蔡若純，鄧皇翼，劉耀慧，劉鵬展，羅志浩，劉海虹，雷 毅

（廣東省食品檢驗所，廣東 廣州 510435）

氟苯尼考又稱氟甲砜霉素，是新一代氯霉素類動物專用抗生素，具有抗菌譜廣、毒副作用小等特點(diǎn)，是農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)使用的動物專用抗菌藥，被廣泛應(yīng)用于動物養(yǎng)殖業(yè)[1-2]。GB 31650—2019《食品中獸藥最大殘留限量》[3]規(guī)定了不同動物種類的氟苯尼考獸藥最大殘留限量，其中產(chǎn)蛋期禁止使用氟苯尼考。國家食品藥品監(jiān)督管理局也對氟苯尼考做出風(fēng)險提示，成人（以60 kg計算）每日從飲食中攝取 0～180 μg的氟苯尼考，正常情況下不會有風(fēng)險，但長期食用氟苯尼考?xì)埩舫瑯?biāo)的雞蛋，對人體健康會產(chǎn)生一定危害[4]。

目前氟苯尼考的實驗室檢測方法主要有氣相色譜法[5-7]、高效液相色譜法[8-9]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等[10-13]，檢出限范圍為0.1～1.0 μg/kg。由于獸藥殘留大部分為痕量檢測，在日常檢測及方法確認(rèn)過程中，常采用加標(biāo)回收和基體標(biāo)準(zhǔn)樣品等質(zhì)控手段進(jìn)行質(zhì)量控制[14-15]，但加標(biāo)回收難以反映出真正陽性樣品的提取效率，而現(xiàn)有基體標(biāo)準(zhǔn)樣品的價格昂貴、基質(zhì)品種有限，未能滿足實際工作需求。此外，隨著食品快速檢測方法的發(fā)展，因快速檢測產(chǎn)品具有操作簡便、成本低、檢測周期短等特點(diǎn)，快速檢測方法和技術(shù)逐漸廣泛應(yīng)用于氟苯尼考獸藥殘留的現(xiàn)場篩查[16-18]。在快速檢測產(chǎn)品[19]和快檢方法評價[20]驗證過程中往往需要自制特定項目、基質(zhì)和濃度的質(zhì)控樣品，對快速檢測產(chǎn)品性能指標(biāo)和快速檢測整體過程進(jìn)行質(zhì)量控制。本研究從日常快速檢測和實驗室檢測的不同需求出發(fā)，最終設(shè)置0.25、0.4 μg/kg和2.0 μg/kg三個添加量，提供一種雞蛋中氟苯尼考質(zhì)控樣品研制方法，彌補(bǔ)有證的基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)卻可選項目少、濃度水平單一、采購成本高、定制周期長等問題，同時探究影響氟苯尼考質(zhì)控樣品穩(wěn)定性的因素，自主研制均穩(wěn)性良好的質(zhì)控樣品可推廣應(yīng)用于快速檢測及實驗室檢測等不同領(lǐng)域。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞蛋 市購；氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（99.82%） 德國Dr.Ehrenstorfer公司；正己烷、丙酮（均為分析純）廣州化學(xué)試劑廠；正丙醇（分析純） 天津市永大化學(xué)試劑有限公司 ；乙腈（色譜純） 德國Merck公司；實驗用水均為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

T Q-S 超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀美國Waters公司；GM200刀式研磨儀 德國Retsch公司；Scientz 50F/A真空冷凍干燥機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；EFAA-HM-01多孔渦旋振蕩器 上海ANPEL科技股份有限公司；Multifuge X3R高速冷凍離心機(jī) 美國Thermo Fisher Scientific公司；RV10旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國IKA公司；HBE-12B固相萃取裝置 天津市恒奧科技發(fā)展有限公司；Milli-Q 超純水制備儀德國Merck公司；國產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)試驗篩（40 目）。

1.3 方法

1.3.1 基質(zhì)的選擇與準(zhǔn)備

采用GB/T 22338—2008《動物源性食品中氯霉素類藥物殘留量測定》[21]對樣品中氟苯尼考的含量進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果數(shù)值低于方法檢出限，則選擇作為制備質(zhì)控樣品的空白基質(zhì)。

