應(yīng)用拉曼光譜對(duì)比分析德式乳桿菌保加利亞亞種ND02及其VBNC態(tài)細(xì)胞成分

包秋華，馬學(xué)波，任 艷，王麗娜，張雨虹，代利霞

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部奶制品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014016）

一些細(xì)菌在不利生長(zhǎng)環(huán)境下可以進(jìn)入活的但不可培養(yǎng)（viable but non-culturable，VBNC）態(tài)，這是細(xì)菌處于不良環(huán)境下的一種生存策略，處于該狀態(tài)下的細(xì)菌不能在常規(guī)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，因此利用常規(guī)平板計(jì)數(shù)方法檢測(cè)容易造成假陰性結(jié)果。VBNC態(tài)的概念首次由徐懷恕于1982年提出，發(fā)現(xiàn)在河口和海洋環(huán)境中的大腸桿菌（）和霍亂弧菌（）存在VBNC態(tài)。VBNC態(tài)細(xì)菌雖然不能在普通培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，但依然可以保持基本的代謝活性和基因表達(dá)。迄今為止，已有超過(guò)100 種細(xì)菌和真菌被證實(shí)可進(jìn)入VBNC態(tài)，其中細(xì)菌包括短乳桿菌（）、大腸桿菌、副溶血弧菌（）、單核細(xì)胞性李斯特菌（）、德氏乳桿菌保加利亞亞種（subsp）ND02和糞腸球菌（）等，真菌有釀酒酵母（）、星狀假絲酵母（）等。導(dǎo)致細(xì)菌進(jìn)入VBNC態(tài)的環(huán)境包括低pH值、滲透壓、輻射、低溫、寡營(yíng)養(yǎng)和海水等。

自然界中99%以上的微生物因各種環(huán)境脅迫的驅(qū)使而處于VBNC狀態(tài)，導(dǎo)致它們不能被充分研究和利用，對(duì)細(xì)菌進(jìn)入VBNC態(tài)機(jī)理的研究被廣泛關(guān)注。VBNC態(tài)細(xì)胞和活的可培養(yǎng)細(xì)胞之間存在生理和分子水平的差異，包括細(xì)胞壁和細(xì)胞膜組成、基因表達(dá)、細(xì)胞形態(tài)、毒力因子、代謝特性、黏附特性以及物理和化學(xué)抗性等。例如，大腸桿菌VBNC態(tài)細(xì)胞與正常細(xì)胞相比尺寸會(huì)減小。VBNC態(tài)細(xì)胞仍具有ATP消耗和低水平的代謝活動(dòng)。到目前為止，已發(fā)現(xiàn)一些調(diào)節(jié)因子與VBNC態(tài)細(xì)胞的誘導(dǎo)和復(fù)蘇有關(guān)，如過(guò)氧化氫酶KatG、LysR型轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子OxyR、應(yīng)激調(diào)節(jié)因子RpoS、烷基氫過(guò)氧化物還原酶亞基C（ahpC1和ahpC2）和復(fù)蘇促進(jìn)因子Rpfs等；此外，外膜蛋白EnvZ/OmpR也被發(fā)現(xiàn)與VBNC態(tài)的形成有關(guān)。

工業(yè)化生產(chǎn)的乳酸菌也被證明存在VBNC態(tài)。乳酸菌是生產(chǎn)發(fā)酵乳、飼料等常用菌種，其中德氏乳桿菌保加利亞亞種是生產(chǎn)發(fā)酵乳常用的商業(yè)發(fā)酵菌種之一。菌株在生產(chǎn)、運(yùn)輸、貯存及應(yīng)用過(guò)程中會(huì)經(jīng)歷低溫、低pH值、真空、冷凍、干燥等不良生長(zhǎng)環(huán)境，這些不利條件不但影響菌株活性，還影響其發(fā)酵乳制品的優(yōu)良特性，進(jìn)而影響產(chǎn)品的風(fēng)味、質(zhì)地以及穩(wěn)定性。

