大果木姜子主要揮發(fā)性成分防治冠心病的分子機(jī)制研究

陳思宇　唐子茜　楊欣　涂小華　袁龍飛　潘思佳　鄧萬(wàn)娟　趙廷廷

【摘 要】 目的：采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析大果木姜子主要揮發(fā)性成分治療冠心病的分子機(jī)制。方法：通過(guò)頂空固相微萃取技術(shù)分析貴州大果木姜子揮發(fā)性成分，統(tǒng)計(jì)相對(duì)含量大于5%揮發(fā)性成分進(jìn)行靶點(diǎn)篩選，通過(guò)Swiss Target Prediction對(duì)主要揮發(fā)性成分進(jìn)行靶點(diǎn)篩選，在GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)中以“Coronary heart disease ”為關(guān)鍵詞檢索冠心病疾病靶點(diǎn)，基于R 中clusterProfiler包進(jìn)行GO（Gene ontology）和KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes ）富集分析，通過(guò)STRING數(shù)據(jù)庫(kù)檢索靶點(diǎn)可能的潛在相互作用。結(jié)果：檜烯（15.54%）、桉樹(shù)油（6.50%）、β-石竹烯（10.04 %）相對(duì)含量大于5%，共篩選出126個(gè)靶點(diǎn)，基于GeneCards篩選出冠心病靶點(diǎn)1709個(gè)，通過(guò)FunRich取交集，篩選出大果木姜子治療冠心病靶點(diǎn)66個(gè)，主要通過(guò)PPAR信號(hào)通路（PPAR signaling pathway）防治冠心病。通過(guò)蛋白相互作用分析發(fā)現(xiàn)alpha-2A腎上腺素能受體（Alpha-2A adrenergic receptor，ADRA2A）、alpha-2B腎上腺素能受體（Alpha-2B adrenergic receptor，ADRA2B）、Alpha-2C 腎上腺素能受體（Alpha-2C adrenergic receptor，ADRA2C）、過(guò)氧化物異構(gòu)酶體增殖子激活受體（Peroxisome proliferator- activated receptor gamma， PPAR-γ）為關(guān)鍵靶點(diǎn)。結(jié)論：大果木姜子主要揮發(fā)性成分防治冠心病的關(guān)鍵靶點(diǎn)為ADRA2A、ADRA2B、ADRA2C、PPAR-γ。

【關(guān)鍵詞】 大果木姜子;冠心病;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);通路分析

【中圖分類(lèi)號(hào)】R285.5【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A? 【文章編號(hào)】1007-8517（2022）05-0033-06

基金項(xiàng)目：貴州中醫(yī)藥大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項(xiàng)目[貴中醫(yī)大創(chuàng)合字（2018）8號(hào)];貴州中醫(yī)藥大學(xué)科研項(xiàng)目[貴中醫(yī)科院內(nèi)（2019）21號(hào)]。

作者簡(jiǎn)介：陳思宇（1999-），女，漢族，本科，研究方向?yàn)橹兴幘W(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)。E-mail：1208877346@qq.com

通信作者：楊欣（1987-），女，漢族，博士，副教授，研究方向?yàn)橹兴幪烊凰幬锼幮镔|(zhì)基礎(chǔ)研究。E-mail：25066640 @qq.com

Study on the Molecular Mechanism of Main Volatile Components of Litsea lancilimba Merr.

in the Control of Coronary Heart Disease

CHEN Siyu TANG Zixi YANG Xin* TU Xiaohua YUAN Longfei PAN Sijia DENG Wanjuan ZHAO Tingting

Guizhou University of Traditional Chinese Medicine， Guiyang 550025，China

Abstract：Objective Using network pharmacology to analyze the molecular mechanism of the main volatile components of Litsea lancilimba Merr. in the treatment of coronary heart disease. Methods Analysis of volatile components of Litsea lancilimba Merr. by headspace solid phase microextraction technology， the relative content of volatile components were more than 5%， and the main volatile components were selected by Swiss Target Prediction. Search for coronary heart disease target with “Coronary heart disease” as key word in GeneCards database. Based on the clusterProfiler package in R for GO（Gene ontology） and KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes ） enrichment analysis. Retrieving possible potential interactions of targets through STRING databases. Results The relative contents of sabinene（15.54%）， eucalyptus oil（6.50%） and β-bamboos（10.04%）were more than 5%. A total of 126 targets were screened. 1709 coronary heart disease targets selected based on GeneCards. 66 targets for the treatment of coronary heart disease in Litsea lancilimba Merr. were selected by FunRich. Prevention and treatment of coronary heart disease mainly through PPAR signaling pathway.Protein interaction analysis revealed alpha-2A adrenergic receptor（ADRA2A）， alpha-2B adrenergic receptor（ADRA2B）， Alpha-2C adrenergic receptor（ADRA2C） and Peroxisome proliferator-activated receptor gamma（PPAR-γ） are key targets. Conclusion The key targets of the main volatile constituents of the major volatile components in the prevention and treatment of coronary heart disease are ADRA2A， ADRA2B， ADRA2C and PPAR-γ.1995F08F-1AD4-4998-96D6-3A1CB4DAB0B6

