周源　第五永長　王郁金　侯杰軍　陳連吉　王楠　王亞麗　張琪

〔摘要〕 目的 探究洗心湯對2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus， T2D）合并阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease， AD）小鼠模型中JAK2/STAT3通路和胰島素降解酶（insulin degrading enzyme， IDE）蛋白表達的影響，闡明其緩解AD相關癥狀的分子機制。方法 通過對APP/PS1小鼠腹腔注射鏈脲佐菌素（streptozotocin， STZ）構建T2D-AD小鼠模型，然后分別給予安理申和洗心湯灌胃治療。共分為4組：對照組、T2D-AD組、安理申組和洗心湯組。通過定位航行實驗和空間探索實驗考察小鼠的空間記憶能力;通過qRT-PCR檢測IDE mRNA的表達水平;ELISA檢測各組小鼠腦組織中炎癥因子（TNF-α、IL-6、IL-8）的水平;Western blot檢測各組小鼠腦組織中JAK2、STAT3、IDE和β淀粉樣蛋白（amyloid-β peptides， Aβ）的表達水平。結果 與對照組相比，T2D-AD組小鼠的逃避潛伏期顯著增加（P<0.05），目標平臺象限滯留時間與穿越平臺次數均顯著減少（P<0.05）;與T2D-AD組相比，安理申組和洗心湯組小鼠逃避潛伏期均顯著縮短（P<0.05），小鼠目標平臺象限滯留時間與穿越平臺次數均顯著增加（P<0.05）。與對照組相比，T2D-AD組小鼠腦組織中炎癥因子（TNF-α、IL-6、IL-8）的水平顯著升高（P<0.05）;與T2D-AD組相比，安理申組和洗心湯組小鼠腦組織中炎癥因子（TNF-α、IL-6、IL-8）的水平顯著降低（P<0.05）。與對照組相比，T2D-AD組小鼠腦組織中磷酸化JAK2和STAT3水平顯著升高（P<0.05）;洗心湯組小鼠腦組織中磷酸化JAK2和STAT3水平顯著低于T2D-AD組（P<0.05）。與對照組相比，T2D-AD組小鼠腦組織中IDE mRNA和蛋白水平顯著降低（P<0.05），Aβ蛋白表達顯著升高（P<0.05）;與T2D-AD組比較，洗心湯組小鼠腦組織中IDE mRNA和蛋白水平顯著升高（P<0.05），Aβ蛋白表達顯著降低（P<0.05）。結論 洗心湯能夠通過抑制T2D-AD小鼠模型中JAK2/STAT3通路的激活緩解小鼠大腦中的炎癥反應，并促進IDE蛋白表達，促進Aβ蛋白的降解。

〔關鍵詞〕 洗心湯;阿爾茨海默病;2型糖尿病;胰島素降解酶;JAK2/STAT3通路;β淀粉樣蛋白

〔中圖分類號〕R285.5? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2022.05.006

Effect of Xixin Decoction on JAK2/STAT3 pathway and IDE protein expression in

T2D combined AD mouse model

ZHOU Yuan DIWU Yongchang WANG Yujin HOU Jiejun CHEN Lianji WANG Nan WANG Yali ZHANG Qi

（1. Department of Anatomy， Basic Medical College， Shaanxi University of Chinese Medicine， Xianyang， Shaanxi 712046， China; 2. Shaanxi Key Laboratory of Chinese Medicine Encephalopathy， Shaanxi University of Chinese Medicine， Xianyang， Shaanxi 712046， China; 3. Discipline Innovation Team of Shaanxi University of Chinese Medicine， Xianyang， Shaanxi 712046， China;

4. Department of Clinical Medicine， The Second Clinical Medical College， Shaanxi University of Chinese Medicine， Xianyang， Shaanxi 712046， China; 5. Department of TCM Diagnosis， Basic Medical College， Shaanxi University of Chinese Medicine， Xianyang， Shaanxi 712046， China; 6. Affiliated Hospital of Shaanxi University of Chinese Medicine， Xianyang， Shaanxi 712046， China）

