張靜嫻,陳蕾蕾,謝俊霞

(青島大學(xué)腦科學(xué)與疾病研究院,山東省神經(jīng)相關(guān)疾病的機(jī)制與防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東省沿海地區(qū)神經(jīng)退變疾病協(xié)同創(chuàng)新中心,山東 青島 266071)

作為全球第二位的神經(jīng)退行性疾病，帕金森病(PD)病理特點(diǎn)是黑質(zhì)區(qū)多巴胺能神經(jīng)元丟失，且殘存的細(xì)胞內(nèi)存在以α-突觸核蛋白(α-syn)聚集體為主的路易小體并伴有鐵沉積[1-3]。研究表明，寬尖峰動(dòng)作電位、自主起搏電活動(dòng)、胞漿鈣振蕩和較低的鈣緩沖能力是黑質(zhì)區(qū)多巴胺能神經(jīng)元區(qū)別于其他神經(jīng)元的重要生理特征，而這種差異可能是PD黑質(zhì)區(qū)多巴胺能神經(jīng)元選擇性丟失的重要原因[4-5]。PD中鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)可以通過增加超氧化物和活性氧的產(chǎn)生使氧化應(yīng)激水平升高，而氧化應(yīng)激增加是PD中多巴胺能神經(jīng)元死亡的機(jī)制之一[6-8]。引起PD中鈣穩(wěn)態(tài)失衡可能與α-syn聚集和鐵沉積有關(guān)，但具體機(jī)制尚未完全闡明[9-11]。有研究顯示，聚集形式的α-syn和枸櫞酸鐵銨(FAC)均可以使原代神經(jīng)元細(xì)胞質(zhì)中鈣離子增加[9-12]。最近研究表明，經(jīng)錯(cuò)誤折疊后寡聚體形式的α-syn可使細(xì)胞膜完整性破壞，細(xì)胞內(nèi)鈣離子增多并誘發(fā)鐵死亡[11]。然而，鐵過載能否加劇α-syn誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)鈣離子增多這一過程，目前尚不清楚。本研究擬應(yīng)用多西環(huán)素(DOX)誘導(dǎo)iPC12細(xì)胞高表達(dá)α-syn，并在該細(xì)胞模型上探討FAC對(duì)過表達(dá)α-syn誘發(fā)iPC12細(xì)胞內(nèi)鈣離子增多的影響?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)所用的iPC12細(xì)胞系為穩(wěn)轉(zhuǎn)外源(人)SNCA(A53T)PC12細(xì)胞系，PC12細(xì)胞系是大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞瘤分化細(xì)胞株；DMEM高糖培養(yǎng)液和胰蛋白酶購(gòu)于Hyclone公司；胎牛血清購(gòu)于依科賽公司；馬血清和GENETIXIN購(gòu)于Gibco公司；FAC、去鐵銨(DFO)、鈣比色測(cè)定試劑盒和DOX均購(gòu)于Sigma公司；潮霉素B購(gòu)于賽默飛公司；磷酸酶抑制劑(04906837001)購(gòu)于羅氏公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)非無菌器具均高壓滅菌烘干后使用。待所用培養(yǎng)液在37 ℃水浴鍋中預(yù)熱后，將液氮凍存的細(xì)胞取出，迅速放置在37 ℃水浴鍋中，快速搖晃至完全融開，將全部細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至10 mL已預(yù)熱的完全培養(yǎng)液中，吹打均勻后以1 000 r/min離心5 min。離心后棄上清液，用5 mL完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，然后轉(zhuǎn)移至25 cm3的培養(yǎng)瓶中，將培養(yǎng)瓶放在細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)(37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2)。每4～5 d傳代1次，傳代3次后以1×108/L接種于六孔板中，每孔加2 mL完全培養(yǎng)液。細(xì)胞匯合度達(dá)70%～80%時(shí)進(jìn)行后續(xù)處理。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及處理

為觀察鐵過載對(duì)iPC12細(xì)胞內(nèi)鈣離子的影響，將細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組、DOX組、DOX+FAC組和DOX+DFO組。對(duì)照組用細(xì)胞培養(yǎng)液處理48 h，DOX組用2 mg/L的DOX處理48 h，DOX+FAC組細(xì)胞先給予2 mg/L的DOX處理24 h后再用100 μmol/L的FAC處理24 h，DOX+DFO組給予2 mg/L的DOX處理24 h后再用100 μmol/L的DFO處理24 h。