1.3.2 方法回收率

為確保儀器檢測質(zhì)控樣品均勻性和穩(wěn)定性結(jié)果的科學(xué)性，在開展質(zhì)控樣品制備之前先驗證雞蛋中氟苯尼考添加回收率[22-23]。選取不含氟苯尼考的雞蛋為空白基質(zhì)，預(yù)處理勻漿后制成雞蛋液，根據(jù)快檢產(chǎn)品及快檢方法評價技術(shù)規(guī)范相關(guān)要求質(zhì)控樣品以1～2 倍氟苯尼考快檢方法或產(chǎn)品檢出限為典型含量水平，同時為更好應(yīng)用于實驗室氟苯尼考檢測的質(zhì)量控制，質(zhì)控樣品充分考慮滿足不同檢測方法的雞蛋氟苯尼考檢出限范圍為0.1～1.0 μg/kg，氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的添加量為0.25、0.4 μg/kg和2.0 μg/kg三個水平，采用GB/T 22338—2008的方法檢測其含量，并計算回收率。

1.3.3 質(zhì)控樣品的制備

以不含氟苯尼考的雞蛋液為空白基質(zhì)，添加一定的氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，添加量為0.25、0.4 μg/kg和2.0 μg/kg三個水平，4 000 r/min均質(zhì)混勻2 min（采用20 s間歇式攪拌，攪拌6 次）制備成氟苯尼考陽性新鮮質(zhì)控樣品（非凍干組），將新鮮質(zhì)控樣品經(jīng)過24 h冷凍干澡、2 次混勻（4 000 r/min均質(zhì)混勻2 min）、過40 目試樣篩及分裝等步驟，制備成氟苯尼考陽性凍干質(zhì)控樣品（凍干組），具體制備流程如圖1所示。

圖1 雞蛋中氟苯尼考質(zhì)控樣品的制備流程Fig.1 Preparation process of quality control samples for determination of florfenicol in eggs

1.3.4 質(zhì)控樣品中氟苯尼考的檢測

準(zhǔn)確稱取一定量的新鮮陽性質(zhì)控樣品或凍干陽性質(zhì)控樣品（其中凍干樣品按照1∶4比例加蒸餾水復(fù)溶，渦漩混勻恢復(fù)至蛋液狀態(tài)），采用GB/T 22338—2008方法進(jìn)行測定，凍干樣品結(jié)果以復(fù)溶后樣品質(zhì)量計算，保留小數(shù)點(diǎn)后兩位。

液相色譜條件：ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（180 mm×2.1 mm，3.5 μm）；流動相：A為水，B為乙腈；梯度洗脫程序：0～1.0 min，90% A、10% B；1.0～3.5 min，90%～10% A、10%～90% B；3.5～4.5 min，10% A、90% B；4.5～4.6 min，10%～90% A、90%～10% B；4.6～6.0 min，90% A、10% B。流速0.35 mL/min；柱溫35 ℃；進(jìn)樣體積1 μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源；負(fù)離子模式；多反應(yīng)監(jiān)測模式；電噴霧電壓3.5 kV；離子源溫度500 ℃；碰撞氣為氬氣；干燥氣為氮?dú)?；流? 000 L/h。質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 氟苯尼考的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectrometric parameters for determination of folrfenicol

1.3.5 質(zhì)控樣品的均勻性評估

依據(jù)CNAS-GL003:2018《能力驗證樣品均勻性和穩(wěn)定性評價指南》[24]和RB/T 031—2020《能力驗證計劃的選擇與核查及結(jié)果利用指南》[25]要求，隨機(jī)稱取上述凍干組（固態(tài)）和非凍干組（液態(tài)）氟苯尼考質(zhì)控樣品各10 份（n=10），每份樣品重復(fù)測定2 次，并采用單因子方差分析法計算F值，進(jìn)行均勻性評估分析。若計算得到的方差分析F＜F0.05（9,10），則判定樣品均勻性良好。

1.3.6 質(zhì)控樣品的穩(wěn)定性

1.3.6.1 短期穩(wěn)定性

參照CNAS-GL003:2018，每隔1 個月隨機(jī)抽取6 個樣品（n=6），采用獨(dú)立樣本t檢驗法，與均勻性檢驗數(shù)據(jù)的初始值進(jìn)行比較分析，從而監(jiān)測不同制備方式、貯存溫度、加標(biāo)量條件下樣品中氟苯尼考含量變化，考察各條件對短期穩(wěn)定性的影響。

將上述凍干組和非凍干組質(zhì)控樣品置于－18 ℃貯存，考察不同樣品狀態(tài)對質(zhì)控樣品穩(wěn)定性的影響。

將凍干組質(zhì)控樣品分別置于25、4、－18 ℃貯存，考察不同貯存溫度對凍干質(zhì)控樣品穩(wěn)定性的影響。

將3 個添加量的凍干組質(zhì)控樣品置于－18 ℃貯存，考察不同加標(biāo)量對凍干質(zhì)控樣品穩(wěn)定性的影響。

1.3.6.2 長期穩(wěn)定性

長期穩(wěn)定性研究12 個月，每隔3 個月時間隨機(jī)抽取6 個樣品，平行測定2 次取平均值，采用t檢驗法對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.3.7 質(zhì)控樣品的定值

