高鹽稀態(tài)醬油發(fā)酵優(yōu)勢真菌與風(fēng)味物質(zhì)相關(guān)性分析

阮志強(qiáng)，董璽梅，蔣雪薇,2,*，鄒世東，楊俊文，張 偉，吳 燦，方勤軍

（1.長沙理工大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，湖南 長沙 410114；2.湖南省調(diào)味品發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，湖南 長沙 410600；3.加加食品集團(tuán)股份有限公司，湖南 長沙 410600）

醬油又稱“清醬”或“醬汁”，是我國傳統(tǒng)的調(diào)味品。是以蛋白質(zhì)原料和淀粉質(zhì)原料為主，經(jīng)微生物發(fā)酵作用，釀造而成的色香味協(xié)調(diào)、營養(yǎng)物質(zhì)豐富的調(diào)味食品。醬油發(fā)酵除了是蛋白質(zhì)、淀粉等大分子物質(zhì)降解成氨基酸、多肽及各種糖的過程外，還是各種微生物代謝作用產(chǎn)生酸、醇、醛、酯、酚、酮等與醬油風(fēng)味密切相關(guān)物質(zhì)的過程。醬油釀造是復(fù)雜微生物菌群作用的結(jié)果，米曲霉以外的其他有益微生物通過自然接種到醬醪中，在它們的作用下，得到了多種代謝產(chǎn)物，形成了醬油特殊的風(fēng)味。已分析證明醬油中含有的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)超過1 000 種，分屬13 大類，除一少部分來源于釀造原料外，大部分是微生物代謝作用生成。而有害微生物在醬油釀造過程中形成污染后，則會使醬油出現(xiàn)酸餿味、脹氣等變質(zhì)現(xiàn)象。因此，探索并解析醬油釀造中微生物群落結(jié)構(gòu)，探討醬油發(fā)酵過程中微生物變化規(guī)律，將為構(gòu)建醬油釀造優(yōu)勢菌群提供理論依據(jù)，有利于醬油發(fā)酵機(jī)制的研究及質(zhì)量控制。

醬油釀造過程中的真菌主要是米曲霉以及一些耐鹽酵母。米曲霉具有豐富的酶系，可以分解原料中的大分子物質(zhì)，不僅為耐鹽酵母提供生長所需，還提升了醬油的風(fēng)味。耐鹽酵母能夠在醬油釀造過程中代謝產(chǎn)生酯、醇、醛、酸、酚、酮等豐富的風(fēng)味物質(zhì)，對醬油風(fēng)味的形成具有重要作用。真菌在醬油發(fā)酵中起了提高原料利用率、生成呈味物質(zhì)及生香作用，其群落結(jié)構(gòu)的變化將會影響醬油主要風(fēng)味物質(zhì)的形成，因此，研究醬油發(fā)酵過程中真菌群落結(jié)構(gòu)變化是構(gòu)建有益優(yōu)勢真菌菌群的基礎(chǔ)。采用高通量測序技術(shù)研究高鹽稀態(tài)醬油發(fā)酵過程中真菌多樣性及群落結(jié)構(gòu)變化，結(jié)合發(fā)酵過程品質(zhì)指標(biāo)及揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析，探討真菌群落結(jié)構(gòu)變化與醬油風(fēng)味物質(zhì)形成的相關(guān)性，將為高鹽稀態(tài)醬油重要風(fēng)味物質(zhì)的形成及品質(zhì)的提升奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬醪樣品，豆粕-小麥質(zhì)量比為7∶3，采自湖南某醬油廠。

醬醪發(fā)酵周期為6 個(gè)月，在發(fā)酵過程中不額外添加風(fēng)味菌。以成品曲加鹽水入罐開始記為0 個(gè)月，從0 個(gè)月入罐發(fā)酵至6 個(gè)月出罐，每隔1 個(gè)月取一次樣品，分別記為S0～S6。取樣前對發(fā)酵罐內(nèi)醬醪樣品進(jìn)行通氣攪拌，取混合均勻的醬醪樣品約500 mL，冰袋冷藏運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室保存在－80 ℃低溫冰箱中備用。

