桃紅四物湯對(duì)兔軟骨損傷模型noggin蛋白表達(dá)的影響

李益亮　姚金龍　梁爽　孫紹裘

〔摘要〕 目的 觀察桃紅四物湯對(duì)兔膝關(guān)節(jié)軟骨損傷模型noggin蛋白表達(dá)的影響，探討桃紅四物湯對(duì)兔膝關(guān)節(jié)軟骨損傷修復(fù)的分子作用機(jī)制。方法 從40只新西蘭兔中隨機(jī)挑選10只為假手術(shù)組，其余新西蘭兔根據(jù)改良Hulth法進(jìn)行右膝關(guān)節(jié)軟骨損傷造模后，隨機(jī)分為模型組、桃紅四物湯組、氨基葡萄糖組，每組10只。假手術(shù)組做同樣切口切至軟骨面，但不予以造模而直接縫合。術(shù)后各組分別以等量蒸餾水、桃紅四物湯、氨基葡萄糖進(jìn)行灌胃。干預(yù)4、6周后，每組隨機(jī)抽取5只新西蘭兔，麻醉后進(jìn)行腹主動(dòng)脈采血，并循原手術(shù)切口暴露軟骨，大體觀察后截取包含股骨下端在內(nèi)的軟骨關(guān)節(jié)面，采用ELISA法檢測(cè)noggin蛋白表達(dá)量;Western blot檢測(cè)軟骨組織中noggin的蛋白表達(dá)水平，并進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果 干預(yù)4、6周后，桃紅四物湯組noggin蛋白的表達(dá)均低于模型組，高于假手術(shù)組（P<0.05）;與氨基葡萄糖組比較，桃紅四物湯組noggin蛋白的表達(dá)更低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。干預(yù)6周后，模型組、桃紅四物湯組、氨基葡萄糖組關(guān)節(jié)面均不平整，但桃紅四物湯組、氨基葡萄糖組軟骨修復(fù)情況優(yōu)于模型組。結(jié)論 桃紅四物湯能抑制noggin蛋白的表達(dá)，促進(jìn)膝關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)，且抑制noggin蛋白表達(dá)的效果較氨基葡萄糖更優(yōu)。

〔關(guān)鍵詞〕 軟骨損傷修復(fù);桃紅四物湯;氨基葡萄糖;noggin蛋白;新西蘭兔

〔中圖分類號(hào)〕R274.9? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ? 〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2022.05.004

Effect of Taohong Siwu Decoction on noggin protein expression in rabbit cartilage injury model： Study on the academic thoughts and clinical experience of famous orthopaedic teacher Sun Dawu （4）

LI Yiliang YAO Jinlong LIANG Shuang SUN Shaoqiu

（1. The Second Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410005， China;

2. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China）

〔Abstract〕 Objective To observe the effect of Taohong Siwu Decoction on the expression of noggin protein in a rabbit knee cartilage injury model， and to explore the molecular mechanism of Taohong Siwu Decoction on the repair of knee cartilage injury in rabbits. Methods 10 New Zealand rabbits were randomly selected from 40 New Zealand rabbits as the sham operation group. The remaining New Zealand rabbits were randomly divided into model group， Taohong Siwu Decoction group and glucosamine group， with 10 rabbits in each group， after the right knee articular cartilage injury model was established according to the modified Hulth method. In the sham operation group， the same incision was made to cut to the cartilage surface， but it was directly sutured without modeling. After operation， each group was given the same amount of distilled water， Taohong Siwu Decoction and glucosamine by gavage respectively. After 4 and 6 weeks of intervention， 5 New Zealand rabbits were randomly selected from each group. After anesthesia， abdominal aortic blood was collected， and the cartilage was exposed through the original surgical incision. After gross observation， the cartilage articular surface including the lower end of the femur was cut， ELISA was used to detect noggin protein expression; Western blot was used to detect noggin protein expression in cartilage tissue， and statistical analysis of the data was performed. Results After 4 and 6 weeks of intervention， the expression of noggin protein in the Taohong Siwu Decoction group was lower than that in the model group and higher than that in the sham operation group （P<0.05）. Compared with the glucosamine group， the expression of noggin protein in the Taohong Siwu Decoction group was lower， the difference was statistically significant （P<0.05）. After 6 weeks of intervention， the articular surfaces of the model group， Taohong Siwu Decoction group and glucosamine group were all uneven， but the cartilage repair in the Taohong Siwu Decoction group and the glucosamine group was better than that in the model group. Conclusion Taohong Siwu Decoction can inhibit the expression of noggin protein and promote the repair of knee articular cartilage， and the effect of inhibiting the expression of noggin protein is better than that of glucosamine.