參照CNAS-CL04:2007《標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)樣品生產(chǎn)者能力認(rèn)可準(zhǔn)則》[26]和JJF 1343—2012《標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值的通用原則及統(tǒng)計學(xué)原理》[27]。本研究選取凍干質(zhì)控樣品為例，采用6 家中國合格評定國家認(rèn)可委員會認(rèn)可的實驗室進(jìn)行聯(lián)合定值的方式，給每個實驗室發(fā)放3 份質(zhì)控樣品，每個樣品測定2 次平行，采用實驗室認(rèn)可的國家標(biāo)準(zhǔn)檢測方法分別測定氟苯尼考含量，通過吉布斯G檢驗和科克倫C檢驗判定檢測結(jié)果無異常值后，最終將測定的總平均值作為質(zhì)控樣品的參考值。

2 結(jié)果與分析

2.1 添加回收率結(jié)果

選取經(jīng)GB/T 22338—2008方法確證不含有氟苯尼考的雞蛋作為空白基質(zhì)，分別添加0.25、0.4 μg/kg和2.0 μg/kg三個水平的目標(biāo)物，驗證雞蛋中氟苯尼考回收率。經(jīng)儀器測定結(jié)果表明本方法添加氟苯尼考回收率在85.8%～113.7%之間（表2），符合GB/T 27417—2017《合格評定化學(xué)分析方法確認(rèn)和驗證指南》[28]方法回收率偏差范圍相關(guān)要求，表明儀器檢測方法準(zhǔn)確、可靠。

表2 雞蛋中氟苯尼考回收率Table 2 Recoveries of florfenicol spiked in eggs

2.2 氟苯尼考質(zhì)控樣品的均勻性

采用GB/T 22338—2008方法分別測定非凍干組（A）和凍干組（B）質(zhì)控樣品3 個添加量的氟苯尼考含量，測量結(jié)果采用單因子方差統(tǒng)計分析法（F檢驗）分析處理，SPSS軟件分析實驗結(jié)果的F值，結(jié)果見表3和表4。

表3 非凍干組（A）質(zhì)控樣品均勻性檢驗結(jié)果Table 3 Results of homogeneity test for non-lyophilized samples (A)

續(xù)表3

表4 非凍干組（B）質(zhì)控樣品均勻性檢驗結(jié)果Table 4 Results of homogeneity test for non-lyophilize samples (B)

實驗測試的組內(nèi)自由度為10，組間自由度為9，經(jīng)統(tǒng)計分析，非凍干組（A）3 個水平的F值在2.562～2.914之間，凍干組（B）3 個添加量的F值在1.970～2.804之間，均小于臨界值F0.05（9,10）=3.020，P值均大于0.05，表明在顯著水平α=0.05時，添加同一添加量的樣品之間不存在顯著性差異，添加的氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在雞蛋基質(zhì)中均勻分散，均勻性驗證方差分析結(jié)果見表5。

表5 均勻性驗證方差分析結(jié)果Table 5 Results of variance analysis

2.3 氟苯尼考質(zhì)控樣品的穩(wěn)定性

2.3.1 短期穩(wěn)定性

2.3.1.1 樣品狀態(tài)對質(zhì)控樣品穩(wěn)定性的影響

制備分裝完成的非凍干組（液態(tài)）和凍干組（固態(tài)）質(zhì)控樣品分別置于－18 ℃貯存，每隔1 周檢測1 次，每組測定6 個樣品，檢測平均值即為質(zhì)控樣品氟苯尼考含量，監(jiān)測3 個月內(nèi)2 組質(zhì)控樣品目標(biāo)物含量變化。從圖2可以看出，凍干質(zhì)控樣品較非凍干質(zhì)控樣品含量變化趨勢更平緩。按CNAS-GL003:2018穩(wěn)定性檢驗要求，將每次檢測平均值與初始檢測平均值進(jìn)行一致性比較，計算t值，其中凍干質(zhì)控樣品第1個月至第3個月的t值在0.802～1.641之間，均小于t臨界值（2.145）。非凍干質(zhì)控樣品第1個月至第3個月的t值在2.786～7.472之間，第3個月t值大于t臨界值（2.145）。結(jié)果表明凍干質(zhì)控樣品較非凍干質(zhì)控樣品在－18 ℃條件貯存3 個月的短期穩(wěn)定性更高。