細(xì)胞是細(xì)菌活動(dòng)和生物體形態(tài)結(jié)構(gòu)的基本單位，環(huán)境壓力導(dǎo)致的細(xì)胞異質(zhì)性表示不同生理狀態(tài)的細(xì)胞共存。單細(xì)胞拉曼光譜（single-cell Raman spectrometry，SCRS）是近年來(lái)出現(xiàn)的單細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)之一，是以激光作激發(fā)光源激發(fā)單色光在分子鍵上形成非彈性散射，根據(jù)細(xì)胞中特征性化學(xué)鍵的振動(dòng)頻率提供全面固有分子譜的檢測(cè)技術(shù)。將拉曼散射效應(yīng)與傅里葉變換等技術(shù)手段結(jié)合獲取分子的拉曼光譜信息，再通過(guò)比對(duì)拉曼譜線的數(shù)目、位移大小、光譜強(qiáng)度等信息能夠了解待測(cè)組分的分子構(gòu)象及其所處環(huán)境。SCRS具有長(zhǎng)帶寬、窄峰寬和高分辨率的特點(diǎn)，已被用于細(xì)菌治療中監(jiān)測(cè)群體水平或單細(xì)胞水平上細(xì)菌表型的變化，其中大部分是細(xì)胞內(nèi)大分子物質(zhì)含量的變化。它富含生物分子的結(jié)構(gòu)信息，能有效區(qū)分不同分子活性物質(zhì)，包括核酸、蛋白質(zhì)、碳水化合物和脂質(zhì)等大分子生物鍵，從而識(shí)別不同細(xì)胞類型和生理狀態(tài)。

鑒于目前對(duì)VBNC菌的研究大多集中在誘導(dǎo)條件、檢測(cè)方法、復(fù)蘇環(huán)境等方面，缺乏對(duì)該狀態(tài)下細(xì)菌活性特征的深入分析。本實(shí)驗(yàn)以實(shí)驗(yàn)室篩選的一株具有優(yōu)良發(fā)酵特性的酸乳發(fā)酵劑——德氏乳桿菌保加利亞亞種ND02為研究對(duì)象，將其在低溫、低pH值下進(jìn)行VBNC態(tài)誘導(dǎo)，采用單細(xì)胞拉曼光譜檢測(cè)技術(shù)分析德氏乳桿菌保加利亞亞種ND02 VBNC態(tài)與正常細(xì)胞內(nèi)部大分子化合物變化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

德氏乳桿菌保加利亞亞種ND02由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室乳酸菌菌種庫(kù)保藏和提供；MRS液體、固體培養(yǎng)基 英國(guó)Oxoid公司；LIVE/DEADBacLight? Bacterial Viability Kit（L7102）美國(guó)Molecular Probes公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DM4000B正置熒光顯微鏡 德國(guó)Lecia公司；5810R高速低溫離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；拉曼共聚焦顯微鏡系統(tǒng) 英國(guó)Horiba公司；SU8010冷場(chǎng)掃描電子顯微鏡 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌VBNC態(tài)的誘導(dǎo)和形態(tài)觀察

將德氏乳桿菌保加利亞亞種ND02接種于MRS液體培養(yǎng)基中，在37 ℃恒溫靜置活化培養(yǎng)，傳代培養(yǎng)至第3代，鏡檢為純的菌株后，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的ND02按王亞利等的方法于4 ℃在MRS液體培養(yǎng)基中進(jìn)行VBNC態(tài)誘導(dǎo)。誘導(dǎo)過(guò)程中定期通過(guò)平板計(jì)數(shù)法和熒光顯微鏡（使用LIVE/DEADBacLight? Bacterial Viability Kit做染色處理）檢測(cè)細(xì)胞活性，當(dāng)平板計(jì)數(shù)結(jié)果為零而熒光顯微鏡下仍有顯綠色熒光的活細(xì)胞（顯紅色熒光的細(xì)胞為死亡態(tài)）存在時(shí)，則認(rèn)定此時(shí)的菌株ND02已完全進(jìn)入VBNC態(tài)。采用掃描電子顯微鏡觀察表觀形態(tài)并拍照。

