李喬喬，王宇晴，劉 蕊，劉乃新，邳 植，吳則東

（1黑龍江大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150080；2黑龍江省普通高校甜菜遺傳育種重點實驗室/黑龍江大學(xué)，哈爾濱 150080；3黑龍江種業(yè)技術(shù)服務(wù)中心，哈爾濱 150008）

0 引言

甜菜為莧科、甜菜屬，二年生草本植物，原產(chǎn)于歐洲西部和南部沿海。1906年，糖用甜菜引入中國，主要在新疆、黑龍江以及內(nèi)蒙古等地種植。甜菜是除甘蔗外的主要糖源，其產(chǎn)糖量約占世界總糖量的25%[1]。除生產(chǎn)蔗糖外，甜菜及其副產(chǎn)品也具有廣泛的開發(fā)利用前景。中國甜菜作為重要的糖料作物，其育種工作仍遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于德國、美國、法國以及荷蘭等國。在中國甜菜產(chǎn)業(yè)中，用于機(jī)械化精量播種的遺傳單粒種子基本依靠進(jìn)口，對外依存度在95%以上。為了促進(jìn)甜菜分子生物學(xué)的發(fā)展，可以利用分子標(biāo)記技術(shù)，尋找合適的引物，這對甜菜遺傳圖譜和指紋圖譜的構(gòu)建、遺傳多樣性的鑒定等分子標(biāo)記輔助育種具有重要意義[2]。缺乏理想的分子標(biāo)記工具和基因組資源是阻礙甜菜遺傳研究和分子育種發(fā)展的重要因素。

近年來，基因組學(xué)不斷發(fā)展，利用分子標(biāo)記分析種質(zhì)資源遺傳多樣性和親緣關(guān)系已經(jīng)在多種重要作物上廣泛開展[3]。另外也有多種分子標(biāo)記，如AFLP[4]、SRAP[5]、RAPD[6]、SSR[7]、ISSR[8]、SNP[9]以及 SCoT[10]等應(yīng)用于遺傳多樣性分析，在眾多類型的分子標(biāo)記中，SSR因其相對豐富、重復(fù)性好、多態(tài)性高、共顯性遺傳模式和在基因組中的隨機(jī)分布而成為應(yīng)用最廣泛的作為遺傳圖譜、基因作圖和標(biāo)記輔助選擇的工具。SSR標(biāo)記是近年來發(fā)展起來的一種以特異引物PCR為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)，也稱為微衛(wèi)星DNA(Microsatellite DNA)，是一類由幾個核苷酸（一般為1～6個）為重復(fù)單位組成的長達(dá)幾十個核苷酸的串聯(lián)重復(fù)序列。每個SSR兩側(cè)的序列一般是相對保守的單拷貝序列，因此可以通過SSR兩端序列設(shè)計特異引物開發(fā)分子標(biāo)記引物。開發(fā)并篩選一系列穩(wěn)定性好，多態(tài)性高的通用SSR核心引物，對于鑒定甜菜種質(zhì)資源、分析遺傳多樣性、檢測品種純度及真實性、構(gòu)建品種DNA指紋數(shù)據(jù)庫等均具有重要的價值[11]。

李艷等[12]利用4份不同的辣椒資源對152對SSR引物進(jìn)行篩選，最終選出14對條帶清晰、穩(wěn)定性好的引物，并利用這14對引物將26份辣椒資源按照遺傳多樣性分為7類；此前也有學(xué)者曾經(jīng)對甜菜的SSR引物進(jìn)行篩選，吳則東等[13]利用16個甜菜品種從200對SSR引物中進(jìn)行篩選，從中篩選出24對核心引物，并將16個甜菜品種分為3類；趙尚敏等[14]從91對SSR引物中僅篩選出7對條帶清晰的引物。此次基于前人研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步利用甜菜基因組數(shù)據(jù)庫，篩選多態(tài)性高的SSR引物，為后期甜菜的遺傳多樣性和指紋圖譜建立等分析提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料 實驗所用的材料為4個甜菜種質(zhì)資源以及4個甜菜品種，引物在群體間的多態(tài)性驗證選取M206的50份不同的DNA進(jìn)行。材料名稱、編號及來源見表1。

