蛋白種類對大豆皂苷-蛋白W/O/W型乳液穩(wěn)定性的影響

許楊楊，朱力杰,*，劉秀英，李 赫，劉 軍，劉 賀

（1.渤海大學食品科學與工程學院，生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯(lián)合工程研究中心，遼寧 錦州 121013；2.北京工商大學 國家大豆加工產(chǎn)業(yè)技術創(chuàng)新中心，北京 100048；3.山東禹王生態(tài)食業(yè)有限公司，山東 德州 251200）

多重乳液由Seifriz于1925年首次提出，被稱為“乳液中的乳液”，即乳液以細小液滴的形式存在于另一不相溶的液滴之中。常見的多重乳液主要分為兩類：水包油包水（W/O/W）、油包水包油（O/W/O）。W/O/W乳液是目前常見的一種乳液體系，其分散相本身為油包水（W/O）乳液，內(nèi)水相W和外水相W因具有相同的極性易相溶。兩步乳化法是制備多重乳液最普遍的方法。與常見的水包油（O/W）乳液相比，W/O/W乳液因具有輸送和控釋生物活性成分、掩蓋不良氣味、降低脂肪含量等優(yōu)點被廣泛地應用于食品、藥品、化妝品等領域。

大豆中的皂苷與蛋白質(zhì)是大豆油加工的兩類主要副產(chǎn)物，其在脫脂餅粕中含量豐富。大豆皂苷（soyasaponin，Ssa）是由三萜苷元和低聚糖鏈組成的五環(huán)三萜類齊墩果烷型皂苷，含有苦澀味，其在大豆中的含量為0.6%～6.2%，具有皂苷一般性質(zhì)。有研究表明，Ssa除具有抗氧化、降低血糖、抗炎、抗病毒、增強免疫調(diào)節(jié)等生理功能外，還具有作為乳化劑、起泡劑的潛能。大豆蛋白是一種多組分混合蛋白，主要由-伴大豆球蛋白（-conglycinin，7S）、大豆球蛋白（glycinin，11S）組成，二者含量占大豆總蛋白含量的80%左右，而大豆分離蛋白（soy protein isolate，SPI）是目前用量最大、應用最為廣泛的大豆蛋白產(chǎn)品。大豆蛋白含有大量的親水性和疏水性基團，可吸附到油水或者氣-水界面上，降低其表面張力，形成具有粘彈性的蛋白界面膜，阻止其乳化狀態(tài)被破壞，表現(xiàn)出良好的乳化性。目前關于SPI、11S、7S三種蛋白乳化性的研究較為廣泛。Liu Fu等將SPI進行95 ℃、15 min加熱處理，發(fā)現(xiàn)SPI能暴露出更多的疏水基團，形成的乳液更加的穩(wěn)定。Keeratiurai等研究了7S、11S的乳化行為，發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)可在油水界面上形成30～40 nm的膜，7S比11S表現(xiàn)出更高的乳化活性。陳碩等的研究結(jié)果表明11S在油水界面擴散、展開和重排速率大于7S，調(diào)整二者在大豆蛋白中的含量可以改變蛋白在乳液界面上的吸附行為。

綜上所述，以SPI、11S、7S為主要研究對象，探究蛋白質(zhì)種類對W/O/W乳液穩(wěn)定性的影響，表征乳液的整體穩(wěn)定性、粒徑特性、電位特性、微觀結(jié)構，并對其流變學特性和長期穩(wěn)定性的變化情況進行分析，以期達到遮蔽皂苷苦味、運輸生物活性的目的，旨在為皂苷-蛋白穩(wěn)定W/O/W乳液提供一定的理論基礎，提高大豆副產(chǎn)物的應用范圍和利用率。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Ssa（＞80%） 西安通澤生物科技有限公司；聚甘油蓖麻醇酯（polyglycerol polyricinoleate，PGPR）山東優(yōu)索化工科技有限公司；低溫脫脂豆粕、SPI（蛋白＞90%） 山東禹王生態(tài)食業(yè)有限公司；尼羅紅、proclin 950、Florisil分子篩（60～100 目） 美國Sigma公司；長壽花玉米油 市購；其他化學藥品均為分析純，實驗用水為去離子水。