1.3.2 德氏乳桿菌保加利亞亞種ND02的拉曼信號(hào)采集

取正常、VBNC態(tài)德氏乳桿菌保加利亞亞種ND02各3 個(gè)平行樣本，室溫5 200 r/min離心3 min收集菌體，然后用ddHO輕輕吹打，洗滌3 次后將其適當(dāng)稀釋，使細(xì)胞均勻分散于視野中，以便進(jìn)行SCRS的采集。然后吸取1.5 μL細(xì)胞稀釋懸液于CaF平板上，風(fēng)干后，立即采用100 mW×532 nm激光的拉曼系統(tǒng)進(jìn)行信號(hào)采集，照射于細(xì)胞上的激光光強(qiáng)控制為約25 mW，每個(gè)圖譜采集10 s，每個(gè)平行樣本取20 個(gè)細(xì)胞進(jìn)行圖譜采集。

1.3.3 拉曼圖譜數(shù)據(jù)預(yù)處理

采用LabSpec 5軟件進(jìn)行拉曼數(shù)據(jù)預(yù)處理，采用（二次函數(shù)）Polynom擬合Baseline的方法，參數(shù)設(shè)為0和1，盡量選擇低階參數(shù)以保證拉曼圖譜的原始形狀基本不改變，且盡量不引入更多的人為因素。由于測(cè)量過(guò)程中，激光點(diǎn)與細(xì)胞距離的差異會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞信號(hào)的差異，直接影響信號(hào)的收集，使兩個(gè)細(xì)胞拉曼信號(hào)的異同難以明確，因此，假定一定大小激光點(diǎn)內(nèi)測(cè)得的總物質(zhì)量一定、且激光點(diǎn)小于細(xì)胞大小，在此前提下對(duì)經(jīng)Baseline處理后的數(shù)據(jù)進(jìn)行面積歸一化處理。經(jīng)過(guò)初步處理的拉曼圖譜采用均值標(biāo)準(zhǔn)偏差（standard deviation of the means，SDM）進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，SDM=mean（SD）/SD（mean），SDM值越小表明數(shù)據(jù)越可靠。同時(shí)，選取600～1 800 cm范圍生化指紋峰用于后續(xù)統(tǒng)計(jì)分析，濾去噪聲，提取拉曼頻帶包含的有用信息。

1.4 數(shù)據(jù)處理

將預(yù)處理的數(shù)據(jù)與主成分分析（principle component analysis，PCA）法結(jié)合，PCA中PC個(gè)數(shù)的選擇以能夠解釋數(shù)據(jù)大于70%的變異為標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 德氏乳桿菌保加利亞亞種ND02正常與VBNC態(tài)細(xì)胞形態(tài)比較

由圖1可知，德氏乳桿菌保加利亞亞種ND02 VBNC態(tài)和正常細(xì)胞形態(tài)差異明顯，VBNC態(tài)細(xì)胞表面褶皺，長(zhǎng)度縮短，但細(xì)胞結(jié)構(gòu)仍然完整。該結(jié)果與已報(bào)道的大腸桿菌VBNC態(tài)細(xì)胞表現(xiàn)出細(xì)胞矮化或尺寸減小的現(xiàn)象類似。

圖1 德氏乳桿菌保加利亞亞種ND02的正常和VBNC態(tài)表面形態(tài)Fig.1 Surface morphology of the normal and VBNC cells of L.delbrueckii subsp.bulgaricus ND02

2.2 德氏乳桿菌保加利亞亞種ND02拉曼譜圖分析

如圖2所示，兩種狀態(tài)細(xì)胞的拉曼峰強(qiáng)度明顯不同，表明在不同狀態(tài)下細(xì)胞內(nèi)各物質(zhì)間差異較大。

圖2 不同狀態(tài)下德氏乳桿菌保加利亞亞種ND02平均拉曼光譜圖Fig.2 Mean Raman spectra of L.delbrueckii subsp.bulgaricuss ND02 under different conditions

