柱前衍生化HPLC法測定藏藥熏倒牛種子中15種氨基酸含量

李運(yùn) 張國強(qiáng) 高鵬 李紅玉 景明 魏鋒

【摘要】目的：建立柱前衍生化HPLC法測定藏藥熏倒牛種子中15種氨基酸的含量。方法：供試品在一定量6 moL·L-1鹽酸中110 ℃水解6 h，與異硫氰酸苯酯進(jìn)行衍生化反應(yīng)。采用CAPCELL PAK-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，以80%乙腈溶液（A）-0.056 moL·L-1乙酸鈉緩沖液（B）為流動(dòng)相，梯度洗脫（0～15 min，5%A;15～20 min，5%A→20%A;20～35 min，20%A→36%A;35～45 min，36%A→70%A;45～50 min，70%→90%A;50～55 min，90%A;55～56 min，90%A→5%A;56～60 min，5%A），流速為1.0 mL·min-1，檢測波長254 nm，色譜柱溫度40 ℃。結(jié)果：15種氨基酸衍生物能夠達(dá)到基線分離，在0.96～58.56 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，r≥0.9991，精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性試驗(yàn)的RSD值分別小于2.73%、2.85%、2.89%，加樣回收率介于95.2%～104.4%之間，RSD值均小于2.46%。經(jīng)測定，3 批熏倒牛種子中氨基酸總含量分別為1.64%、1.55%和1.08%。結(jié)論：此法簡便易行，可用于藏藥熏倒牛種子中15種氨基酸的含量測定。

【關(guān)鍵詞】藏藥;熏倒牛;種子;氨基酸含量;高效液相色譜法

【中圖分類號(hào)】R284【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號(hào)】1007-8517（2022）04-0048-05

Determination of 15 amino acids in Biebersteinia heterostemon Maxim seeds by precolumn derivation HPLC

LI Yun1，2ZHANG Guoqiang3GAO Peng1LI Hongyu2JING Ming3WEI Feng4

1.Lanzhou Institute for Food and Drug Control /Gansu Engineering Research Center for Monitoring

Exogenous Harmful Residues in Traditional Chinese Medicines， Lanzhou 730030， China;

2.Pharmacy College of Lanzhou University，Lanzhou 730000， China;

3.Pharmacy Collage of Gansu University of Chinese Medicine，Lanzhou 730000， China;

4.National Institutes for Food and Drug Control，Beijing 100050，China

Abstract：Objective To establish a precolumn derivation HPLC method for the determination of 15 amino acids in Biebersteinia heterostemon Maxim seeds. Methods The sample was hydrolyzed in 6 moL·L-1 hydrochloric acid at 110 ℃ for 6 hours，and derivatized with phenyl isothiocyanate （PITC）.The analysis was carried out on a CAPCELL PAK-C18 chromatographic column（250 mm×4.6 mm，5 μm）with 80% acetonitrile（A）- 0.056 mol·L-1 sodium acetate buffer （B） as mobile phase by gradient elution（0～15 min，5%A;15～20 min，5%A→20%A;20～35 min，20%A→36%A;35～45min，36%A→70%A;45～50 min，70%→90%A;50～55 min，90%A;55～56 min，90%A→5%A;56～60 min，5%A），at a flow rate of 1.0 mL·min-1， the detection wavelength was 254 nm， the column temperature was set at 40 ℃. Results The 15 amino acids were able to achieve baseline separation in a good linear range of 0.96～58.56 μg·mL-1（r≥0.9991）.The RSD values of precision， repeatability and stability tests were respectively less than 2.73%、2.85%、2.89%， and the recoveries of the 15 amino acids （n=6，RSD<2.46%） were between 95.2% and 104.4%. The total contents of the amino acids in three batches of Biebersteinia heterostemon Maxim seeds were 1.64%、1.55%和1.08%.Conclusion This method is simple and easy to operate. It can be used for the determination of 15 amino acids in Tibetan medicine Biebersteinia heterostemon Maxim seeds.