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑

孟加拉紅培養(yǎng)基 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；E.Z.N.A.Soil DNA Kit 美國Omega BioTek公司；NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit 美國Bioo Scientifci公司；AxyPrep DNA Gel Extraction Kit 美國Axygen Scientific公司；MiSeq Reagent Kit v3 美國Illumina Scientifci公司；2-甲基-3-庚酮 德國Dr.Ehrenstorfer公司。

1.2 儀器與設(shè)備

5424R高速臺式冷凍離心機(jī) 德國Eppendorf公司；NanoDrop2000超微量分光光度計(jì) 美國Thermo Fisher Scientific公司；ELx800酶標(biāo)儀 美國BioTek公司；Quantus? Fluorometer微型熒光計(jì) 美國Promega Scientific公司；DYYY-6C電泳儀 北京六一儀器廠；GeneAmp9700型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國ABI公司；Illumina MiSeq測序儀美國Illumina Scientific公司；436 GC/EVOQ TQ/PAL氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Bruker Daltonics公司；DB-5MS色譜柱 美國Agilent公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取針 美國Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 真菌總數(shù)測定

參照GB 4789.15—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 霉菌和酵母計(jì)數(shù)》的方法。

1.3.2 還原糖、氨基酸態(tài)氮及總酸的測定

還原糖測定：參照GB 5009.7—2016《食品中還原糖的測定》直接滴定法；總酸測定：參照GB 5009.235—2016《食品中氨基酸態(tài)氮的測定》氫氧化鈉滴定法；氨基酸態(tài)氮測定：參照GB 5009.235—2016《食品中氨基酸態(tài)氮的測定》甲醛滴定法。

1.3.3 高通量測序分析

1.3.3.1 真菌總DNA提取及PCR擴(kuò)增定量

采用E.Z.N.A.Soil DNA Kit試劑盒對醬醪中真菌的總DNA進(jìn)行提取，然后通過NanoDrop 2000分光光度計(jì)檢測提取DNA濃度，瓊脂糖凝膠電泳確定DNA完整性后，置于－20 ℃保存?zhèn)溆?；分別使用ITS1F（5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’）和ITS2R（5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’）對ITS1區(qū)基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

PCR擴(kuò)增體系為5×FastBuffer 4 μL、2.5 mmol/L dNTPs 2 μL、5 μmol/L Forward Primer 0.8 μL、5 μmol/L Reverse Primer 0.8 μL、FastPolymerase 0.4 μL、Template DNA 10 ng，用ddHO補(bǔ)齊至20 μL。PCR程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，循環(huán)30 次；最終72 ℃延伸10 min。每個(gè)樣本進(jìn)行3 個(gè)PCR重復(fù)，將3 個(gè)重復(fù)PCR產(chǎn)物混合；使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)物，確定其在250～500 bp有條帶后，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit進(jìn)行回收產(chǎn)物純化，并用QuantusFluorometer對回收產(chǎn)物進(jìn)行檢測定量。

1.3.3.2 高通量測序與數(shù)據(jù)分析

樣本的建庫和測序由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。針對真菌ITS1F_ITS2R區(qū)序列，設(shè)計(jì)帶barcode標(biāo)簽的特異引物，測序平臺為Illumina MiSeq PE300。根據(jù)測序序列barcode和引物區(qū)分樣品，使用Trimmomatic軟件對原始測序序列進(jìn)行質(zhì)控，使用FLASH軟件進(jìn)行拼接。按照獲得的最小樣本序列數(shù)對測序樣品進(jìn)行抽平，使用UPARSE軟件以97%的相似度對抽平后的序列進(jìn)行可操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）聚類，使用UCHIME軟件剔除嵌合體。利用RDP classifier對序列進(jìn)行物種分類注釋，比對Unite數(shù)據(jù)庫（真菌ITS數(shù)據(jù)庫），閾值設(shè)為70%。根據(jù)樣品的OTU及序列關(guān)系，采用Mothur軟件對樣品進(jìn)行多樣性分析，計(jì)算各種物種多樣性指數(shù)，衡量樣本物種多樣性。每個(gè)樣品測定3 個(gè)平行，測序結(jié)果取均值用于下一步分析。

1.3.4 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)檢測

采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜（headspace solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）聯(lián)用技術(shù)檢測分析醬油中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，每個(gè)樣品平行測定3 次。