〔Abstract〕 Objective To investigate the effect of Xixin Decoction on JAK2/STAT3 pathway and insulin degrading enzyme （IDE） protein expression in mice with type 2 diabetes mellitus （T2D） combined with Alzheimer's disease （AD）， and to elucidate the molecular mechanism of its reduction of AD-related symptoms. Methods T2D-AD mouse model was established by intraperitoneal injection of streptozotocin （STZ） to APP/PS1 mice， and then aricept and Xixin Decoction were given by intragastric administration. They were divided into four groups： control group， T2D-AD group， aricept group and Xixin Decoction group. The spatial memory ability of mice was investigated by navigation experiment and space exploration experiment. The expression level of IDE mRNA was detected by qRT-PCR. The inflammatory factor levels （TNF-α， IL-6 and IL-8） were detected in the brain tissues of each group by ELISA. Western blot was used to detect the protein expression levels of JAK2， STAT3， IDE and Aβ in the brain tissues of mice in each group. Results Compared with the control group， the escape latency of mice in T2D-AD group was significantly increased （P<0.05）， and the retention time of target platform quadrant and the times of crossing platform were significantly decreased （P<0.05）; compared with T2D-AD group， the escape latency of mice in aricept group and Xixin Decoction group was significantly shortened （P<0.05）， and the retention time of mice in target platform quadrant and times of crossing platform were significantly increased （P<0.05）. Compared with control group， the inflammatory factor levels （TNF-α， IL-6 and IL-8） were significantly increased in brain tissues of T2D-AD group （P<0.05）; compared with T2D-AD group， the inflammatory factor levels （TNF-α， IL-6 and IL-8） were significantly decreased in aricept group and Xixin Decoction group （P<0.05）. Compared with the control group， the levels of phosphorylated JAK2 and STAT3 in brain tissues of mice in T2D-AD group were significantly increased （P<0.05）; the levels of phosphorylated JAK2 and STAT3 in the brain tissues of mice in Xixin Decoction group were significantly lower than those in T2D-AD group （P<0.05）. Compared with control group， IDE mRNA and protein levels in T2D-AD group were significantly decreased （P<0.05）， and Aβ protein level was significantly increased （P<0.05）; compared with T2D-AD group， the mRNA and protein levels of IDE in Xixin Decoction group were significantly increased （P<0.05）， and the protein level of Aβ was significantly decreased （P<0.05）. Conclusion Xixin Decoction can inhibit the activation of JAK2/STAT3 pathway in T2D-AD mouse model， alleviate the inflammatory response in mouse brain， promote the expression of IDE protein and the degradation of Aβ protein.

〔Keywords〕 Xixin Decoction; Alzheimer's disease; type 2 diabetes mellitus; insulin degrading enzyme; JAK2/STAT3 pathway; amyloid-β peptides

阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease， AD）是一種慢性神經退行性疾病，是常見的老年期癡呆的一種，占所有病例的70%～90%[1-2]。它主要是由大腦神經元內β淀粉樣蛋白（amyloid-β peptides， Aβ）的沉積引起的[3-4]。隨著人口老齡化的加劇，世界上的AD患病率正在迅速增加，AD已成為一個公共衛(wèi)生問題，其預防和治療越來越迫切。目前，藥物治療只能緩解AD相關的認知障礙，治療效果有限，不能從根本上控制或逆轉AD發(fā)病機制[5]。越來越多的研究表明，2型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus， T2D）在AD發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用[6-7]。一項研究表明，改善T2D代謝控制可以延遲或預防AD病理學[8]。胰島素降解酶（insulin degrading enzyme， IDE）是一種負責胰島素降解的金屬蛋白酶[9]，同時在體外和體內的Aβ降解中也起到非常關鍵的作用[10]。然而，目前關于IDE在T2D合并AD中的作用機制還未見報道，其中的重要分子機制有待進一步研究。中醫(yī)傳統(tǒng)名方洗心湯是AD治療的代表方。最近的研究表明，洗心湯能夠有效緩解AD癥狀，增強AD大鼠的空間學習能力，改善神經元損傷[11-14]。本研究通過構建T2D合并AD小鼠模型，初步探究了洗心湯在T2D合并AD中調控IDE表達，緩解AD相關癥狀的分子機制，為洗心湯治療AD的應用提供更多的理論基礎。