Key words：Litsea lancilimba Merr.; Coronary Heart Disease; Network Pharmacology; Pathway Analysis

冠心病全稱(chēng)冠狀動(dòng)脈性心臟?。–oronary heart disease，CHD），為臨床常見(jiàn)疾病之一，嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康，其發(fā)病率和死亡率逐年上升。目前，從抗凝降脂、抗血小板、減弱心肌收縮力、擴(kuò)冠脈等對(duì)癥治療，治療效果顯著，且起效快，但是不良反應(yīng)也會(huì)導(dǎo)致心肌梗死危及生命^[1]。CHD是一種高危害性的心臟疾病，不做好預(yù)防會(huì)導(dǎo)致惡變。CHD發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)危險(xiǎn)因素、發(fā)病機(jī)制成為研究的熱點(diǎn)。目前在臨床上應(yīng)用中藥、針灸等中醫(yī)療法結(jié)合歷代醫(yī)家的理論與臨床經(jīng)驗(yàn)，在冠心病的治療上發(fā)揮了較大的優(yōu)勢(shì)^[2]。

大果木姜子（Litsea lancilimba Merr.）是貴州苗族 、布依族民間習(xí)用藥材，稱(chēng)為貴州十大苗藥之一。具有溫中散寒、理氣止痛，是苗族治療心痛、胸痹、腹痛的常用草藥，藥理學(xué)研究^[3]發(fā)現(xiàn)其在冠心病、心絞痛等心血管疾病中發(fā)揮重要作用。實(shí)驗(yàn)^[4]證明大果木姜子揮發(fā)油含量較高，其化學(xué)成分主要為單萜或倍半萜類(lèi)，未發(fā)現(xiàn)對(duì)人體有害的黃樟醚等物質(zhì)。因此，本研究通過(guò)前期實(shí)驗(yàn)獲得大果木姜子揮發(fā)油的主要化學(xué)成分，對(duì)主要化學(xué)成分進(jìn)行分析，獲得主要化學(xué)成分治療冠心病的關(guān)鍵靶點(diǎn)，對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，篩選出大果木姜子主要化學(xué)成分治療冠心病的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1 實(shí)驗(yàn)材料及方法

1.1 數(shù)據(jù)庫(kù)及軟件 GeneCards（https：//www.gen ecards.org/）;Cytoscape 3.5.1 （http：//www. cytoscape.org）;STRING（https：//string-db.org/）;R（https：//www.r-project.org）;Swiss Target Prediction（http：//www.swisstargetprediction.ch/）。

1.2 貴州大果木姜子主要揮發(fā)性化學(xué)成分靶點(diǎn)篩選 通過(guò)頂空固相微萃取技術(shù)（Headspace solid phase microextraction，HS-SPME）分析貴州大果木姜子揮發(fā)性成分，統(tǒng)計(jì)相對(duì)含量大于5%揮發(fā)性成分進(jìn)行靶點(diǎn)篩選，通過(guò)Swiss Target Prediction（http：//www.swisstargetprediction.ch/）對(duì)主要揮發(fā)性成分進(jìn)行靶點(diǎn)篩選，選擇“人源”篩選其調(diào)節(jié)的靶點(diǎn)。

1.3 疾病靶點(diǎn)分析 GeneCards（https：//www. genecards.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)作為檢索人類(lèi)基因信息的最優(yōu)解，整合了眾多文獻(xiàn)信息，覆蓋了多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)于基因的分析數(shù)據(jù)。在GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)中以“Coronary heart disease ”為關(guān)鍵詞搜索冠心病靶點(diǎn)。

1.4 GO及通路富集分析 基于R 中clusterProfiler包進(jìn)行GO分析，包括細(xì)胞組成（Cellular Component）、生物過(guò)程（Biological Process）和分子功能（Molecular Function）。clusterProfiler同時(shí)支持GO和KEGG的富集分析。根據(jù)靶點(diǎn)id進(jìn)行富集分析，選擇p-value<0.05為閾值。