Keywords：Tibetan Medicine; Biebersteinia heterostemon Maxim;Seeds; Amino Acid Contents; HPLC

藏藥熏倒牛（Biebersteinia heterostemon Maxim.）為牻牛兒苗科熏倒牛屬植物，是藏藥“明見賽?！钡脑参飦碓粗?[1]。具有清熱解毒、散腫止痛、清血熱、祛風(fēng)毒的功效，用于治療各種炎癥、結(jié)核癥、丹毒、瘧疾、咽喉腫痛、胃痛、全身水腫、中風(fēng)等疾病[2]。目前，國內(nèi)外學(xué)者主要側(cè)重于熏倒牛中主要化學(xué)成分的分離鑒定及初步的藥理活性研究，發(fā)現(xiàn)其主要含有黃酮、生物堿、苯丙素、香豆素、甾醇、糖類、揮發(fā)油和萜類等化合物[3-6]，并具有抗氧化[7]、降血糖[8]等活性，民間用于治療小兒驚厥、抽搐、感冒發(fā)熱等。在藏區(qū)的走訪調(diào)研中發(fā)現(xiàn)，熏倒牛種子可用于治療各種炎癥類、膽囊類疾病及喉蛾、疔瘡等。民族藥用于疾病的治療，藥效的發(fā)揮往往基于多成分多靶點(diǎn)的共同作用，對(duì)于熏倒牛種子的研究，僅見于對(duì)其籽油中脂肪酸成分的分析[9]，從其中鑒定出11種脂肪酸類化合物，主要為棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、亞麻酸等成分，不飽和脂肪酸為74.23%，其中亞油酸含量為73.04%。

氨基酸類成分是重要的生命物質(zhì)，是組成蛋白質(zhì)和酶的基本單元，能夠增強(qiáng)機(jī)體免疫力、調(diào)節(jié)新陳代謝等[10]。對(duì)于熏倒牛種子中氨基酸的相關(guān)研究，未見報(bào)道。本文采用柱前衍生化法，利用氨基酸在偏堿性環(huán)境下，與異硫氰酸苯酯反應(yīng)生成硫脲，經(jīng)分子內(nèi)環(huán)化，生成乙內(nèi)酰苯硫脲類化合物，可用高效液相色譜儀進(jìn)行定量分析。通過掌握熏倒牛種子中的氨基酸含量，以期為進(jìn)一步研究藏藥熏倒牛藥材中的化學(xué)成分，深入挖掘其用藥潛力和價(jià)值提供參考。

1儀器與材料

1.1儀器Waters e2695高效液相色譜儀（包括四元泵、Waters 2998 PDA 檢測器、自動(dòng)進(jìn)樣器及 Empower工作站，美國Waters公司）;MS205DU型十萬分之一分析天平（瑞士Mettle Toledo公司）;Milli-Q IQ 7000超純水系統(tǒng)（德國默克密理博公司）;SBL-10DT超聲波恒溫清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）;微量移液器（德國eppendorf股份公司）。

1.2材料谷氨酸（批號(hào)：140690-201604，含量99.9%）、甘氨酸（批號(hào)：140689-201605，含量100%）、精氨酸（批號(hào)：140685-201707，含量99.9%）、蘇氨酸（批號(hào)：140682-201302，含量99.9%）、丙氨酸（批號(hào)：140680-201604，含量100%）、酪氨酸（批號(hào)：140609-201513，含量99.8%）、纈氨酸（批號(hào)：140681-201703，含量99.5%）、異亮氨酸（批號(hào)：140683-201302，含量99.9%）、亮氨酸（批號(hào)：140687-201804，含量99.9%）、苯丙氨酸（批號(hào)：140676-201706，含量100%）、鹽酸賴氨酸（批號(hào)：140673-201509，含量99.9%），均由中國食品藥品檢定研究院提供;L-絲氨酸（批號(hào)：B21932，含量98.0%）、L-脯氨酸（批號(hào)：B21914，含量99.0%）、L-蛋氨酸（批號(hào)：B21913，含量98.0%）、L-色氨酸（批號(hào)：B21930，含量98.0%），均由上海源葉生物科技有限公司提供;乙腈為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

實(shí)驗(yàn)所用熏倒牛種子，分別采自于甘肅省合作市（樣品編號(hào)S1、S2）、甘肅省定西市安定區(qū)（樣品編號(hào)S3），并經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院景明教授鑒定為牻牛兒苗科熏倒牛屬植物Biebersteinia heterostemon Maxim.的干燥成熟種子。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件采用色譜柱：CAPCELL PAK-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動(dòng)相為80%乙腈溶液（A）-0.056 mol·L-1乙酸鈉緩沖液（B）;流速為1 mL·min-1;檢測波長254 nm;色譜柱溫度40 ℃;進(jìn)樣體積：10 μL。梯度洗脫程序：0～15 min，5%A;15～20 min，5%A→20%A;20～35 min，20%A→36%A;35～45 min，36%A→70%A;45～50 min，70%→90%A;50～55 min，90%A;55～56 min，90%A→5%A;56～60 min，5%A。