〔Keywords〕 cartilage damage repair; Taohong Siwu Decoction; glucosamine; noggin protein; New Zealand rabbit

外傷、疾病、遺傳等都能導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨的損傷，且涉及各個(gè)年齡段，病程長(zhǎng)[1]。膝關(guān)節(jié)軟骨損傷晚期往往會(huì)導(dǎo)致患者退行性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生，造成患者行走困難，甚至出現(xiàn)夜間靜息痛，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。由于膝關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)精密復(fù)雜，周圍局部血運(yùn)不佳，因此，缺損后往往出現(xiàn)預(yù)后不佳，甚至難以治療的情況。目前，膝關(guān)節(jié)軟骨損傷多以手術(shù)治療為主，但是手術(shù)治療創(chuàng)傷大、費(fèi)用昂貴，并且容易出現(xiàn)傷口感染、內(nèi)固定松動(dòng)等并發(fā)癥[2]。中醫(yī)學(xué)治療骨病歷史悠久，其優(yōu)勢(shì)在于無(wú)創(chuàng)、不良反應(yīng)少、多靶點(diǎn)綜合治療等[3-4]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，軟骨損傷是由于局部外傷或某種原因?qū)е碌酿鲎璨煌?，而引起?jīng)脈、氣血不暢，最終導(dǎo)致局部軟骨營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)缺失而造成軟骨損傷和愈合困難，從而引起一系列病變[5]。桃紅四物湯是國(guó)家級(jí)名中醫(yī)孫達(dá)武治療膝關(guān)節(jié)軟骨損傷的常用方劑，為治療氣滯血瘀型軟骨損傷的經(jīng)典方劑，具有補(bǔ)血活血、化瘀生新的功效[6]。多項(xiàng)研究表明，桃紅四物湯的活性成分，如阿魏酸、山柰酚、槲皮素、丹皮酚和咖啡酸，通過(guò)作用TNF、IL-17、MAPK、VEGF等信號(hào)通路，能夠有效地促進(jìn)軟骨修復(fù)[7-8]。noggin信號(hào)通路與軟骨修復(fù)密切相關(guān)[9]，本研究采用桃紅四物湯干預(yù)新西蘭兔膝關(guān)節(jié)軟骨損傷模型，運(yùn)用現(xiàn)代分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)，探討桃紅四物湯對(duì)noggin信號(hào)通路中基因蛋白表達(dá)的影響，以期闡明桃紅四物湯治療膝關(guān)節(jié)軟骨損傷的分子機(jī)制，為中醫(yī)藥治療膝關(guān)節(jié)軟骨損傷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1? 動(dòng)物與分組

選取40只新西蘭兔，SPF級(jí)、10月齡、雌雄各半，體質(zhì)量（2.5±0.5） kg，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心統(tǒng)一購(gòu)買，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證：SCXK（湘）2020-0005，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審批號(hào)：LL2020061001。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，將40只新西蘭兔隨機(jī)挑選10只為假手術(shù)組，其余新西蘭兔進(jìn)行右膝關(guān)節(jié)軟骨損傷造模后，隨機(jī)分為模型組、桃紅四物湯組、氨基葡萄糖組，每組10只。

1.2? 藥物與試劑

桃紅四物湯藥物與劑量參照《醫(yī)宗金鑒》[10]：桃仁20 g，川芎10 g，當(dāng)歸20 g，紅花10 g，赤芍20 g，生地黃20 g。中藥材由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院購(gòu)入并代煎，制成4 g/mL湯劑。桃紅四物湯灌胃劑量根據(jù)人與動(dòng)物體表面積換算公式，予以4.7 g/kg灌胃。氨基葡萄糖：選用鹽酸氨基葡萄糖片（江蘇正大清江制藥有限公司，0.75 g×30片，批號(hào)：202046852）。

1.3? 主要儀器

實(shí)驗(yàn)儀器搖床（江蘇其林貝爾有限公司，型號(hào)：TS-1）;電泳儀（型號(hào)：DYY-6C）、電泳槽（型號(hào)：DYCZ-24DN）、轉(zhuǎn)膜儀（型號(hào)：DYCZ-40D）均購(gòu)于北京六一生物科技有限公司;磁力攪拌器（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司，型號(hào)：JB-13）;電子天平（美國(guó)雙杰有限公司，型號(hào)：JJ224BC）;生物樣品均質(zhì)儀（杭州奧盛儀器有限公司，型號(hào)：BioPrep-24）;臺(tái)式冷凍離心機(jī)（湖南湘儀有限公司，型號(hào)：H1650R）;旋渦混合器（江蘇其林貝爾有限公司，型號(hào)：GL-88B）。