1.5 關(guān)鍵靶點(diǎn)分析 通過(guò)STRING數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//string-db.org/）檢索了編碼蛋白間可能的潛在相互作用，并構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，打開(kāi)STRING數(shù)據(jù)庫(kù)點(diǎn)擊“SEARCH”模塊。選擇“Multiple proteins”輸入篩選出的基因或蛋白名稱(chēng)，并在“Organism”中指定物種。下載STRING數(shù)據(jù)庫(kù)中蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)^[5]。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 主要揮發(fā)性成分治療冠心病的靶點(diǎn) 本實(shí)驗(yàn)選擇相對(duì)含量大于5%的成分進(jìn)行研究，其中檜烯（15.54%）、桉樹(shù)油（6.50%）、β-石竹烯（10.04 %）為研究對(duì)象（表1）。基于Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)共篩選出126個(gè)靶點(diǎn)。基于GeneCards篩選出冠心病靶點(diǎn)1709個(gè)，通過(guò)FunRich將大果木姜子主要揮發(fā)性成分靶點(diǎn)與冠心病靶點(diǎn)取交集，共篩選出66個(gè)靶點(diǎn)（如圖1所示）。

3.2 GO分析

3.2.1 潛在靶點(diǎn)生物過(guò)程分析 對(duì)66個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行生物過(guò)程分析（表2）。在生物過(guò)程中，66個(gè)靶點(diǎn)主要參與類(lèi)固醇激素介導(dǎo)的信號(hào)通路（Steroid hormone mediated signaling pathway）、脂質(zhì)代謝過(guò)程的調(diào)節(jié)（Regulation of lipid metabolic process）、激素介導(dǎo)的信號(hào)通路（Hormone-mediated signaling pathway）。

3.2.2 潛在靶點(diǎn)細(xì)胞成分分析 對(duì)66個(gè)靶點(diǎn)細(xì)胞成分分析（表3），66個(gè)靶點(diǎn)主要存在突觸前面（Presynaptic membrane）、突出后膜（Postsynaptic membrane）、突觸細(xì)胞膜（Synaptic membrane）和RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物等。

3.2.3 靶點(diǎn)分子功能分析 對(duì)66個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行分子功能分析（表4）。在分子功能分析中發(fā)現(xiàn)，66個(gè)靶點(diǎn)主要具有類(lèi)固醇激素受體的活性（steroid hormone receptor activity）、核受體的活性（nuclear receptor activity）、類(lèi)固醇的結(jié)合（steroid binding）、核受體轉(zhuǎn)錄輔激活因子活性（nuclear receptor transcription coactivator activity）等。1995F08F-1AD4-4998-96D6-3A1CB4DAB0B6

3.3 通路分析 對(duì)66個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行通路分析（表5）。圖2為通路分析的前10項(xiàng)（P-Value<0.05）。在通路分析中，66個(gè)靶點(diǎn)參與多條信號(hào)通路，與心血管相關(guān)的通路有PPAR信號(hào)通路（PPAR signaling pathway）、血管平滑肌收縮（Vascular smooth muscle contraction）、CGMP-PKG信號(hào)傳導(dǎo)途徑（cGMP-PKG signaling pathway）等，其中PPAR信號(hào)通路為核心通路。

3.4 關(guān)鍵靶點(diǎn)分析 66個(gè)靶點(diǎn)使用 STRING 結(jié)合R軟件進(jìn)行PPI分析，66個(gè)靶點(diǎn)關(guān)聯(lián)密切。根據(jù)Degree 繪制蛋白質(zhì)節(jié)點(diǎn)的條形圖，如圖3所示。Degree>15 的節(jié)點(diǎn)包括alpha-2A腎上腺素能受體（alpha-2A adrenergic receptor，ADRA2A）、alpha-2B腎上腺素能受體（alpha-2B adrenergic receptor，ADRA2B）、Alpha-2C 腎上腺素能受體（alpha-2C adrenergic receptor，ADRA2C）過(guò)氧化物異構(gòu)酶體增殖子激活受體（Peroxisome proliferator- activated receptor gamma， PPAR-γ），關(guān)鍵靶點(diǎn)的生物學(xué)效應(yīng)見(jiàn)表4。

4 討論

隨著人口老齡化、人口增長(zhǎng)，心血管疾病的患病人數(shù)也逐漸增加，同時(shí)高血脂、糖尿病、高血壓等患病率的上升促使冠心病的患病人數(shù)與日俱增，不良生活方式使冠心病越來(lái)越趨于年輕化，我國(guó)心血管疾病死亡率居首位，嚴(yán)重影響人類(lèi)的生活質(zhì)量和生命健康。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)在冠心病治療上有一定的優(yōu)勢(shì)，其中中藥是冠心病治療方法中不可缺少的部分^[6]。大果木姜子揮發(fā)油能食用和藥用。目前，在心血管疾病方面開(kāi)發(fā)了米槁心樂(lè)滴丸、心胃丹膠囊、米槁精油滴丸等。本研究發(fā)現(xiàn)大果木姜子主要揮發(fā)性成分為檜烯（15.54%）、桉樹(shù)油（6.50%）、β-石竹烯（10.04 %），相對(duì)含量大于5%，通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析發(fā)現(xiàn)其調(diào)節(jié)的靶點(diǎn)主要參與PPAR信號(hào)通路防治冠心病。過(guò)氧化物酶體增殖物激活型受體（Peroxisome proliferator activated-receptors， PPARs）已發(fā)現(xiàn)有PPAR-α、PPAR-β、PPAR-γ三種亞型，其中以PPAR-γ的研究較為深入，在血管壁細(xì)胞（如內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞）及心肌細(xì)胞等有表達(dá)，能改善心室重構(gòu)，與心血管疾病和高血壓有關(guān)^[7]。