2.2溶液的制備

2.2.1乙酸鈉緩沖溶液取三水合乙酸鈉7.587 g，加水850 mL，冰醋酸調(diào)節(jié)PH=6.5（約2滴），加水75 mL，乙腈70 mL，配制成濃度為0.056 moL·L-1的乙酸鈉緩沖液。

2.2.20.1moL·L-1的異硫氰酸苯酯（PITC）精密移取 PITC 0.30 mL，加入乙腈定容至25 mL，搖勻即得。

2.2.31.0moL·L-1三乙胺溶液移取三乙胺3.475 mL，加入乙腈定容至 25 mL，搖勻即得。

2.2.4對(duì)照品溶液衍生化溶液的配制分別精密稱取15種氨基酸對(duì)照品適量，用0.1 moL·L-1鹽酸定容于10 mL容量瓶，配制成一定濃度的對(duì)照品溶液，分別取各濃度氨基酸對(duì)照品溶液適量，配制成每1毫升含有谷氨酸、甘氨酸、精氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、酪氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、鹽酸賴氨酸、L-絲氨酸、L-脯氨酸、L-蛋氨酸、L-色氨酸分別為58.56 μg、11.38 μg、20.56 μg、18.88 μg、10.36 μg、21.04 μg、21.92 μg、10.02 μg、9.62 μg、10.72 μg、10.1 μg、19.48 μg、10.04 μg、10.04 μg、19.68 μg的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，取上述溶液1 mL，加入0.1 moL·L-1的PITC及1moL·L-1三乙胺乙腈溶液各0.5 mL。

2.2.5供試品衍生化溶液的制備取藏藥熏倒牛種子粗粉約0.2 g，置于10 mL玻璃頂空瓶中，加6 moL·L-1鹽酸溶液5 mL，充氮?dú)夂髩荷w密封，于110 ℃烘箱中水解6 h，取出后放冷，揮干溶劑，殘?jiān)?.1 moL·L-1鹽酸溶液定容至10 mL容量瓶中;取其1 mL分別加入0.1 moL·L-1的PITC乙腈溶液、1 mol·L-1三乙胺乙腈溶液各0.5 mL，充分混勻，放置1 h，加入2 mL正己烷，混勻，靜置10 min，取2 mL定容于5 mL容量瓶中，即得。

2.2.6空白衍生化溶液的制備用0.1 moL·L-1鹽酸溶液代替樣品，同“2.2.5”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.3方法學(xué)考察

2.3.1系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)精密吸取“2.2.4”項(xiàng)下制備的對(duì)照品溶液和“2.2.5”項(xiàng)下制備的供試品溶液各10 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果表明，供試品中各氨基酸色譜峰保留時(shí)間與對(duì)照品溶液各色譜峰保留時(shí)間一致，目標(biāo)峰與相鄰色譜峰的分離度均>1.5，理論塔板數(shù)以谷氨酸峰計(jì)大于9000，色譜圖如圖1所示。

2.3.2線性關(guān)系考察分別精密吸取“2.2.4”項(xiàng)下制備的對(duì)照品溶液適量，按照供試品溶液中各氨基酸的實(shí)際含量，配制系列濃度的對(duì)照品溶液。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣10 μL，測定色譜峰面積。以對(duì)照品溶液中各標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度（X，μg·mL-1）為橫坐標(biāo)，對(duì)照品溶液中各標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，谷氨酸等15種氨基酸在各自的線性范圍內(nèi)與色譜峰面積的積分值呈良好線性關(guān)系，回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍見表1。

2.3.3精密度試驗(yàn)取“2.2.5”項(xiàng)下供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，計(jì)算峰面積。結(jié)果顯示，各氨基酸質(zhì)量濃度的RSD值均小于2.73%，表明儀器精密度良好。

2.3.4重復(fù)性試驗(yàn)取“2.2.5”項(xiàng)下供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，計(jì)算峰面積。結(jié)果顯示，各氨基酸的平均含量和RSD值分別為1.947 mg·g-1、0.592 mg·g-1、1.783 mg·g-1、0.975 mg·g-1、0.556 mg·g-1、0.349 mg·g-1、1.264 mg·g-1、0.379 mg·g-1、0.440 mg·g-1、0.814 mg·g-1、0.331 mg·g-1、0.713 mg·g-1、0.407 mg·g-1、0.445 mg·g-1、0.864 mg·g-1和2.85%、1.67%、2.13%、1.97%、2.60%、1.67%、2.55%、0.91%、1.32%、0.62%、2.40%、2.12%、1.60%、0.79%、2.57 %。