HS-SPME條件：取壓榨醬油，添加5 μL 0.816 μg/μL 2-甲基-3-庚酮的甲醛溶液作為內(nèi)標(biāo)物，總體積為2 mL，在50 ℃加熱振蕩樣品20 min，萃取頭萃取20 min后進(jìn)樣；GC條件：進(jìn)樣口溫度250 ℃，解吸5 min，程序升溫條件為40 ℃保持4 min，以5 ℃/min升溫至120 ℃，保持2 min，以7 ℃/min升溫至230 ℃，保持2 min，載氣為高純氦氣，載氣流速為1.0 mL/min，不分流進(jìn)樣；MS條件：電子電離源，電子能量為70 eV，發(fā)射電流為200 μA，傳輸線和離子源溫度為250 ℃，離子碎片質(zhì)量掃描范圍為/40～500。

揮發(fā)性化合物定性分析：采用NIST 14譜庫進(jìn)行檢索比對，再根據(jù)保留時(shí)間和標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜比對確定物質(zhì)結(jié)構(gòu)。

揮發(fā)性化合物質(zhì)量濃度計(jì)算如下式所示：

式中：為揮發(fā)性物質(zhì)質(zhì)量濃度/（mg/L）；為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量濃度（0.816 μg/μL）；為揮發(fā)性物質(zhì)峰面積；為內(nèi)標(biāo)物峰面積；為醬油的體積/mL；為添加內(nèi)標(biāo)物的體積/μL。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 22軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，相關(guān)性分析采用雙變量Pearson檢驗(yàn)，顯著性水平設(shè)為5%，Origin 2021繪圖；揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量數(shù)據(jù)經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化處理后，TBtools軟件進(jìn)行熱圖繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 高鹽稀態(tài)醬油發(fā)酵過程中真菌總數(shù)、還原糖、氨基酸態(tài)氮及總酸變化

醬油發(fā)酵中的真菌主要有霉菌及酵母，米曲霉是醬油發(fā)酵的主要菌種，在醬油發(fā)酵過程中起著將蛋白質(zhì)及淀粉降解的作用，而酵母多在醬油發(fā)酵中后期出現(xiàn)，對醬香風(fēng)味有比較重要的貢獻(xiàn)，因此，發(fā)酵過程中存在一定數(shù)量的真菌對于醬油的品質(zhì)有重要的作用。對高鹽稀態(tài)醬油發(fā)酵過程中真菌進(jìn)行計(jì)數(shù)（圖1），結(jié)果顯示，入罐發(fā)酵（0 個(gè)月）時(shí)醬醪樣品的真菌數(shù)量最高，為7.8×10CFU/g（醬醪質(zhì)量計(jì)，下同），隨著發(fā)酵的進(jìn)行，真菌數(shù)量呈下降趨勢，發(fā)酵結(jié)束時(shí)為5.8×10CFU/g，說明隨著發(fā)酵的進(jìn)行，醬醪中的真菌死亡速率高于生長速率。發(fā)酵2～3 個(gè)月，真菌數(shù)量速率趨緩，這時(shí)的醬醪發(fā)酵真菌適應(yīng)了鹽鹵發(fā)酵，生長速率僅略低于死亡速率；而經(jīng)過3～4 個(gè)月的快速下降后，4～6 個(gè)月又出現(xiàn)了真菌數(shù)量的穩(wěn)定，說明在發(fā)酵中后期，耐鹽酵母的生長使醬醪中的真菌數(shù)量達(dá)到了動(dòng)態(tài)平衡。

圖1 高鹽稀態(tài)醬油發(fā)酵過程中真菌總數(shù)變化Fig.1 Variation in the number of fungi during the fermentation of high-salt liquid-state soy sauce