表1 實驗材料及來源

1.1.2 主要試劑及儀器 純凈水、DNA模板、瓊脂糖粉、10×TBE、40% PA、AP、TEMED、0.5×TBE、紅色熒光核酸染料、2×Rapid Tap Master Mix。主要儀器有穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（DYY-8B型）、DYCZ-30C型電泳槽以及eppendorf PCR儀。

1.1.3 引物合成與稀釋 早期的SSR引物主要是從基因組庫和微衛(wèi)星庫中開發(fā)出來的，開發(fā)成本高，時間也長。隨著高通量測序技術(shù)的不斷發(fā)展，可以一次測定數(shù)十萬至數(shù)百萬個DNA分子的序列[11]。本次SSR引物的開發(fā)大部分基于甜菜全基因組序列，使用perl腳本Micro SAtellite(MISA)在甜菜基因組中檢索SSR[15]，并將堿基長度定義為默認(rèn)核苷酸長的基準(zhǔn)。識別標(biāo)準(zhǔn)為：單核苷酸重復(fù)次數(shù)≥8次；二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸，重復(fù)序列的數(shù)目都大于5[16]。使用primer3_core程序，根據(jù)識別的SSR的側(cè)翼序列來設(shè)計引物對[17-18]。引物的設(shè)計參數(shù)為：引物長度為18～27個核苷酸，退火溫度為55～65℃，GC含量為30%～70%，預(yù)測PCR產(chǎn)物長度為100～500 bp。然后再與之前篩過的引物進(jìn)行比較分析，利用電子PCR進(jìn)行擴(kuò)增，最終確定了使用的引物。本次實驗共計設(shè)計247對引物。引物由上海生工生物工程有限公司進(jìn)行合成。

引物合成后，將干粉狀的引物按照合成單中參數(shù)進(jìn)行溶解稀釋，取相同摩爾數(shù)的上下游引物混合在一起，作好標(biāo)記后，均置于-20℃保存以備使用[19]。

1.2 實驗方法

1.2.1 DNA模板制備 供試材料采用CTAB法提取DNA，并稀釋到10 ng/μL置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR反應(yīng)的體系和程序 PCR擴(kuò)增反應(yīng)在PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行，反應(yīng)總體積為5 μL，其中，PCR-Mix 2.5 μL、10 μmol/L的SSR引物共0.4 μL，DNA模板1 μL，最后用純凈水補至5 μL。

擴(kuò)增程序為94℃模板DNA預(yù)變性3 min，1個循環(huán)；95℃模板DNA變性15 s，固定退火溫度58℃引物與模板靶位點結(jié)合15 s，72℃引物沿模板延伸30 s，共32個循環(huán)；最后72℃延伸5 min；4℃保存。還有一種采用Touch down程序，退火溫度65℃一直降到56℃，每度使引物與模板靶位點結(jié)合15 s，72℃引物沿模板延伸30 s，每降1℃2個循環(huán)，最后降至55℃設(shè)20個循環(huán)。由于引物只有在最佳的退火溫度下才能表現(xiàn)出真實的擴(kuò)增條帶，故針對不同的引物使用了不同的PCR退火溫度。具體引物所用退火溫度見表2。

1.2.3 PCR產(chǎn)物檢測 利用8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進(jìn)行分離[20]，電泳結(jié)束后，將凝膠放入核酸染料中，均勻晃動3～5 min，然后將凝膠取出放入凝膠成像儀查看，拍照保存以便進(jìn)行后續(xù)數(shù)據(jù)分析。

1.3 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)SSR擴(kuò)增產(chǎn)物在電泳凝膠上的相對位置，確定不同的等位基因，按照分子量從大到小的順序進(jìn)行記錄，在同一位置上，有帶記為“1”，無帶記為“0”，根據(jù)記錄結(jié)果統(tǒng)計多態(tài)性條帶數(shù)，并計算引物多態(tài)性信息量(PIC)，其計算方法見公式(1)。

其中Pi為第i個等位基因出現(xiàn)的頻率。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR引物篩選及擴(kuò)增結(jié)果