1 材料與方法

1.1? 藥物及試劑

洗心湯：人參、茯神、半夏、酸棗仁、附子、石菖蒲、陳皮、甘草，由999企業(yè)集團醫(yī)藥股份有限公司提供中藥配方顆粒（批號：0908032）;鏈脲佐菌素（streptozotocin， STZ）（上海麥克林生化科技有限公司，批號：S6089）;安理申[衛(wèi)材（中國）藥業(yè)有限公司生產，商品編號：HST008522）。Lipofectamine 3000和qRT-PCR相關試劑盒均購自美國Thermo Fisher Scientific公司;RNA引物由生工生物工程（上海）有限公司合成;本實驗所用抗體均購自美國Cell Signaling Technology公司。TNF-α、IL-6、IL-8的ELISA試劑盒均購自Abcam公司（批號分別為ab100747、ab222503、ab214030）。

1.2? 動物及分組

24只12周齡SPF級APP/PS1小鼠（商品化的AD模型小鼠），雄性，體質量（22±3） g;8只12周齡雄性C57BL/6J小鼠，體質量（21±4） g，均購于南京君科生物工程有限公司。8只C57BL/6J小鼠作為對照組，APP/PS1小鼠隨機分為T2D-AD組、安理申組和洗心湯組，每組8只。所有動物飼養(yǎng)于SPF級實驗動物房中（20～25 ℃，12 h光照/12 h黑暗循環(huán)），給予充足的水和食物。所有動物實驗均經陜西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院動物倫理委員會SUCMDC20210310036批準，并符合相關操作規(guī)程。

1.3? 給藥方法

對照組小鼠給予T2D-AD組等量藥物的生理鹽水，所有小鼠按0.1 mL/10 g的量給藥。持續(xù)灌胃給藥6個月后進行行為學測試。洗心湯組采用研缽把藥物顆粒研成粉末，用生理鹽水溶解，按1.8 g/（kg·d）劑量灌胃給藥，每天1次;安理申組用生理鹽水溶解定理申，按0.015 mg/（kg·d）劑量灌胃給藥，每天1次。所有藥用劑量根據患者臨床用量的等效劑量和動物體表面積計算所得。給藥劑量參照以往的相關研究[11]。

1.4? T2D合并AD小鼠模型

為建立T2D-AD小鼠模型，APP/PS1小鼠禁食過夜，12～14 h后接受單次腹腔注射鏈脲佐菌素（streptozocin， STZ） （50 mg/kg） 5 d[15]，STZ廣泛用于T2D小鼠模型的誘導[16]。將STZ溶解在0.1 mmol/L檸檬酸鹽緩沖液（pH 5.5）中，并進行無菌過濾來制備STZ溶液。通過尾靜脈收集血樣并進行代謝測量，空腹血糖水平高于12 mmol/L的小鼠被視為T2D小鼠。而后，對小鼠進行為學測試和識別任務。最后，小鼠被麻醉并殺死，收集腦組織進行后續(xù)分析檢測。

1.5? 行為學測試方法

采用Morris水迷宮試驗法測試小鼠學習記憶能力。（1）定位航行實驗：即分別以4個象限池壁的中點作為入水點，將動物面向池壁放入水中，記錄動物尋找并爬上平臺所需時間即逃避潛伏期及游泳距離，各組小鼠每天訓練2次，共訓練5 d。經60 s未找到平臺者，將其引領至平臺，放置30 s引導其學習記憶。（2）空間搜索實驗：第6天撤除平臺，從第一象限中心將動物放入水中，記錄60 s內小鼠在原目標平臺象限的滯留時間和穿越平臺的次數。

1.6? RNA提取、逆轉錄、qRT-PCR

Trizol一步法提取小鼠腦組織中的RNA，抽提的RNA用40 μL的無核酸酶水溶解后-80 ℃保存。取0.5 μg總RNA，用逆轉錄試劑盒合成cDNA，再行PCR擴增目標基因。加入相應引物，將所得cDNA加至PCR反應體系中擴增目標片段。待測樣品分別加入1 μL模板、1 μL正向引物、1 μL反向引物、5 μL SYBR探針和3 μL DEPC水避光混勻后，上機檢測相關分子水平表達。設定PCR反應程序為：95 ℃預變性15 min后，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個循環(huán)。GAPDH作為內參，根據2方法計算相對的基因表達。引物序列見表1。