1.2 儀器與設備

HH-2J數(shù)顯恒溫磁力攪拌水浴鍋 常州雙瑞儀器制造有限公司；Biofuge Stratos高速冷凍離心機 美國Thermo公司；FJ200-SH高速分散均質(zhì)機 上海標本模型廠；FB-110S高壓均質(zhì)機 上海勵途機械設備工程有限公司；Turbiscan穩(wěn)定性分析儀 法國Formulaction公司；BT-9300激光粒度分析儀 丹東百特儀器有限公司；DiscoveryHR-1流變儀 美國TA公司；OCA-20視頻光學接觸角測量儀 德國Data-physics公司；FV-1000激光共聚焦顯微鏡 日本Olympus公司；Nano-ZS90電勢分析儀 英國馬爾文公司。

1.3 方法

1.3.1 7S、11S球蛋白的制備

參考Xu Jing等的方法，略有改動。將粉碎好的大豆脫脂豆粕與去離子水以1∶15的比例混合，攪拌豆粕至完全溶解，之后再加入2 mol/L的NaOH溶液，pH值調(diào)至8.5后在45 ℃低速攪拌1 h，過180 目尼龍網(wǎng)。將收集好的過濾液9 000×離心20 min，保留上清液。將亞硫酸氫鈉（0.98 g/L）加入上清液中進行攪拌至完全溶解，之后再加入2 mol/L HCl溶液，將其pH值調(diào)節(jié)至6.4。將上述溶液放入4 ℃的冰箱中過夜后6 500×離心20 min，取出底部沉淀即為11S組分。在離心后的上清液中加入0.25 mol/L NaCl溶液，其目的是調(diào)節(jié)溶液的離子濃度，之后再加入2 mol/L HCl溶液，pH值調(diào)至5。靜置1 h后，溶液4 ℃、9 000×離心30 min，保留上清液。將相同體積的冰水加入上清液中，再用2 mol/L HCl溶液調(diào)pH值至4.8，之后4 ℃、6 500×離心20 min，取出沉淀即為7S組分。經(jīng)計算可知11S、7S的提取率分別為15.51%、9.46%，蛋白質(zhì)量分數(shù)分別為93.9%、96.2%。

1.3.2 W/O/W乳液的制備

參考Zhu Qiaomei等的方法，略有改動。在去離子水中溶解1%（/）Ssa制備成為內(nèi)水相W；在玉米油中加入3%（/）PGPR，之后在50 ℃加熱攪拌30 min后制成油相O。將內(nèi)水相W、油相O二者以30∶70進行混合，先使用高速剪切機在18 000 r/min均質(zhì)4 min，隨即在60 MPa高壓均質(zhì)得到W/O乳液。在去離子水中溶解1%（/）SPI、11S、7S制備成為外水相W，將外水相W、初乳W/O以50∶50進行混合，先使用高速剪切機7 000 r/min均質(zhì)2 min，隨后在10 MPa下高壓均質(zhì)獲得W/O/W乳液。在制備好的W/O/W乳液中加入0.05% proclin。

1.3.3 W/O/W乳液整體穩(wěn)定性測定

Turbiscan 穩(wěn)定分析儀能在不破壞乳液的情況下，通過測量脈沖近紅外光的透散射光和背散射光（backscattering，BS）表征W/O乳液的穩(wěn)定性。該儀器對樣品進行靜置垂直掃描，透過率探測器接收相對于光源180°通過色散的光，背散射探測器接收以45°向后散射的光，經(jīng)多次掃描獲得能夠?qū)θ橐盒跄?、上浮等狀態(tài)進行分析的掃描圖譜。采用BS表征乳液的穩(wěn)定性的原因是本實驗制備的W/O乳液不透光。實驗時在機器專用測試瓶中加入20 mL的W/O乳液，之后將其放入多重光機器中開始進行掃描模式，每30 min掃描一次，總共掃描12 h。乳液經(jīng)過不同儲藏時間后再將其放入儀器中進行連續(xù)掃描1 h，以探究乳液的長期穩(wěn)定性。