醬油發(fā)酵過程中的糖類物質(zhì)來源于原料中的淀粉降解，糖類物質(zhì)除了為醬油提供甜味外，還是醬油風(fēng)味物質(zhì)的碳架來源，對醬油風(fēng)味物質(zhì)積累及滅菌中的美拉德反應(yīng)極為重要；醬油發(fā)酵過程中的氨基酸類物質(zhì)來源于原料中的蛋白質(zhì)分解，其中谷氨酸、天冬氨酸等是醬油中呈鮮味物質(zhì)的主要來源，也是醬油分級的重要指標(biāo)；醬油發(fā)酵過程中的酸類物質(zhì)是糖類物質(zhì)發(fā)酵的結(jié)果，酸類物質(zhì)能賦予醬油爽口的風(fēng)味、醇厚感及回甜感，還能與醇類物質(zhì)形成酯提升醬油的香氣。醬油發(fā)酵過程中通過分析還原糖、氨基酸態(tài)氮和總酸含量變化考察上述3 類物質(zhì)的變化，因此，還原糖、氨基酸態(tài)氮和總酸可以作為衡量醬油品質(zhì)的重要指標(biāo)，同時(shí)也是監(jiān)控發(fā)酵過程的重要參數(shù)。從圖2可以看出，發(fā)酵1 個(gè)月，還原糖、氨基酸態(tài)氮都出現(xiàn)了較大速率的增長，其中還原糖達(dá)到了峰值47.37 g/L，這是由于在發(fā)酵初期，米曲霉產(chǎn)生的淀粉酶、蛋白酶活性較高，醬醪中其他微生物還未形成優(yōu)勢生長，還原糖及氨基酸態(tài)氮的生成速率大于消耗速率所致；總酸在此階段也出現(xiàn)了較大的增長，其原因是醬醪中耐鹽細(xì)菌開始生長并代謝產(chǎn)生有機(jī)酸。發(fā)酵1 個(gè)月之后，還原糖被微生物消耗利用，含量不斷下降，發(fā)酵結(jié)束時(shí)為17.73 g/L；發(fā)酵3 個(gè)月，氨基酸態(tài)氮已達(dá)到10.45 g/L，隨著微生物對其利用速率的增大，上升趨勢變緩，發(fā)酵結(jié)束時(shí)質(zhì)量濃度為10.72 g/L；還原糖除發(fā)酵生成有機(jī)酸外，還生成醇、醛類物質(zhì)等，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，有機(jī)酸與醇類物質(zhì)酯化，導(dǎo)致了總酸增速減緩，發(fā)酵結(jié)束時(shí)質(zhì)量濃度為21.68 g/L。

圖2 高鹽稀態(tài)醬油發(fā)酵過程中還原糖、氨基酸態(tài)氮及總酸的變化Fig.2 Variation in reducing sugars,amino acid nitrogen,and total acid during the fermentation of high-salt liquid-state soy sauce

2.2 高鹽稀態(tài)醬油發(fā)酵過程中真菌α多樣性變化

復(fù)雜微生物發(fā)酵體系的多樣性研究有利于探明其菌群結(jié)構(gòu)并實(shí)現(xiàn)優(yōu)化。高鹽稀態(tài)醬醪也是一個(gè)多菌種的發(fā)酵體系，真菌在其發(fā)酵過程中對于原料的降解以及主要風(fēng)味物質(zhì)的積累起著比較重要的作用，因此，研究醬醪發(fā)酵體系的真菌多樣性，有利于高鹽稀態(tài)醬油發(fā)酵的優(yōu)化。多樣性分析可以表征微生物群落的豐富度和多樣性。其中覆蓋率是指各樣品文庫的覆蓋率，其數(shù)值越高，則樣本中序列未被檢測出的概率越低；ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)與樣品微生物群落的物種豐富度呈正相關(guān)，可以反映樣品中微生物群落的豐富度；Shannon指數(shù)與樣品微生物群落的物種多樣性呈正相關(guān)，而Simpson指數(shù)與其相反，可以反映樣品中微生物群落的多樣性。6 個(gè)月發(fā)酵周期共計(jì)7 個(gè)樣品的測序數(shù)據(jù)經(jīng)過濾和質(zhì)量控制后，共獲得949 843 條有效序列，按照最小樣本序列數(shù)對所有樣品序列進(jìn)行抽平，以97%的相似度水平對抽平后的序列進(jìn)行OTU聚類，共獲得65 個(gè)OTU，每個(gè)樣品含有的OTU數(shù)及多樣性指數(shù)數(shù)據(jù)如表1所示。