進(jìn)一步對(duì)拉曼光譜進(jìn)行PCA，由圖3可知，德氏乳桿菌保加利亞亞種ND02正常細(xì)胞和VBNC態(tài)細(xì)胞之間幾乎無(wú)重疊，表明兩種狀態(tài)下細(xì)菌細(xì)胞可以被明顯區(qū)分。PC1和PC2的貢獻(xiàn)率分別為72.12%與16.32%，PC1與PC2可解釋約88%的變異信息。兩群體分離差表明，在不同生長(zhǎng)階段異質(zhì)細(xì)胞群體差異顯著，通過(guò)SCRS可以很好地識(shí)別和區(qū)分正常和VBNC態(tài)細(xì)胞。

圖3 不同狀態(tài)下德氏乳桿菌保加利亞亞種ND02的拉曼光譜PCAFig.3 PCA plot of Raman spectra of L.delbrueckii subsp.bulgaricus ND02 under different conditions

載荷值是PC分值與原始變量間的相關(guān)系數(shù)，可以權(quán)衡不同變量在PC可變性中所占權(quán)重。如圖4所示，PC1載荷絕對(duì)值大于0.05所對(duì)應(yīng)的峰具有主要貢獻(xiàn)，表明拉曼峰具有隨時(shí)間變化的最大絕對(duì)方差，并且對(duì)PCA中因子的分離貢獻(xiàn)重大。PC1占數(shù)據(jù)差異的70%以上，通過(guò)對(duì)PC1載荷值與相關(guān)特征峰強(qiáng)度（特征峰強(qiáng)度反映細(xì)胞內(nèi)某些物質(zhì)的變化）進(jìn)行相關(guān)性分析，可以得到不同狀態(tài)下ND02細(xì)胞內(nèi)相關(guān)生物大分子的合成特點(diǎn)。由圖4可知，影響PC1貢獻(xiàn)率的拉曼峰主要為1 673、1 650、1 459、1 030、1 005 cm等處的12 個(gè)峰。這些峰可作為區(qū)分ND02細(xì)胞VBNC態(tài)和正常態(tài)代謝狀態(tài)的參數(shù)。

圖4 PC1載荷值Fig.4 PC1 Loading values

2.3 德氏乳桿菌保加利亞亞種ND02 VBNC態(tài)與正常SCRS信號(hào)峰歸屬對(duì)比

SCRS為所有拉曼光譜成分提供了更詳細(xì)的光譜和細(xì)胞狀態(tài)信息，包括細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中核酸、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)變化，是一種綜合分析的方法。參考文獻(xiàn)[31]得到德氏乳桿菌保加利亞亞種ND02 VBNC態(tài)與正常細(xì)胞的主要SCRS信號(hào)峰歸屬。如表1所示，12 個(gè)特征峰中，830、1 355、1 459、717、813、1 090、1 330 cm處的峰與核酸和脂類相關(guān)，754、1 005、1 673、1 030、1 650 cm處的峰與蛋白相關(guān)。結(jié)合表1與圖4的PC1載荷值，對(duì)比發(fā)現(xiàn)ND02 VBNC態(tài)和正常細(xì)胞間6 個(gè)峰強(qiáng)度升高、6 個(gè)峰強(qiáng)度下降。其中蛋白類1 005 cm峰強(qiáng)度升高，蛋白質(zhì)類1 030 cm和1 650 cm峰強(qiáng)度下降；核酸類1 355 cm特征峰強(qiáng)度升高；核酸類813 cm和1 330 cm特征峰強(qiáng)度下降；構(gòu)成細(xì)胞膜重要組分磷脂及類脂的相關(guān)物質(zhì)（717、1 330 cm）含量顯著下降；維持細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)蛋白合成的酰胺類物質(zhì)（酰胺I）含量有上升（1 673 cm）也有下降（1 030、1 650 cm）。這些均是德氏乳桿菌保加利亞亞種ND02在4 ℃、低pH值環(huán)境壓力下應(yīng)激反應(yīng)的結(jié)果。

表1 德氏乳桿菌保加利亞亞種ND02 VBNC態(tài)與正常細(xì)胞的主要SCRS信號(hào)峰歸屬Table 1 Assignment of major SCRS signal peaks of L.delbrueckii subsp.bulgaricus ND02 in VBNC and normal states