圖2 樣品狀態(tài)對質(zhì)控樣品穩(wěn)定性的影響Fig.2 Impact of sample state on the stability of quality control samples

凍干質(zhì)控樣品基本不含水分，在－18 ℃貯存條件下雞蛋的蛋白質(zhì)不易發(fā)生不可逆變性，因此其抗凍性和穩(wěn)定性較強(qiáng)。目前已有相關(guān)研究表明雞蛋主要成分卵白蛋白經(jīng)過冷凍干燥后，結(jié)構(gòu)上并未發(fā)生斷裂和重組，并且化學(xué)性質(zhì)均未發(fā)生明顯變化，說明冷凍干燥處理不會對雞蛋中蛋白質(zhì)產(chǎn)生較大影響[29-30]。與凍干組相比，非凍干組樣品在冷凍過程中容易產(chǎn)生蛋白質(zhì)變性，使與蛋白質(zhì)結(jié)合的氟苯尼考狀態(tài)受到一定程度的影響，此外蛋白質(zhì)不可逆變性產(chǎn)生的絮狀物分層也影響了樣品基質(zhì)的分散性和穩(wěn)定性，從而導(dǎo)致非凍干組質(zhì)控樣品穩(wěn)定性降低。綜上，分析原因可能是凍干組樣品抗凍能力強(qiáng)，蛋白質(zhì)不易變性使其具有更高的穩(wěn)定性。

2.3.1.2 貯存溫度對質(zhì)控樣品穩(wěn)定性的影響

凍干質(zhì)控樣品不容易變質(zhì)，可以在不同條件下貯存，日常檢驗工作應(yīng)用也更為廣泛，因此本研究以凍干質(zhì)控樣品為對象，探究溫度條件對質(zhì)控樣品穩(wěn)定性的影響。將制備分裝完成的凍干質(zhì)控樣品分組放置于25、4、－18 ℃貯存，監(jiān)測3 個月內(nèi)不同溫度貯存的質(zhì)控樣品目標(biāo)物含量變化，由圖3可以看出，－18 ℃組質(zhì)控樣品氟苯尼考含量變化趨于平緩，25 ℃組和4 ℃組質(zhì)控樣品氟苯尼考含量在第3個月有明顯下降。

圖3 不同貯存溫度對質(zhì)控樣品穩(wěn)定性的影響Fig.3 Impact of storage temperature on the stability of quality control samples

經(jīng)t檢驗，凍干質(zhì)控樣品在－1 8 ℃條件貯存1～3 個月的t值范圍在0.802～1.641之間，均小于t臨界值（2.145）。在25 ℃條件下貯存1～3 個月的t值在0.458～8.501之間，第3個月t值為8.501，大于t臨界值（2.145）。在4 ℃條件下貯存1～3 個月的t值在1.053～4.845之間，其中第3個月t值為4.845，大于t臨界值（2.145）。上述結(jié)果表明質(zhì)控樣品在－18 ℃條件下貯存3 個月的短期穩(wěn)定性良好，且較4 ℃和25 ℃條件貯存更為穩(wěn)定。分析原因可能是受微生物繁殖的影響，由于質(zhì)控樣品制備過程未進(jìn)行滅菌處理，樣品存在有一定基數(shù)的微生物，其中雞蛋中主要的微生物種群為沙門氏菌、大腸桿菌、李斯特菌等，其最適生長溫度在20～40 ℃之間，在25 ℃（常溫）條件貯存微生物生長繁殖最快，所以添加的抗生素在微生物作用下迅速降解。而貯存溫度降低則會明顯減緩微生物的生長繁殖，從而降低氟苯尼考的消耗和降解速率，故在－18 ℃（冷凍）條件下貯存的質(zhì)控樣品氟苯尼考含量變化趨勢平緩。目前已有研究表明微生物對氟苯尼考等抗生素的降解起主導(dǎo)作用[31-32]，這說明貯存溫度對氟苯尼考質(zhì)控樣品穩(wěn)定性的影響可能主要來自對微生物繁殖的影響。