表1 高鹽稀態(tài)醬油發(fā)酵過程中真菌OTU數(shù)及α多樣性Table 1 OTU number and alpha diversity of fungal community during the fermentation of high-salt liquid-state soy sauce

由表1可知，各個(gè)樣品的覆蓋率均達(dá)到了0.999以上，測序樣品數(shù)據(jù)能夠代表醬醪樣品中真菌群落的真實(shí)情況。樣品真菌群落物種豐富度和多樣性方面，ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)呈現(xiàn)發(fā)酵0～1 個(gè)月降低、1～4 個(gè)月升高、4～5 個(gè)月再降低、5～6 個(gè)月重新升高直至最高，說明發(fā)酵過程中醬醪樣品的物種豐富度在波動(dòng)變化中升高，這應(yīng)該是由于隨著醬油發(fā)酵的進(jìn)行，制曲帶入的真菌不適應(yīng)高鹽環(huán)境逐漸消亡而耐鹽真菌開始生長繁殖所致。從Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)看，在發(fā)酵過程中醬醪樣品真菌的物種多樣性呈現(xiàn)0～2 個(gè)月升高、2～4 個(gè)月降低、4～6 個(gè)月再升高的趨勢。結(jié)合圖1中真菌數(shù)量變化，發(fā)酵0～2 個(gè)月，真菌總數(shù)降低，而物種多樣性升高，說明在此階段制曲時(shí)的不耐鹽真菌數(shù)量開始減少，其他的耐鹽真菌開始生長，從而形成了真菌總數(shù)降低、物種多樣性升高的現(xiàn)象；發(fā)酵2～3 個(gè)月，真菌總數(shù)保持平穩(wěn)，物種多樣性降低，說明前期開始生長的耐鹽真菌逐步成為優(yōu)勢菌，而不耐鹽真菌則出現(xiàn)消亡，此消彼長保持了真菌總數(shù)的平穩(wěn)，但物種多樣性降低；發(fā)酵4～6 個(gè)月，真菌總數(shù)保持平穩(wěn)，物種多樣性重新開始升高，說明在此階段耐鹽真菌出現(xiàn)了多樣化，而前期生長的耐鹽真菌數(shù)量下降，從而形成了真菌總數(shù)平穩(wěn)、物種多樣性升高的現(xiàn)象。

2.3 高鹽稀態(tài)醬油發(fā)酵過程中真菌群落結(jié)構(gòu)變化

根據(jù)物種分類注釋結(jié)果，7 個(gè)樣品共獲得30 個(gè)真菌科、44 個(gè)真菌屬，其中S0～S6樣品分別獲得29、8、13、20、11、13 個(gè)和22 個(gè)真菌屬。選取相對豐度較高的9 個(gè)真菌屬繪制物種豐度圖（圖3）。從圖3可以看出，在7 個(gè)醬醪樣品中占據(jù)優(yōu)勢地位的真菌分別為曲霉屬（）、柯達(dá)酵母屬（）、接合酵母屬（），3 個(gè)真菌屬的相對豐度之和均超過了99%。制曲是大量培養(yǎng)米曲霉的工序，成品曲加鹽水入罐發(fā)酵為0月，此時(shí)曲霉屬的相對豐度很高，達(dá)到了93.85%，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，高鹽環(huán)境是曲霉的菌絲萎縮而逐漸消亡，此外在發(fā)酵前期醬醪中的產(chǎn)乳酸細(xì)菌開始增殖并分泌有機(jī)酸，降低了醬醪的pH值，進(jìn)一步促進(jìn)了曲霉屬的消亡。圖中顯示曲霉屬在1～4 個(gè)月占比逐漸降低，分別為82.31%、62.62%、14.28%和0.43%，而4～6 個(gè)月則保持相對穩(wěn)定，這與之前物種多樣性結(jié)果相符。柯達(dá)酵母屬的相對豐度變化呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在0月占比為5.17%，發(fā)酵1～4 個(gè)月占比逐漸增加并達(dá)到最大值，分別為17.60%、37.31%、85.64%和99.50%；發(fā)酵5～6 個(gè)月從99.28%降至20.33%，被中后期生長的耐鹽真菌所取代。柯達(dá)酵母屬被報(bào)道能降解生物胺和生產(chǎn)絮凝劑，從生姜獼猴桃酒醅、腌魚、腐乳等發(fā)酵食品中也有分離，還有研究將其作為污染菌從腐爛的泡菜中分離出，但醬醪中分離出柯達(dá)酵母屬則鮮見報(bào)道。接合酵母屬在0～4 個(gè)月占比較低，相對豐度不超過0.01%，在5～6 個(gè)月開始增長，占比從0.40%迅速增至78.12%。接合酵母屬中的魯氏酵母（）是醬醪中常見的耐鹽酵母，能代謝積累醇類（特別是乙醇），還能通過酯化作用形成多種酯類，豐富醬油的風(fēng)味，常作為生香酵母應(yīng)用于醬油發(fā)酵。在本批發(fā)酵中，接合酵母屬出現(xiàn)較晚，僅在最后一個(gè)月形成了優(yōu)勢生長，不利于醬油在較短的時(shí)間內(nèi)生香并形成成熟的風(fēng)味，因此可以考慮在醬油發(fā)酵中期（3～4 個(gè)月）添加接合酵母以促進(jìn)醬香風(fēng)味的形成并縮短發(fā)酵周期。此外，假絲酵母屬（）在樣品中也少量存在，在發(fā)酵過程中占比均未超過0.3%，有報(bào)道埃切假絲酵母（）對醬油風(fēng)味也有貢獻(xiàn)。