利用8份供試材料對247對SSR引物進(jìn)行擴(kuò)增，最終從247對引物中篩選出27對具有多態(tài)性的引物。這27對SSR引物在8份材料中共擴(kuò)增出103個條帶，其中多態(tài)性條帶95條，多態(tài)性比率為90.43%，單個引物擴(kuò)增總條帶最多的為6條，最少的為2條，單個引物擴(kuò)增有多態(tài)性的條帶最多6條，最少2條。多態(tài)性信息量(PIC)范圍為0.549～0.983，平均每一對引物的PIC值為0.841。其中W12的PIC值最高為0.983。說明篩選出的引物多態(tài)性較高。篩選的引物名稱、多態(tài)性條帶數(shù)、擴(kuò)增總條帶數(shù)、多態(tài)性百分比以及所在的染色體以及多態(tài)性信息量(PIC)見表2。

表2 篩選出的甜菜SSR引物及多態(tài)性信息

續(xù)表2

2.2 引物多態(tài)性分析驗證

在27對引物中挑選一對擴(kuò)增條帶清晰，多態(tài)性高的引物L(fēng)48在M206甜菜群體的50份DNA中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以驗證SSR引物在群體間存在穩(wěn)定的多態(tài)性。本研究中選取M206甜菜群體單株對L48引物進(jìn)行驗證，L48在50份DNA中共擴(kuò)增出3條帶，均為多態(tài)性帶，多態(tài)性百分率為100%?？梢奡SR引物在甜菜群體間存在著穩(wěn)定的多態(tài)性，為將來SSR引物在甜菜分子生物學(xué)上的應(yīng)用打下良好的基礎(chǔ)。圖1為引物L(fēng)48對M206群體的50個甜菜DNA的擴(kuò)增圖。

圖1 L48對M206的50份甜菜DNA的PCR擴(kuò)增圖

3 結(jié)論與討論

由于中國并不是甜菜的起源國，目前所擁有的甜菜種質(zhì)資源大部分都來自國外，而且嚴(yán)重缺乏野生資源以及單胚資源，現(xiàn)存的這些種質(zhì)資源之間的親緣關(guān)系較近。開展有針對性的資源收集、評價和開發(fā)利用顯得十分必要，而利用分子標(biāo)記技術(shù)開展分子水平研究具有重要意義[21]。利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行甜菜指紋圖譜構(gòu)建及遺傳多樣性分析，至關(guān)重要的是要篩選一套優(yōu)良的SSR引物[22]。

本研究從大量引物中僅篩選出少量的具有多態(tài)性的引物，與大多引物篩選的試驗結(jié)果相似，說明甜菜核心SSR引物篩選依舊困難。但本文基于甜菜全基因組序列設(shè)計引物，同時先利用電子PCR進(jìn)行分析，保證甜菜的每條染色體上都有核心引物可供后續(xù)遺傳分析。為了保證篩選出的SSR引物具有高效穩(wěn)定的多態(tài)性，就要充分考慮具有代表性的遺傳物質(zhì)來源。本實驗采用的是來自國外與國內(nèi)各4份甜菜材料，最終得到的27對優(yōu)秀的SSR引物，但少量的篩選材料并不足以代表一個物種的基因多樣性[23]，因此最終優(yōu)秀的SSR引物的確定，還需要盡量多的甜菜品種進(jìn)行驗證，才能保證最終的引物篩選能夠?qū)μ鸩朔N質(zhì)資源進(jìn)行準(zhǔn)確的遺傳多樣性分析。本研究豐富了中國甜菜種質(zhì)資源SSR分子標(biāo)記的研究，為中國甜菜種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析及甜菜品種鑒別提供了新的分子標(biāo)記工具，但本研究所獲得的多態(tài)性引物數(shù)目較有限，有待進(jìn)一步挖掘與探討。

本研究通過8份甜菜材料對247對甜菜SSR引物進(jìn)行篩選，從中篩選出27對可以用于甜菜分子標(biāo)記利用的多態(tài)性引物。這27對引物共擴(kuò)增出條帶103條，其中多態(tài)性條帶95條，多態(tài)性比率為90.43%，多態(tài)性信息量(PIC)范圍為0.549～0.983，平均每一對引物的PIC值為0.841。為了驗證引物在群體間的多態(tài)性，選取M206的50份不同的DNA對引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增總條帶數(shù)為3，均為多態(tài)性帶，多態(tài)性百分率為100%。本研究開發(fā)的全基因組SSR標(biāo)記將為甜菜分子標(biāo)記分析、連鎖圖譜構(gòu)建、QTL定位和分子育種提供有效的分子標(biāo)記工具。