1.7? 總蛋白提取與Western blot檢測

將各組小鼠斷頭后分離腦組織，-80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆?。取適量腦組織冰上勻漿，用RIPA裂解液裂解30 min，分離提取樣本中的全蛋白，接著用BCA試劑盒檢測蛋白濃度。將蛋白進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后轉至PVDF膜上，并浸入含5%脫脂奶粉的TBST（封閉液）中，搖床封閉2 h（室溫）。加入JAK2、STAT3、IDE一抗（1∶1000）4 ℃孵育過夜。而后PBS洗滌3次，加入相應二抗（1∶5000），震蕩孵育2 h。洗膜后，加入化學發(fā)光試劑（ECL）顯色、膠片曝光。最后使用凝膠成像分析系統(tǒng)拍照，通過ImageJ分析并計算出蛋白灰度值。

1.8? ELISA分析檢測

取適量腦組織加入預冷的PBS并于冰上勻漿，取適量勻漿在4 ℃下，5000×g離心5～10 min，取上清。然后根據ELISA試劑盒制造商說明，分別使用洗滌緩沖液洗滌，抗體孵育，加入相應的反應溶液等，最后置于酶聯免疫檢測儀進行檢測各組小鼠腦組織中TNF-α、IL-6、IL-8的水平。

1.9? 統(tǒng)計學方法

數據處理采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件，計量資料以“x±s”表示，比較采用單因素方差分析或重復測量設計的方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1? 洗心湯對T2D-AD小鼠模型空間記憶能力的影響

與對照組相比，T2D-AD組小鼠2、3、4、5 d的逃避潛伏期顯著增加（P<0.05）;而與T2D-AD組小鼠相比，安理申組和洗心湯組3、4、5 d小鼠逃避潛伏期均顯著縮短（P<0.05）;安理申組和洗心湯組小鼠逃避潛伏期之間進行比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。詳見表2。

與對照組相比，T2D-AD組小鼠目標平臺象限滯留時間與穿越平臺次數均顯著減少（P<0.05）;與T2D-AD組相比，安理申組和洗心湯組小鼠目標平臺象限滯留時間與穿越平臺次數均顯著增加（P<0.05）;安理申組和洗心湯組小鼠目標平臺象限滯留時間與穿越平臺次數之間進行比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。詳見表3。

2.2? 洗心湯對T2D-AD小鼠模型大腦炎癥的影響

與對照組相比，T2D-AD組小鼠腦組織中炎癥因子（TNF-α、IL-6、IL-8）的水平均顯著升高（P<0.05）;與T2D-AD組相比，安理申組和洗心湯組小鼠腦組織中炎癥因子（TNF-α、IL-6、IL-8）的水平均顯著降低（P<0.05）;安理申組和洗心湯組小鼠腦組織中炎癥因子（TNF-α、IL-6、IL-8）的水平進行比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。詳見圖1。

2.3? 洗心湯對T2D-AD小鼠模型中JAK2/STAT3通路的影響

與對照組相比，T2D-AD組小鼠腦組織中磷酸化JAK2和STAT3水平顯著升高（P<0.05）;與T2D-AD組相比，安理申組小鼠腦組織中磷酸化JAK2和STAT3水平差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），但洗心湯組小鼠腦組織中磷酸化JAK2和STAT3水平顯著低于T2D-AD組（P<0.05）。詳見圖2。

2.4? 洗心湯對T2D-AD小鼠模型中IDE的表達和Aβ蛋白降解的影響

與對照組相比，T2D-AD組小鼠腦組織中IDE mRNA和蛋白水平顯著降低（P<0.05），Aβ蛋白表達顯著升高（P<0.05）;與T2D-AD組相比，安理申組小鼠腦組織中IDE mRNA和蛋白水平差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），Aβ蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;但洗心湯組小鼠腦組織中IDE mRNA和蛋白水平顯著高于T2D-AD組（P<0.05），Aβ蛋白表達顯著降低（P<0.05）。詳見圖3。

3 討論

人口老齡化的加劇導致全世界的AD患病率迅速增加，尤其我國老齡化日益嚴重，AD的預防和治療也越來越被人們所關注，并且生活條件的改善也進一步增加了糖尿病的患病率[17]。AD患者往往也會患有不同程度的糖尿病，相關研究表明T2D參與了AD的發(fā)生發(fā)展，二者存在一定的相關性，糖尿病可能增加AD的患病風險[18-19]。然而，目前對于糖尿病合并AD的發(fā)病機制的研究不充分，對其預防以及治療尚缺乏有效策略。因此，本研究通過對APP/PS1小鼠腹腔注射STZ成功構建T2D-AD小鼠模型，以進一步研究T2D-AD進展的具體機制，探究治療策略。