圖3 屬水平物種豐度圖Fig.3 Microbial richness at genus level

2.4 高鹽稀態(tài)醬油發(fā)酵過程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)變化

利用HS-SPME-GC-MS對高鹽稀態(tài)醬油發(fā)酵過程樣品揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行分析（表2），結(jié)果顯示，7 個(gè)樣品共檢測出61 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，其中酯類物質(zhì)14 種，醇類物質(zhì)12 種，酮類物質(zhì)10 種，醛類物質(zhì)8 種，酸類物質(zhì)7 種，酚類物質(zhì)4 種，其他物質(zhì)（吡嗪類物質(zhì)等）6 種。揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)總含量在發(fā)酵0～1 個(gè)月下降，入罐發(fā)酵時(shí)醬醪樣品的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)多來自于原料，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，原料逐漸被降解利用，因此0～1 個(gè)月?lián)]發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量下降；發(fā)酵1～6 個(gè)月總含量逐漸上升，到6 個(gè)月發(fā)酵結(jié)束時(shí)，揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)總質(zhì)量濃度最高，為12 404.15 μg/L。其中醇類物質(zhì)質(zhì)量濃度最多，為8 826.2 μg/L，主要在發(fā)酵5～6 個(gè)月積累，這與接合酵母屬的變化趨勢一致，顯示醇類物質(zhì)的積累與其有密切的關(guān)系；酸類物質(zhì)質(zhì)量濃度位居第二，為2 349.97 μg/L，其積累從發(fā)酵4 個(gè)月開始，在發(fā)酵結(jié)束時(shí)達(dá)到最高，與發(fā)酵過程的總酸趨勢比較一致，與醬醪中的細(xì)菌有關(guān)；醛類物質(zhì)質(zhì)量濃度處于第三，為524.18 μg/L，其積累也是從發(fā)酵5 個(gè)月開始，這與醬醪中的接合酵母屬有關(guān)；本批發(fā)酵酯類、酮類、酚類質(zhì)量濃度不高，分別為324.81、304.34、69.19 μg/L；酯類物質(zhì)含量在發(fā)酵4 個(gè)月達(dá)到最大值，發(fā)酵5 個(gè)月含量驟減，說明酯類物質(zhì)的產(chǎn)生可能與柯達(dá)酵母有關(guān)，而發(fā)酵后期隨著接合酵母形成優(yōu)勢，柯達(dá)酵母逐步減少，接合酵母積累的醇類物質(zhì)也合成了少量酯類，致使發(fā)酵6 個(gè)月，酯類物質(zhì)又出現(xiàn)了小幅升高，但結(jié)束時(shí)總體含量較低；酮類和酚類物質(zhì)的積累也主要在發(fā)酵后期，這些物質(zhì)占比較低，具有一定的豐富醬油香氣的作用。總體看來，本批發(fā)酵揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量不夠均衡，與真菌菌群結(jié)構(gòu)形成明顯的由米曲霉→柯達(dá)酵母→接合酵母的演替有關(guān)，且采用豆粕-小麥為7∶3的原料發(fā)酵，原料中的碳源較少而氮源豐富，導(dǎo)致發(fā)酵前中期酵母類真菌及細(xì)菌生長不利，各類揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的大量積累延遲到了發(fā)酵5～6 個(gè)月。而氨基酸態(tài)氮?jiǎng)t在發(fā)酵3 個(gè)月就已達(dá)到特級醬油的標(biāo)準(zhǔn)（10 g/L），其主要原因是發(fā)酵前3 個(gè)月米曲霉為優(yōu)勢菌。根據(jù)醬油發(fā)酵過程真菌群落結(jié)構(gòu)及揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)變化的研究可以發(fā)現(xiàn)，揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的積累與菌群結(jié)構(gòu)有著密切的關(guān)系，可以通過改變菌群結(jié)構(gòu)達(dá)到優(yōu)化揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的效果。