BS由式（1）得到：

*由式（2）得到：

式中：為粒子的體積分數(shù)/%；為粒子平均直徑/μm；、為米氏理論的光學參數(shù)。

通過樣品的穩(wěn)定性動力指數(shù)（turbiscan stability index，TSI）評價乳液穩(wěn)定性，TSI曲線斜率越低、TSI值越低，乳液越穩(wěn)定。TSI由式（3）得到：

式中：x為每次背射光強的平均值；為x的平均值；為掃描次數(shù)。

1.3.4 W/O/W乳液粒徑的測定

參考Ma Lulu等的方法，略有改動。采用激光粒度分布儀測定W/O/W乳液的粒徑及寬度值。儀器參數(shù)設定為：顆粒折射率1.470，吸收指數(shù)0.002，水為分散劑，折射率1.330，測定溫度25 ℃。乳液粒徑用體積平均直徑（=∑nd/∑nd）和表面積平均直徑（=∑nd/∑nd）表示，其中n、d分別表示乳液液滴的數(shù)量和直徑。乳液液滴尺寸分布的相對寬度用寬度值（Span=（－）/）表示，其中，、、分別為累積分布百分數(shù)達到90%、50%和10%處的乳液液滴的體積直徑。每個樣品至少重復測定3 次。

1.3.5 W/O/W乳液流變的測定

采用TA流變儀測定W/O乳液的流變學特性。實驗參數(shù)設定為：溫度25 ℃，錐板2°、40 mm，間隙0.1 mm。穩(wěn)態(tài)掃描模式：剪切速率0.1～100 s；振蕩頻率模式：在線性彈性內(nèi)應變0.5%，頻率0.1～10 Hz。每個樣品至少測定3 次平行。采用冪律模型對數(shù)據(jù)進行擬合，由式（4）得到：

式中：為剪切應力/Pa；為稠度系數(shù)/（Pa·s）；為剪切速率/s；為冪律指數(shù)。

1.3.6 W/O/W乳液激光共聚焦的測定

參考Velderrain-Rodríguez等的方法略加改動。取新鮮制備的W/O/W乳液1 mL，加入50 μL 0.1 g/100 mL尼羅紅（丙酮溶解）溶液進行染色。吸取成功染色的溶液（10 μL）滴于載玻片上，蓋上蓋玻片，用指甲油封片，之后將其放于激光共聚焦×63油鏡進行觀察。熒光樣品的激發(fā)波長為488 nm的氬/氪離子，掃描密度為512×512，采用LASAF Lite軟件對圖像進行處理。

1.3.7 W/O/W乳液電位的測定

采用電勢分析儀測定W/O/W乳液的電位，將W/O/W乳液樣品稀釋30 倍，測定溫度為25 ℃，測定過程中要緩慢加入樣品防止產(chǎn)生氣泡。每個樣品至少測定3 次。

1.3.8 動態(tài)界面張力測定

去除食用油中少量表面活性劑和雜質(zhì)是玉米油進行純化的目的。具體方法為：玉米油與Florisil分子篩按照100∶4（mL/g）的比例混合均勻，采用磁力攪拌器攪拌2 h，之后10 000 r/min離心20 min除去沉淀。離心處理3 次，至其與去離子水界面張力30 min內(nèi)保持恒定值為止。經(jīng)測試，純化后的玉米油密度為0.916 4 g/cm，油水界面張力為（26.16±0.13）mN/m，測試溫度為25 ℃。