2.3.5穩(wěn)定性試驗(yàn)取“2.2.5”項(xiàng)下供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別在0 h、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h測定，記錄各組分色譜峰，計(jì)算峰面積。測得各氨基酸成分的色譜峰面積的RSD值分別為1.43%、2.89%、2.65%、2.19%、1.97%、1.87%、1.11%、0.92%、2.58%、0.98%、2.44%、0.63%、1.92%、2.04%、2.60%，表明樣品在8 h內(nèi)的穩(wěn)定性良好。

2.3.6加樣回收率試驗(yàn)精密稱取編號(hào)S1的藏藥熏倒牛樣品0.1 g，共6份，加入各標(biāo)準(zhǔn)品溶液適量，按照“2.2.5”項(xiàng)下制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1，加樣回收率試驗(yàn)中15種氨基酸的平均回收率及RSD值分別為95.16%、101.99%、104.02%、102.03%、96.99%、100.70%、95.35%、101.82%、95.59%、99.56%、104.37%、101.64%、99.86%、99.57%、102.62%和2.01%、1.96%、2.67%、2.46%、1.46%、2.29%、2.22%、2.33%、1.22%、1.78%、0.98%、2.24%、1.61%、1.17%、1.21%。

2.3.7樣品含量測定結(jié)果精密稱取編號(hào)S1-S3的藏藥熏倒牛樣品各3份，每份0.2 g，加入各標(biāo)準(zhǔn)品溶液適量，按照“2.2.5”項(xiàng)下制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，進(jìn)樣體積10 μL，測定樣品中各氨基酸的平均含量。結(jié)果見表2。

3討論

對(duì)于氨基酸的分析，常采用柱前、柱上及柱后衍生化3種方式。采用柱前衍生化，利用HPLC進(jìn)行測定，具有方法穩(wěn)定、普適性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。本研究選用柱前衍生化法，首先對(duì)樣品的水解方式進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)合文獻(xiàn)[11-12]，選擇以6 moL·L-1鹽酸為水解試劑，設(shè)置不同時(shí)間（1、6、12、24 h）進(jìn)行水解，以樣品中各氨基酸含量為標(biāo)準(zhǔn)，優(yōu)選最佳的水解方法，最終選擇以水解溫度110 ℃，水解6 h為樣品水解方法，本方法下，樣品中各氨基酸能夠充分水解，且無焦化現(xiàn)象。其次，通過預(yù)實(shí)驗(yàn)，遴選了最佳衍生化試劑。常見的衍生化試劑主要有鄰苯二甲醛、PITC、二硝基氟苯、9-氯甲酸芴甲酯和丹磺酰氯等[13]。其中用PITC乙腈溶液進(jìn)行衍生化處理具有產(chǎn)物單一、穩(wěn)定等特征[14-15]，通過優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方法，最終選擇以0.1 moL·L-1的異硫氰酸苯酯（PITC）乙腈溶液及1 moL·L-1三乙胺乙腈溶液，時(shí)間為1 h進(jìn)行衍生化處理。

本研究結(jié)果提示，藏藥熏倒牛種子中含有豐富的人體必需氨基酸，約占樣品中氨基酸總量的37.4%～38.6%。同時(shí)谷氨酸、甘氨酸、精氨酸、亮氨酸、L-絲氨酸等氨基酸含量較高，3批熏倒牛樣品中，五種氨基酸的平均含量分別介于2.363～4.060 mg·g-1、1.403～1.982 mg·g-1、1.155～1.641 mg·g-1、0.830～1.314 mg·g-1、0.679～1.070 mg·g-1之間。

本文通過建立柱前衍生化HPLC法同時(shí)測定藏藥熏倒牛種子中15種氨基酸的含量，具有操作簡單，準(zhǔn)確度高等特點(diǎn)，能夠?yàn)椴厮幯古７N子的藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)、深入開發(fā)等提供基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2021-07-02編輯：陶希睿）

基金項(xiàng)目：甘肅省藥品監(jiān)督管理局2020年度藥品科研項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：2020GSMPA034）;國家藥品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)協(xié)作研究與標(biāo)定（項(xiàng)目編號(hào)：2020-W0204001）。

作者簡介：李運(yùn)（1985-），男，漢族，碩士，高級(jí)工程師，研究方向?yàn)橹兴庂|(zhì)量控制。E-mail：lyun04@163.com

通信作者：景明（1963-），男，漢族，教授，研究方向?yàn)橹胁厮幃a(chǎn)品開發(fā)研究。E-mail：jm@gszy.edu.cn