本研究發(fā)現(xiàn)大果木姜子主要揮發(fā)性成分治療冠心病的關(guān)鍵靶點(diǎn)為alpha-2A腎上腺素能受體（Alpha-2A adrenergic receptor，ADRA2A）、alpha-2B腎上腺素能受體（Alpha-2B adrenergic receptor，ADRA2B）、Alpha-2C 腎上腺素能受體（Alpha-2C adrenergic receptor，ADRA2C）過(guò)氧化物異構(gòu)酶體增殖子激活受體（Peroxisome proliferator- activated receptor gamma， PPAR-γ）。其中腎上腺素能受體主要是作為媒介轉(zhuǎn)導(dǎo)為兒茶酚胺作用的組織受體。α2腎上腺素能受體分為ADRA2A、ADRA2B、ADRA2C三種亞型。已有研究^[8]表明：對(duì)腎上腺素能α、β受體進(jìn)行阻斷作用，產(chǎn)生阻斷作用可有效降低血壓、預(yù)防心律失常等疾病的發(fā)生;PPAR-γ屬于核受體家族成員，已有研究^[9]發(fā)現(xiàn)：PPAR-γ在冠心病患者血清中明顯高于健康人群，然而PPAR-γ在冠心病相關(guān)研究較少，因此明確PPAR-γ在冠心病的相關(guān)性及作用機(jī)制，具有重要的臨床意義^[9]。本研究將分析化學(xué)和計(jì)算機(jī)理論知識(shí)運(yùn)用到科研上，加強(qiáng)學(xué)科之間的相互滲透、融合^[10-11]。篩選出大果木姜子揮發(fā)油的預(yù)防冠心病的關(guān)鍵靶點(diǎn)，為其揮發(fā)油藥理作用的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用提供理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1]尹嘉，洪曹棟，牛天福.冠心病的中醫(yī)研究進(jìn)展[J]. 中醫(yī)研究， 2019，32（12）：76-78.

[2]劉超，黃明艷，陳光，等.冠心病中醫(yī)證候研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志， 2020， 27（5）：137-141.

[3]錢(qián)斌，李江.苗藥大果木姜子口服乳劑和靜脈乳劑對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性心肌缺血的保護(hù)作用[J].貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，31（3）：43-45.

[4]陳達(dá)，楊佃志.大果木姜子不同組方提取物體外抗菌試驗(yàn)研究[J].中國(guó)民族民間醫(yī)藥，2010， 19（18）：42-44.

[5]SZKLARCZYK D， MORRIS J H， COOK H， et al. The STRING database in 2017： quality-controlled protein-protein association networks， made broadly accessible[J].Nucleic Acids Res，2017， 45（D1）：D362-D368.

[6]閻文龍.冠心病的流行病學(xué)調(diào)查研究[D].長(zhǎng)春：長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)， 2018.

[7]GIZARD F， AMANT C， BARBIER O， et al. PPAR alpha inhibits vascular smooth muscle cell proliferation underlying intimal ?hyperplasia by inducing the tumor suppressor p16INK4a[J]. J Clin Invest， 2005，115（11）：3228-3238.

[8]李正在，廖玉華，周子華， 等. 高血壓患者抗α1腎上腺受體抗體與心臟重構(gòu)的臨床觀察[J].中華心血管雜志， 2006， 34（7）：602-604.

[9]楊桐，鄭宏，王江. 過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體-激動(dòng)劑心肌保護(hù)作用機(jī)制的研究進(jìn)展[J].國(guó)際麻醉學(xué)與復(fù)蘇雜志， 2017，38（4）：378-381.

[10]鄧雅文. 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的血府逐瘀湯治療冠心病的機(jī)制研究[D].北京：中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院， 2020.

[11]劉艾林，杜冠華.計(jì)算機(jī)藥物篩選方法探討[J].計(jì)算機(jī)與應(yīng)用化學(xué)，2002，19（1）：32-34.

（收稿日期：2021-07-12 編輯：陶希睿）1995F08F-1AD4-4998-96D6-3A1CB4DAB0B6