洗心湯是清代名醫(yī)陳士鐸所創(chuàng)，用于治療癡呆癥的中醫(yī)名方，被現代中醫(yī)專著收錄。該藥方通過補益脾胃之氣，化痰開竅，益氣通陽，安神降濁，具有升發(fā)陽氣、祛逐陰邪、平衡陰陽之功效。已有相關研究表明洗心湯能夠有效緩解AD動物模型的癥狀，恢復空間記憶和學習能力，改善神經元損傷，增強海馬神經元突出活性，并調控相關蛋白的表達水平[20-21]。我們的研究同樣發(fā)現，在T2D-AD小鼠模型中，安理申和洗心湯治療后均能夠顯著縮短小鼠逃避潛伏期，并增加小鼠目標平臺象限滯留時間和穿越平臺次數。這表明洗心湯在糖尿病合并AD的治療中仍具有很好的效力。

目前的研究表明，AD的發(fā)病機制主要是由于大腦內Aβ肽異常沉積聚集和tau蛋白的過度磷酸化造成的，這導致神經元細胞活力降低，使患者空間認知能力和記憶學習功能出現障礙[22]。而對于Aβ肽異常的沉積，細胞內存在多種降解酶以清除Aβ蛋白，主要包括腦啡肽酶和IDE[23-25]。胰島素降解酶除了負責胰島素的降解外，還參與了體外和體內的Aβ降解[10]。有報道稱AD和T2D小鼠中IDE表達水平顯著降低[26]，IDE在內的多種Aβ降解酶的低表達，導致Aβ降解緩慢引起Aβ異常沉積，從而誘發(fā)AD。然而，目前關于IDE在T2D合并AD中的作用機制還未見報道，尤其是洗心湯對其表達和功能的影響尚未有相關研究。本研究結果表明，與對照組相比，T2D-AD組小鼠腦組織中IDE mRNA和蛋白水平顯著降低，Aβ蛋白表達顯著升高;洗心湯治療后小鼠腦組織中IDE mRNA和蛋白水平顯著高于T2D-AD組，Aβ蛋白表達顯著降低。這表明洗心湯可能上調IDE蛋白水平，進而促進IDE對Aβ蛋白的降解，緩解Aβ蛋白沉積誘導的AD。這與先前研究報道中IDE能夠參與體內外Aβ的降解[10]，增加IDE表達能夠降低AD中Aβ蛋白積累[26]的結果是一致的。并且洗心湯可顯著降低小鼠腦組織中JAK2和STAT3磷酸化水平，抑制TNF-α、IL-6、IL-8炎癥因子的水平，有效降低小鼠大腦組織炎癥反應。這一結果與先前的報道抑制JAK2和STAT3磷酸化水平能夠緩解AD神經炎癥結果相一致[27]，并且本研究表明，抑制JAK2和STAT3磷酸化水平顯著上調了IDE蛋白的表達，進而降解Aβ蛋白。Aβ蛋白在AD發(fā)病過程中會誘導神經炎癥，對其降解能夠緩解細胞炎癥反應[28]。本研究表明洗心湯通過上調IDE蛋白降解Aβ來緩解AD小鼠大腦組織中的炎癥反應，以減輕AD癥狀。另外，雖然安理申也能夠抑制TNF-α、IL-6、IL-8炎癥因子表達，緩解小鼠大腦組織炎癥，但是并沒有影響小鼠腦組織中JAK2和STAT3磷酸化水平和IDE mRNA和蛋白水平。這表明安理申對于AD的治療與洗心湯存在不同的途徑。

總之，本實驗研究表明洗心湯能夠通過抑制JAK2和STAT3磷酸化水平，促進IDE mRNA和蛋白表達，進而降解T2D-AD小鼠模型大腦組織中的Aβ肽緩解AD癥狀。這為洗心湯在AD治療機制的探索中提供了新思路，然而目前研究欠深入，對于IDE表達是直接被洗心湯影響，還是被JAK2和STAT3磷酸化影響，亦或其他通路所調控還需要進一步的探索。

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（本文編輯? 蘇? 維）