采用滴形張力法測定了蛋白質(zhì)在油水界面吸附過程中界面張力（）值的變化情況。實驗過程中應注意避免外界環(huán)境振蕩對測試結(jié)果產(chǎn)生影響。實驗時將蛋白質(zhì)水溶液加入注射針（針的外徑為1.83 mm），平衡30 min使其溫度達到25 ℃后向盛有純化玉米油（含0.01% PGPR）的光學玻璃比色杯中注射10 μL的樣品，測定時間為150 min。液滴外形圖像用CCD攝像系統(tǒng)采集，利用系統(tǒng)SCA20軟件進行分析。根據(jù)Young-Laplace方程計算在吸附時間（）內(nèi)蛋白質(zhì)溶液的界面張力（）變化情況。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 W/O/W乳液的整體穩(wěn)定性分析

TSI值可以用來衡量乳液的穩(wěn)定性，一般來說TSI曲線斜率和數(shù)值越大表示乳液發(fā)生分離的速度越快，乳液穩(wěn)定性越低。結(jié)果表明，W/O/W乳液的TSI值隨著時間的延長呈現(xiàn)不斷增加的趨勢（圖1），說明在12 h內(nèi)乳液的穩(wěn)定性不斷下降。在放置12 h后，外水相添加SPI、11S、7S的W/O/W乳液，相應TSI值分別為2.12、3.13、3.38，此結(jié)果表明SPI構建的W/O/W乳液的穩(wěn)定性最好，7S乳液穩(wěn)定性最差。圖2是蛋白質(zhì)種類對W/O/W乳液整體穩(wěn)定性的影響。ΔBS的絕對值越小，乳液越穩(wěn)定。光譜圖的左側(cè)、中側(cè)、右側(cè)分別代表乳液瓶的底部、中部、頂部。從圖2可以看出，所有乳液底部的ΔBS隨時間呈現(xiàn)下降趨勢，頂部的ΔBS為上升趨勢，表明乳液出現(xiàn)了上浮現(xiàn)象。SPI乳液中間的ΔBS無明顯變化，表明乳液粒徑大小無明顯變化，12 h后頂部的ΔBS值增加至15%；11S、7S乳液中間的ΔBS有明顯變化，表明液滴遷移速度加快，粒徑大小增加，乳液發(fā)生絮凝或聚合現(xiàn)象，頂部的△BS值分別增加至30%、38%，這與圖1結(jié)果一致。

圖1 SPI、11S、7S對W/O/W乳液TSI值的影響（12 h）Fig.1 Effects of SPI,11S and 7S on the TSI value of W/O/W emulsion

圖2 SPI（A）、11S（B）、7S（C）（1%）制備W/O/W的整體穩(wěn)定性Fig.2 Overall stability of W/O/W emulsion prepared with SPI (A),11S (B) or 7S (C)

2.2 W/O/W乳液的粒徑、電位及微觀結(jié)構分析

粒徑是乳液生產(chǎn)工藝中最重要的參數(shù)，它影響乳液的外貌、質(zhì)地、貨架期、風味以及穩(wěn)定性。從表1可以看出，SPI、11S、7S制備的W/O/W乳液的粒徑集中在6 μm附近，且大小存在顯著性差異。從圖3可以看出，液滴中間存在黑色的“小圓圈”，其代表內(nèi)部小水滴，這與文獻的圖片一致，表明該體系成功地制備了W/O/W乳液。圖片顯示視野中乳液液滴大小不均一，其中11S乳液中的大液滴總體數(shù)量較多，其次為SPI，最后為7S，這與粒徑結(jié)果一致。

表1 SPI、11S、7S制備的W/O/W乳液的粒徑、寬度及電位變化Table 1 Particle size,span value and zeta potential of W/O/W emulsion prepared with SPI,11S or 7S