1.4? 造模

新西蘭兔禁食、禁水6 h后，備好手術(shù)器械，做好術(shù)前準(zhǔn)備。每只新西蘭兔稱重后，抽取1%戊巴比妥鈉0.02 mL/100 g對(duì)其進(jìn)行腹腔麻醉。麻醉滿意后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將新西蘭兔置于仰臥位，固定牢靠，充分顯露術(shù)野。備皮、消毒后，造模組（桃紅四物湯組、氨基葡萄糖組、模型組）采用改良Hulth法[11]從膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)，以髕骨內(nèi)側(cè)緣為切口切開(kāi)膝關(guān)節(jié)，依次切開(kāi)皮膚、分離皮下筋膜，切除內(nèi)側(cè)半月板，并且離斷前交叉韌帶，暴露股骨內(nèi)側(cè)髁、關(guān)節(jié)腔、關(guān)節(jié)軟骨。部分軟骨損傷用刀片刮蹭軟骨表面，以軟骨表面粗糙，出現(xiàn)顆粒樣質(zhì)感為造模成功。全層軟骨損傷以4 mm鉆頭在股骨內(nèi)側(cè)髁鉆出一個(gè)深3.0～4.0 mm的創(chuàng)口，可隱約見(jiàn)松質(zhì)骨，即為造模成功，清洗并逐層縫合傷口。假手術(shù)組以相同的手術(shù)入路進(jìn)入關(guān)節(jié)腔，但是不進(jìn)行造模。術(shù)畢，用過(guò)氧化氫溶液、生理鹽水、聚維酮碘交替沖洗關(guān)節(jié)腔，對(duì)關(guān)節(jié)囊、皮下筋膜組織嚴(yán)密縫合，最后縫合皮膚，術(shù)后連續(xù)3 d使用青霉素抗感染治療。

1.5? 干預(yù)方法

造模1周后，根據(jù)人與兔等效劑量換算公式[12]，桃紅四物湯組每日予以4.7 g/kg灌胃，氨基葡萄糖組每日予以70 mg/kg灌胃。稱取體質(zhì)量的相應(yīng)劑量，均予以蒸餾水稀釋配制成10 mL后進(jìn)行灌胃。模型組、假手術(shù)組均予以等劑量的蒸餾水進(jìn)行灌胃。1次/d，連續(xù)給藥4周后，各組隨機(jī)選取5只新西蘭兔進(jìn)行實(shí)驗(yàn)取材，剩余新西蘭兔連續(xù)灌胃6周后，進(jìn)行取材。

1.6? 取材

最后一次給藥后第2天，使用1%戊巴比妥鈉進(jìn)行腹腔麻醉，處死新西蘭兔。抽取兔腹主動(dòng)脈血，靜置離心后置于-20 ℃冰箱中保存;再于原手術(shù)入路切開(kāi)關(guān)節(jié)囊，暴露股骨下端軟骨，大體上觀察軟骨缺損以及修復(fù)狀況以后，切取股骨下端軟骨標(biāo)本，置于4%多聚甲醛中固定。

1.7? 指標(biāo)檢測(cè)

1.7.1? ELISA法檢測(cè)軟骨組織中noggin蛋白表達(dá)量? 參照ELISA說(shuō)明書(shū)，先設(shè)置各個(gè)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50 μL，并且設(shè)置空白孔和待測(cè)品孔。在待測(cè)品孔中加入40 μL稀釋液，再加入10 μL待測(cè)品（5倍稀釋濃度）。經(jīng)加酶、溫浴、配液、洗滌后加入顯色劑A 50 μL、顯色劑B 50 μL，搖勻，避光顯色15 min（溫度37 ℃），最后添加種植液，調(diào)零，測(cè)量光密度值。

1.7.2? Western blot檢測(cè)軟骨組織中noggin的蛋白表達(dá)水平? 對(duì)各組樣本進(jìn)行培養(yǎng)收集，收取蛋白。用PBS緩沖液沖洗組織，加入300 μL RIPA裂解液10 min，4 ℃環(huán)境下，離心半徑為10 cm，12 000 r/min條件下離心15 min。按BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行操作，測(cè)量濃度，再按Western blot法制膠、電泳、轉(zhuǎn)膜，放入PBST中清洗1次過(guò)夜，次日室溫放置30 min。一抗（1∶500）、二抗（1∶5000）孵育、PBST清洗3次，每次10 min。顯色、曝光：用ECL化學(xué)發(fā)光液與膜孵育1 min，濾紙吸出液體后，在成像系統(tǒng)中拍照，檢測(cè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白表達(dá)水平。