1.4 細(xì)胞內(nèi)鈣離子測(cè)定

六孔板藥物處理完畢，負(fù)壓吸取上清后，使用0.01 mol/L的PBS潤(rùn)洗1次，吸凈液體，每孔加入100 μL細(xì)胞裂解液，置冰上裂解半小時(shí)后，用刮板盡可能將細(xì)胞刮下，并轉(zhuǎn)移至1.5 mL的EP管中，4 ℃下以12 000 r/min離心30 min后，吸取85 μL上清。鈣比色測(cè)定試劑盒平衡至室溫后，將標(biāo)準(zhǔn)品用雙蒸水稀釋至每孔0、0.4、0.8、1.2、1.6和2.0 μg。每孔加入待測(cè)樣本40 μL，然后用雙蒸水補(bǔ)足至體積50 μL。在標(biāo)準(zhǔn)品孔和待測(cè)樣本孔中分別加入90 μL顯色試劑，然后每孔加入60 μL鈣緩沖試劑，輕輕混勻后在37 ℃環(huán)境中避光孵育15 min。用酶標(biāo)儀(SpectraMax M5，Molecular Devices)在波長(zhǎng)575 nm處測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣本的吸光度值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 鐵過載對(duì)過表達(dá)α-syn誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)鈣離子增多的影響

對(duì)照組、DOX組和DOX+FAC組的細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度分別為(0.192±0.007)、(0.237±0.005)和(0.292±0.017)mmol/L(n=3)，3組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=43.84，P<0.05)。與對(duì)照組相比較，DOX組細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=3.187，P<0.05)；與DOX組相比，DOX+FAC組細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度進(jìn)一步升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=4.074，P<0.05)。提示FAC可加劇過表達(dá)α-syn誘發(fā)的細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平升高。

2.2 DFO對(duì)過表達(dá)α-syn誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)鈣離子增多的影響

對(duì)照組、DOX組和DOX+DFO組的細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度分別為(0.192±0.007)、(0.237±0.005)和(0.216±0.020)mmol/L(n=3)，3組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=5.97，P<0.05)。與DOX組相比較，DOX+DFO組細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度無明顯變化(q=1.430，P>0.05)。提示DFO對(duì)過表達(dá)α-syn誘發(fā)的細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平升高無明顯影響。

3 討 論

鈣是細(xì)胞內(nèi)調(diào)控重要生命活動(dòng)的第二信使，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的低鈣濃度(100 nmol/L)是細(xì)胞信號(hào)中靈敏激活鈣級(jí)聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵[13]。已有研究結(jié)果表明，PD中鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)可以通過增加α-syn聚集和線粒體氧化應(yīng)激對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生損傷[6,14]。一方面，鈣除了調(diào)控α-syn分泌外，還可以與其C端結(jié)合，引起非淀粉樣成分結(jié)構(gòu)域變化，促進(jìn)β-折疊結(jié)構(gòu)形成，從而促進(jìn)α-syn聚集體的形成[14-15]；另一方面，鈣信號(hào)可以通過增加超氧化物和活性氧的水平來破壞線粒體復(fù)合體Ⅰ和Ⅲ[16]。

鈣促進(jìn)α-syn聚集后，聚集的α-syn可以作用于細(xì)胞膜，導(dǎo)致鈣離子內(nèi)流，也可以引起細(xì)胞氧化損傷[11]。鐵沉積作為PD的顯著病理特征，不僅可以促進(jìn)α-syn聚集，還可以增加氧化應(yīng)激水平[17-18]。鐵過載在神經(jīng)元細(xì)胞上可以通過激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的Ryanodine受體，增加細(xì)胞內(nèi)鈣離子的水平[12]。雖然α-syn聚集和鐵沉積分別會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平升高，但卻鮮有研究報(bào)道二者共同作用對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣離子的影響。本研究結(jié)果表明，鐵過載可以加劇α-syn誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增高，但是鐵和α-syn共同作用引起鈣離子變化的機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果還表明，DFO對(duì)過表達(dá)α-syn誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)鈣離子增多無明顯影響。推測(cè)這可能是由于DFO不能進(jìn)入細(xì)胞，無法有效阻斷鐵激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上Ryanodine受體引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子增多的過程。黑質(zhì)致密帶多巴胺能神經(jīng)元自主起搏電活動(dòng)主要依賴于L型鈣通道的Cav1.3亞型[19]。而且有文獻(xiàn)報(bào)道，早期PD病人大腦中Cav1.3/Cav1.2的表達(dá)比值增加[20]。由上述研究可知，L型電壓門控通道在PD的鈣穩(wěn)態(tài)失衡中至關(guān)重要。因此，接下來的研究可進(jìn)一步探索鐵和α-syn引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子增多時(shí)L型電壓門控通道的變化，這為后續(xù)研究PD中鈣穩(wěn)態(tài)失衡機(jī)制提供了新的思路。但PD中鈣穩(wěn)態(tài)失衡的具體機(jī)制以及PD中異常鈣離子如何流動(dòng)還有待進(jìn)一步研究探討。