圖3 制備的W/O/W乳液的激光共聚焦圖Fig.3 Confocal laser scanning micrographs of W/O/W emulsion

Zeta電位可以反映液滴間的帶電性質(zhì)，是研究乳液物理穩(wěn)定性的一個重要參數(shù)。有研究表明，電位的絕對值越大，表明其穩(wěn)定性越高。從表1可以看出，SPI、11S、7S制備的W/O/W乳液的電位之間存在顯著差異且SPI乳液電位的絕對值最大，說明用SPI制備的W/O/W乳液比11S、7S制備的乳液具有更高的穩(wěn)定性。

2.3 W/O/W乳液的流變學特性

乳液的流變學性質(zhì)不僅可以為乳液穩(wěn)定性和微觀結(jié)構提供有用的信息，還可以為在乳液的加工、處理、儲存和管道運輸中對所涉及設備的設計、選擇和操作提供重要方向。在0.1～100 s剪切速率下研究了SPI、11S、7S構建的W/O/W乳液的流動行為，如圖4所示。隨著剪切速率的增加W/O/W乳液黏度不斷降低，當剪切速率過高時，黏度趨于平緩，表現(xiàn)為剪切稀化行為。文獻中也有類似的結(jié)果，如Liu Jinning等的研究表明W/O/W雙乳液的流變學測定為剪切稀化行為。表2為采用冪律模型對W/O/W乳液數(shù)據(jù)進行的非線性回歸分析。其中，為稠度系數(shù)，與黏度測定值相等；為流動指數(shù)，表示流體偏離牛頓流體的程度，當=1時為牛頓流體，當＜1時且乳液黏度隨剪切速率的增加而降低時，屬于非牛頓流體的假塑性流動。從表2可知，SPI、11S、7S制備的W/O/W乳液均為非牛頓流體（＜1），黏度值分別為（0.029±0.005）、（0.005±0.000）、（0.003±0.005）Pa·s，SPI黏度顯著大于11S、7S。有研究表明，乳液較高黏度可抑制乳液的聚合和沉淀速率，增強其穩(wěn)定性，這與乳液整體穩(wěn)定性的研究結(jié)果一致。圖5為在變頻速率下，乳液的儲能模量（’）和損耗模量（’’）的變化，其中’代表彈性，’’代表黏性。研究結(jié)果表明，隨著頻率的增加，乳液’、’’呈現(xiàn)上升的趨勢，表明乳液的黏彈性增加，且’、’’之間存在交叉點頻率，在交叉點之前，’’＞’表現(xiàn)為黏性為主，反之則以彈性為主。同時，圖5直觀地表明了乳液黏彈性大小為SPI＞11S＞7S。

圖4 SPI、11S、7S制備W/O/W乳液的黏度變化Fig.4 Changes in viscosity of W/O/W emulsion prepared with SPI,11S or 7S

表2 SPI、11S、7S對W/O/W乳液冪律模型擬合參數(shù)的影響Table 2 Effects of SPI,11S and 7S on power law model parameters for W/O/W emulsion

圖5 SPI、11S、7S制備W/O/W乳液的G’和G’’隨頻率的變化Fig.5 Storage (G’) and loss (G’’) modulus versus frequency for W/O/W emulsion prepared with SPI,11S or 7S

乳液黏度可以反映乳液內(nèi)在形態(tài)與粒子間的相互作用，有研究表明多重乳液中水分子的遷移會造成乳液黏度的變化。由圖6可得，貯藏時間延長，SPI乳液的黏度呈現(xiàn)下降趨勢，7S及11S乳液黏度變化趨勢均表現(xiàn)為先降低后增加。結(jié)合后續(xù)長期穩(wěn)定性等實驗結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，基于SPI制備的W/O/W乳液其穩(wěn)定性強于7S及11S乳液，而體系黏度與乳液穩(wěn)定性存在一定關系。推測7S/11S乳液中的水分子較SPI乳液更易從內(nèi)向外遷移，進而改變了其連續(xù)相和分散相的比例，造成乳液黏度下降，之后雙重乳液發(fā)生破裂又引起其黏度上升。

圖6 W/O/W乳液黏度在48 h內(nèi)的變化Fig.6 Changes in W/O/W emulsion viscosity during storage up to 48 h