1.7.3? 關(guān)節(jié)軟骨組織病理觀察? 關(guān)節(jié)軟骨標(biāo)本脫鈣后，將切片放置于恒溫箱（60 ℃）烤片1～2 h，之后二甲苯浸泡，再經(jīng)過(guò)順濃度的乙醇浸泡，蒸餾水沖洗，然后采用蘇木精染色，漂洗后，再利用伊紅染色。最后經(jīng)過(guò)順濃度梯度乙醇脫水、二甲苯浸泡、樹(shù)膠封片，顯微鏡觀察、拍照留樣。

1.8? 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 23.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。運(yùn)用Shapiro-wilk法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢測(cè)，運(yùn)用Levene法進(jìn)行方差檢測(cè)。計(jì)量資料以“x±s”表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1? 大體觀察

干預(yù)6周后，取材，對(duì)各組股骨下端的關(guān)節(jié)面進(jìn)行大體觀察。假手術(shù)組股骨下端關(guān)節(jié)面軟骨光滑平整，全層形態(tài)緊密，結(jié)構(gòu)正常。其余3組關(guān)節(jié)面均不平整，其中桃紅四物湯組與氨基葡萄糖組軟骨總體修復(fù)情況均明顯優(yōu)于模型組。

2.2? 各組兔軟骨損傷模型關(guān)節(jié)軟骨noggin蛋白ELISA檢測(cè)結(jié)果

干預(yù)4周、6周后，與假手術(shù)組比較，模型組noggin蛋白表達(dá)升高（P<0.05）;與模型組比較，桃紅四物湯組、氨基葡萄糖組noggin蛋白表達(dá)均降低（P<0.05）;與氨基葡萄糖組比較，桃紅四物湯組noggin蛋白表達(dá)低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。第4周與第6周同組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。詳見(jiàn)表1。

2.3? 各組兔軟骨損傷模型關(guān)節(jié)軟骨noggin蛋白Western blot檢測(cè)結(jié)果比較

干預(yù)4周、6周后，與假手術(shù)組比較，模型組noggin蛋白表達(dá)升高（P<0.05）;與模型組比較，桃紅四物湯組、氨基葡萄糖組noggin蛋白表達(dá)均降低（P<0.05）;與氨基葡萄糖組比較，桃紅四物湯組noggin蛋白表達(dá)低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。第4周與第6周同組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。詳見(jiàn)表2、圖1。

2.4? 關(guān)節(jié)軟骨組織HE染色病理觀察

模型組移行區(qū)軟骨細(xì)胞數(shù)量大量減少，雙重潮線;桃紅四物湯組關(guān)節(jié)軟骨表面區(qū)不平整，高低不平，軟骨基質(zhì)增生，膠原纖維增生，新生血管侵犯潮線;氨基葡萄糖組關(guān)節(jié)軟骨表面區(qū)不平整，高低不平，膠原纖維增生，輻射層軟骨細(xì)胞減少;假手術(shù)組表面區(qū)較平滑，全層組織正常，潮線明顯。詳見(jiàn)圖2。

3 討論

膝關(guān)節(jié)軟骨損傷是臨床上常見(jiàn)的疾病，常常由于外傷、遺傳、疾病等多種因素造成。疾病發(fā)展后期常常出現(xiàn)膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎，臨床上患者常有膝關(guān)節(jié)畸形、腫脹、行走障礙，甚至出現(xiàn)夜間的靜息疼痛等癥狀，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[13]。據(jù)流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)，全球大約有3億人患有膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis， KOA），女性發(fā)病率常常高于男性[14]。而我國(guó)55歲以上人群中，約60%的人具有KOA的影像學(xué)表現(xiàn)，65歲以上的人群中KOA的發(fā)病率達(dá)85%[15]。目前，治療膝關(guān)節(jié)軟骨損傷的方法有多種，包括手術(shù)治療、藥物治療、物理治療、肌內(nèi)效貼等，但是難以改變軟骨損傷后關(guān)節(jié)退變的發(fā)展進(jìn)程。而中醫(yī)學(xué)在相關(guān)領(lǐng)域具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[16-17]，具有無(wú)創(chuàng)、不良反應(yīng)少、多靶點(diǎn)綜合治療的特點(diǎn)。