2.3.1.3 加標(biāo)量水平對質(zhì)控樣品穩(wěn)定性的影響

將不同添加量的凍干質(zhì)控樣品置于－18 ℃貯存，監(jiān)測3 個月內(nèi)不同添加量的質(zhì)控樣品氟苯尼考含量變化，由圖4可以看出不同添加量（0.25、0.4 μg/kg和2.0 μg/kg）的質(zhì)控樣品目標(biāo)物含量變化趨勢均較為平緩。經(jīng)t檢驗，0.25 μg/kg的質(zhì)控樣品穩(wěn)定性檢驗t值在0.684～1.932之間，0.4 μg/kg的t值在0.437～1.689之間，2.0 μg/kg的t值在0.802～1.641之間，均小于t臨界值（2.145）。上述結(jié)果表明不同濃度質(zhì)控樣品在－18 ℃條件下貯存3 個月的短期穩(wěn)定性良好。

2.3.2 長期穩(wěn)定性

將不同含量分裝好的凍干質(zhì)控樣品貯存于－18 ℃，放置12 個月，期間每間隔3 個月隨機(jī)抽取6 份進(jìn)行測定，監(jiān)測該質(zhì)控樣品長期穩(wěn)定性，所有t值均小于t臨界值（2.145），結(jié)果見表6。結(jié)果表明不同添加量的質(zhì)控樣品在12 個月存儲期間，穩(wěn)定性良好。

表6 質(zhì)控樣品的長期穩(wěn)定性測定結(jié)果Table 6 Results of long-term stability test for quality control samples

2.4 質(zhì)控樣品的定值

本研究按照自主研制3 個添加量的氟苯尼考質(zhì)控樣品，經(jīng)均勻性和穩(wěn)定性驗證結(jié)果滿足CNAS-GL003:2018相關(guān)要求，以凍干質(zhì)控樣品（固態(tài)）為例，選取6 家CNAS認(rèn)證的實驗室，采用GB/T 22338—2008標(biāo)準(zhǔn)方法檢測凍干質(zhì)控樣品目標(biāo)物含量，分別匯總各組參加合作定值數(shù)據(jù)，結(jié)果見表7。

表7 質(zhì)控樣品的定值數(shù)據(jù)及結(jié)果Table 7 Analytical results for certification of quality control samples

通過吉布斯檢驗，發(fā)現(xiàn)所有實驗數(shù)據(jù)G值均不大于G0.05臨界值（查表得1.89），表明數(shù)據(jù)不存在異常值，再通過用科克倫檢驗確定6 個實驗室對不同添加量質(zhì)控樣品的檢測數(shù)據(jù)C值不大于C0.05（6,6）臨界值（查表得0.445），表明沒有隨機(jī)誤差太大的實驗室，各實驗室間的測量屬于等精度測量，因此將所有實驗室每個添加量質(zhì)控樣品的總平均值作為氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)樣品含量定值結(jié)果：X1=0.23 μg/kg，X2=0.39 μg/kg，X3=1.92 μg/kg，3 個添加量的質(zhì)控樣品可應(yīng)用于快速檢測或?qū)嶒炇覚z測的質(zhì)量控制及能力驗證等領(lǐng)域。

3 結(jié)論

采用雞蛋基質(zhì)分別添加標(biāo)準(zhǔn)溶液的方式成功研制了3 個添加量的液態(tài)質(zhì)控樣品，另外將液態(tài)樣品采用真空冷凍干燥的方式，制得固態(tài)凍干粉，2 種狀態(tài)質(zhì)控樣品均勻性均較良好。通過考察3 個月短期穩(wěn)定性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同樣品狀態(tài)、不同貯存溫度對質(zhì)控樣品穩(wěn)定性有影響，不同的添加量則對質(zhì)控樣品穩(wěn)定性無影響。該方法制備的凍干質(zhì)控樣品比非凍干質(zhì)控樣品穩(wěn)定性更高，分析原因可能是凍干組抗凍性能更好，蛋白質(zhì)不易變性使其具有更高的穩(wěn)定性。為了保證質(zhì)控樣品穩(wěn)定性，建議采用冷凍干燥方式去除水分。凍干質(zhì)控樣品在冷凍（－18 ℃）貯存12 個月穩(wěn)定性良好，但在冷藏（4 ℃）和常溫（25 ℃）貯存3 個月穩(wěn)定性有所下降，可能是受微生物繁殖的影響，貯存溫度降低會明顯減緩微生物的生長繁殖，從而降低氟苯尼考的消耗和降解速率。本研究制備的凍干質(zhì)控樣品不易變質(zhì)，冷凍條件下可穩(wěn)定保存12 個月，可應(yīng)用于實驗室日常檢測作為質(zhì)量控制手段，并推廣應(yīng)用于快檢產(chǎn)品評價、快檢機(jī)構(gòu)考核、快檢方法研制等快檢各個領(lǐng)域。