2.4 W/O/W乳液的界面吸附行為

界面流變學（界面張力、界面黏彈性）與乳液的穩(wěn)定性存在一定的聯(lián)系，界面張力值越低，在能量輸入過程中破裂乳液液滴所需要的能量越少，形成的乳液粒徑越小，其穩(wěn)定性越好。圖7為SPI、11S、7S與PGPR復合體系在油水界面的張力值隨吸附時間的變化情況。圖7A結(jié)果表明，蛋白質(zhì)與PGPR的界面張力隨著時間延長呈顯著下降趨勢，表明界面上乳化劑的吸附量增加。SPI的界面張力衰減曲線值最小，其次是11S，再次為7S。觀察7S的界面張力衰減曲線，發(fā)現(xiàn)有曲折點，這可能與蛋白質(zhì)結(jié)構出現(xiàn)了明顯的去折疊有關。圖7B顯示，在吸附150 min后，SPI、11S、7S的界面張力值分別為4.07、5.18、7.18 mN/m，表明在相同的時間下SPI的界面張力最低，界面張力的降低會使得乳液液滴粒徑變小，從而有利于乳液的穩(wěn)定性。由于PGPR與蛋白質(zhì)均為兩親性分子，在界面上易發(fā)生疏水相互作用，進而協(xié)同降低界面層的張力值，而界面張力的降低程度主要取決于蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量與結(jié)構。

圖7 SPI、11S、7S與PGPR復合體系在油水界面的界面張力（γ）隨吸附時間的變化（A）及吸附150 min后復合體系γ的變化（B）Fig.7 Interfacial tension (γ) of composite systems of SPI,11S or 7S with PGPR at the oil-water interface as a function of adsorption time (A) and changes in γ after adsorption for 150 min (B)

2.5 W/O/W乳液的長期穩(wěn)定性

為探究不同蛋白質(zhì)構建的W/O/W乳液長期穩(wěn)定性，將其在室溫下放置15 d。如圖8A所示，15 d后對乳液外觀進行觀察，發(fā)現(xiàn)所有樣品瓶底部均有水分析出，說明此時乳液穩(wěn)態(tài)失衡，頂部出現(xiàn)明顯的油析。其中就分層率而言，7S的分層率最高，SPI的最低。測定W/O/W乳液在15 d內(nèi)TSI變化（圖8B），結(jié)果表明隨著時間的延長，乳液TSI值不斷變大，表明乳液在放置過程中穩(wěn)定性不斷降低。其中就曲線斜率而言，SPI的曲線斜率最低，11S和7S相差較小。15 d之后，SPI、11S、7S制備W/O/W乳液的TSI值分別為21.51、24、25.50，表明SPI制備的W/O/W乳液的穩(wěn)定性優(yōu)于11S、7S。這與界面張力、流變等結(jié)果一致。

圖8 SPI、11S、7S制備W/O/W乳液15 d后的直觀圖（A）和15 d內(nèi)TSI的變化（B）Fig.8 Visual appearance of W/O/W emulsion prepared with SPI,11S or 7S after 15 days of storage (A) and changes in TSI during the 15-day storage period (B)

3 結(jié)論

采用兩步乳化法，基于Ssa及SPI、11S、7S成功構建出較為穩(wěn)定的W/O/W乳液，發(fā)現(xiàn)隨著貯藏時間的延長，乳液的TSI值呈上升趨勢；SPI構成乳液的上浮率最小，各組乳液粒徑集中在6 μm附近；電位絕對值的順序為SPI＞11S＞7S；乳液體系表現(xiàn)出假塑性剪切稀化行為，SPI乳液的黏度值最大；在相同蛋白質(zhì)量分數(shù)下（1%），SPI制備的乳液的穩(wěn)定性優(yōu)于11S、7S。本研究探索了以Ssa、蛋白為原料構建W/O/W型乳液的可行性，為二者在新型乳液基食品中的進一步應用打下基礎。