膝關(guān)節(jié)軟骨損傷歸屬于中醫(yī)學(xué)“骨痹”的范疇。王清任有關(guān)于“痹有瘀血”的論點(diǎn)，他主張運(yùn)用活血化瘀法隨證治之?！夺t(yī)林改錯(cuò)·卷下》云：“總滋陰外受之邪歸于何處？總逐風(fēng)寒去濕熱，已凝之血，更不能活。如水遇風(fēng)寒，凝結(jié)成冰，冰成，風(fēng)寒已散，明此義，治痹證何難?！闭f(shuō)明該病是由多種因素而引起的經(jīng)絡(luò)阻滯、氣血不暢、筋脈攣急，病程久則損及各個(gè)臟腑，因此，瘀血是骨痹形成的重要病機(jī)。桃紅四物湯是活血化瘀的名方，方名始于吳謙所著的《醫(yī)宗金鑒·婦科心法要訣》，常用于血虛證或血瘀證，最開(kāi)始用于婦科血證，為婦科病的首選方[18-19]。孫達(dá)武教授依據(jù)“有是證用是方”的理論，臨床上靈活化裁運(yùn)用桃紅四物湯，有補(bǔ)血養(yǎng)血、活血化瘀之效，可以有效治療膝關(guān)節(jié)軟骨損傷。

骨形態(tài)發(fā)生蛋白質(zhì)（bone morphogenetic protein， BMP）是非常重要的骨蛋白。研究發(fā)現(xiàn)，BMP信號(hào)通路能與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells， MSCs）結(jié)合，MSCs沒(méi)有參加分化但卻具有成骨性能，從而使得MSCs發(fā)生化生反應(yīng)、趨向、聚集、分化，最終變成軟骨或骨[20]。noggin是一種分泌型同二聚體糖蛋白，已被證明通過(guò)結(jié)合BMP-2、BMP-4、BMP-7、BMP-5、BMP-6、生長(zhǎng)和分化因子-5、生長(zhǎng)和分化因子-6[21-22]來(lái)抑制BMP信號(hào)傳導(dǎo)。當(dāng)體內(nèi)noggin高表達(dá)時(shí)，會(huì)與BMP特異性結(jié)合，從而使BMP和受體結(jié)合受阻，降低活性，抑制成骨，noggin可以抑制成骨細(xì)胞分化及其功能[23-24]，noggin與BMP蛋白最易產(chǎn)生反應(yīng)的拮抗劑，通過(guò)阻止骨BMP與受體結(jié)合，來(lái)降低骨形成率。本課題組前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，桃紅四物湯能抑制BMP-2蛋白表達(dá)，減少軟骨的炎癥反應(yīng)，從而加快軟骨愈合的過(guò)程[22]。

有文獻(xiàn)證明，氨基葡萄糖對(duì)于軟骨損傷具有一定的修復(fù)作用[25-26]，所以本課題組以氨基葡萄糖作為軟骨修復(fù)的陽(yáng)性對(duì)照藥，以桃紅四物湯作為干預(yù)用藥，以兔膝關(guān)節(jié)軟骨損傷模型作為研究對(duì)象，結(jié)果表明：干預(yù)4周、6周后，與假手術(shù)組比較，模型組noggin蛋白表達(dá)升高（P<0.05）;與模型組比較，桃紅四物湯組、氨基葡萄糖組noggin蛋白表達(dá)均降低（P<0.05）;與氨基葡萄糖組比較，桃紅四物湯組noggin蛋白表達(dá)低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。桃紅四物湯能抑制noggin蛋白的表達(dá)，從而有利于膝關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)，且抑制noggin蛋白表達(dá)的效果較氨基葡萄糖更優(yōu)。該實(shí)驗(yàn)是關(guān)于桃紅四物湯促進(jìn)軟骨新生、防治KOA的基礎(chǔ)性研究，對(duì)桃紅四物湯化瘀與生新的作用以及中藥機(jī)制等方面的探討均具有重要意義，但是由于本實(shí)驗(yàn)組別數(shù)量設(shè)置有限，對(duì)于桃紅四物湯促進(jìn)軟骨新生的最佳實(shí)驗(yàn)劑量，還需要進(jìn)一步設(shè)置不同濃度的桃紅四物湯組別進(jìn)行干預(yù)，有待進(jìn)一步探討。

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（未完待續(xù)）

（本文編輯? 賀慧娥）