突觸誘發(fā)電位功能障礙[29]。在斑馬魚胚胎中過表達(dá)人源CDR1as會(huì)導(dǎo)致中腦體積縮小，其表型與miR-7缺失相似，且通過補(bǔ)充miR-7前體可部分恢復(fù)中腦體積，提示CDR1as可能是通過與miR-7相互作用，即作為miR-7海綿吸附miR-7而發(fā)揮作用[19]。有文獻(xiàn)報(bào)道，在PD病人和1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶誘導(dǎo)的PD小鼠的中腦黑質(zhì)區(qū)，miR-7的表達(dá)均顯著降低，在小鼠中腦黑質(zhì)區(qū)敲低miR-7，則會(huì)導(dǎo)致α-突觸核蛋白積聚并伴有DA能神經(jīng)元的變性丟失，同時(shí)紋狀體內(nèi)DA含量顯著下降，提示miR-7可能在α-突觸核蛋白的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[31-32]。此外，miR-7在調(diào)節(jié)PD發(fā)病進(jìn)程中的神經(jīng)炎癥和DA能神經(jīng)元死亡中具有重要作用[33-36]。因此，CDR1as可能通過調(diào)節(jié)miR-7-α-突觸核蛋白軸調(diào)控PD的發(fā)展。本研究應(yīng)用濃度為100 μmol/L的MPP⁺處理N2a細(xì)胞構(gòu)建PD細(xì)胞模型，并檢測(cè)了CDR1as在不同時(shí)間點(diǎn)的變化，結(jié)果顯示，N2a細(xì)胞經(jīng)過MPP⁺處理3、6、9和12 h后CDR1as表達(dá)顯著降低，提示CDR1as基因可能間接參與了PD的發(fā)病。

有研究顯示，在CDR1as基因敲除小鼠大腦中，miR-7的表達(dá)減少而不是增加，這表明還有其他機(jī)制參與了miR-7表達(dá)的調(diào)節(jié)[29]。采用CLIP-Seq技術(shù)對(duì)miR-7-target RNA-Ago2嵌合體中的靶序列進(jìn)行分析和排序發(fā)現(xiàn)，無論是在人類還是小鼠大腦中，排在第1位的都是CDR1as基因，排在第2位的是長(zhǎng)鏈非編碼RNA Cyrano，提示Cyrano在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中對(duì)miR-7具有重要的調(diào)控作用[29]。Cyrano高表達(dá)于腦神經(jīng)元的胞體和突起，含有1個(gè)與miR-7幾乎完全配對(duì)（除第9/10位外）的結(jié)合位點(diǎn)，且該位點(diǎn)高度保守[37]。然而，Cyrano是否通過miR-7在PD發(fā)病中發(fā)揮作用還需進(jìn)一步探究。

研究表明，在人類和小鼠腦中，CDR1as基因也存在miR-671的結(jié)合位點(diǎn)，miR-671可以近乎完全與CDR1as基因互補(bǔ)配對(duì)，隨后與Ago2蛋白結(jié)合，最終實(shí)現(xiàn)對(duì)CDR1as基因的有效降解，且此相互作用在物種間高度保守，提示這種特異性的相互作用可能具有重要生物學(xué)功能[29，38]。本研究中，N2a細(xì)胞經(jīng)過MPP⁺處理3、6、9和12 h后CDR1as基因表達(dá)顯著降低，這一現(xiàn)象是否與miR-671有關(guān)還需進(jìn)一步研究。

綜上所述，N2a細(xì)胞經(jīng)過MPP⁺處理3、6、9和12 h后CDR1as基因表達(dá)水平顯著降低，本文結(jié)果為研究CDR1as基因在PD發(fā)病中的作用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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（本文編輯馬偉平）