王亞利通過(guò)氣相色譜對(duì)比分析該菌在4 ℃、低pH值下subsp.ND02 VBNC態(tài)和正常細(xì)胞的膜脂肪酸含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)VBNC態(tài)細(xì)胞與正常細(xì)胞相比，不飽和脂肪酸含量由（37.97±0.42）%增加到（53.68±0.15）%。推測(cè)subsp.ND02細(xì)胞可能通過(guò)改變膜脂肪酸的成分和含量、增加不飽和脂肪酸/飽和脂肪酸比值改變細(xì)胞膜流動(dòng)性，從而更好地適應(yīng)低溫、低pH值環(huán)境，這與本實(shí)驗(yàn)拉曼光譜的脂類分析結(jié)果一致。細(xì)菌在逆境條件下發(fā)生復(fù)雜的代謝活動(dòng)，包括轉(zhuǎn)錄、翻譯、能量依賴性和酶活性等。低溫會(huì)降低細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)尤其是酶的活性，如降低某些蛋白的分泌、部分蛋白質(zhì)折疊緩慢或效率降低、降低酶進(jìn)行轉(zhuǎn)錄或翻譯的活性。低溫環(huán)境使細(xì)胞RNA聚合酶活性降低，還可影響核酸的結(jié)構(gòu)和功能；冷脅迫還會(huì)促進(jìn)核糖核酸和脫氧核糖核酸二級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，導(dǎo)致核糖核酸翻譯和轉(zhuǎn)錄效率降低。本實(shí)驗(yàn)拉曼光譜的結(jié)果也與王亞利等研究中VBNC態(tài)菌株細(xì)胞通過(guò)減少生命活動(dòng)，降低能量代謝以及減少營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸、大分子合成以及呼吸速率的結(jié)論一致。本研究結(jié)果證實(shí)了拉曼光譜可以檢測(cè)細(xì)菌細(xì)胞中各物質(zhì)水平的變化，提供特定的脫氧核酸、核糖核酸、蛋白質(zhì)標(biāo)志，這些物質(zhì)在細(xì)菌細(xì)胞中的水平高度依賴細(xì)胞的代謝狀態(tài)，同時(shí)也能夠反映細(xì)胞的實(shí)時(shí)狀態(tài)。

3 結(jié)論

通過(guò)SCRS技術(shù)在單細(xì)胞水平對(duì)德氏乳桿菌保加利亞亞種ND02 VBNC態(tài)和正常細(xì)胞內(nèi)成分進(jìn)行檢測(cè)，并結(jié)合PCA多元統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果表明ND02 VBNC態(tài)和正常細(xì)胞的拉曼光譜存在明顯差異，主要集中在1 673、1 650、1 459、1 030、1 005 cm等處的12 個(gè)峰，這些峰主要?dú)w屬于核酸、脂類和蛋白質(zhì)類。通過(guò)掃描電子顯微鏡觀察細(xì)菌表征形態(tài)變化發(fā)現(xiàn)，德氏乳桿菌保加利亞亞種ND02的VBNC態(tài)與正常細(xì)胞相比變短、變粗，且細(xì)胞表面發(fā)生褶皺。因此推論細(xì)菌在由正常細(xì)胞進(jìn)入VBNC態(tài)的過(guò)程中可能通過(guò)調(diào)整遺傳物質(zhì)、脂類和蛋白質(zhì)適應(yīng)不利條件的影響。目前在單細(xì)胞水平研究細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)方法非常有限，細(xì)胞VBNC的機(jī)理研究需要多方面技術(shù)支持，本研究所用SCRS是一種非標(biāo)記、不依賴于群體細(xì)胞的方法。研究結(jié)果證明了SCRS檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用于乳酸菌VBNC態(tài)細(xì)胞成分的分析是可行的，該技術(shù)在細(xì)菌應(yīng)激、菌株鑒定、確定菌種來(lái)源以及選育優(yōu)良菌株等理論研究及實(shí)踐應(yīng)用中具有廣闊的應(yīng)用前景。