表2 高鹽稀態(tài)醬油發(fā)酵過程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)變化Table 2 Changes in volatile flavor compounds during the fermentation of high-salt liquid-state soy sauce

2.5 高鹽稀態(tài)醬油發(fā)酵過程中優(yōu)勢真菌與揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)變化的相關(guān)性

進(jìn)一步研究各物質(zhì)與醬醪中真菌菌群的關(guān)系，從檢測到的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)中選取了香氣活性值（odor activity value，OAV）大于1的11 種物質(zhì)，將其含量標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)隨發(fā)酵時(shí)間的變化繪制成熱圖。由圖4可知，對醬油總體風(fēng)味影響較大的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)多在發(fā)酵5、6 個(gè)月生成積累，其中影響較大的醇類物質(zhì)為苯乙醇、3-甲基-1-丁醇、2-甲基-1-丁醇和1-辛烯-3-醇，醛類物質(zhì)為苯甲醛、苯乙醛、3-甲基丁醛、2-甲基丁醛和癸醛，酯類物質(zhì)為乙酸乙酯，酚類物質(zhì)為4-乙基愈創(chuàng)木酚。

圖4 高鹽稀態(tài)醬油發(fā)酵過程中香氣活性值大于1的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量變化Fig.4 Changes in volatile flavor compounds with odor activity over 1 during the fermentation of high-salt liquid-state soy sauce

利用SPSS軟件分析醬醪中優(yōu)勢真菌屬與這些物質(zhì)之間的相關(guān)性。由表3可知，柯達(dá)酵母屬與11 種風(fēng)味物質(zhì)均無顯著相關(guān)性，說明柯達(dá)酵母屬對醬油風(fēng)味沒有明顯促進(jìn)作用，其在醬油發(fā)酵過程中發(fā)揮的作用還有待研究。曲霉屬與1-辛烯-3-醇呈顯著正相關(guān)（＜0.05），1-辛烯-3-醇具有蘑菇的香氣，只在0 個(gè)月樣品中檢測到，另外根據(jù)Zhao Jianxin和Lee等的研究，在添加米曲霉發(fā)酵的豆醬中均檢測到1-辛烯-3-醇，1-辛烯-3-醇可能來源于制曲階段，推測與醬油制曲中的米曲霉代謝有關(guān)。接合酵母屬與苯乙醇、3-甲基-1-丁醇、2-甲基-1-丁醇、苯甲醛、乙酸乙酯等多種物質(zhì)呈顯著正相關(guān)（＜0.05），說明接合酵母屬是醬油發(fā)酵后期的重要菌屬，屬于多種風(fēng)味物質(zhì)的主要產(chǎn)生菌。

表3 優(yōu)勢真菌與主要風(fēng)味成分的相關(guān)性Table 3 Correlation between dominant fungi and major falvor components

醇類物質(zhì)主要由酵母菌經(jīng)過糖酵解途徑或Enrlich途徑產(chǎn)生，在醬油風(fēng)味中占有很大的比重，是醬油中醇香風(fēng)味的主要來源，同時(shí)作為酯化反應(yīng)的前體物質(zhì)對酯類物質(zhì)的形成具有重要的作用。苯乙醇具有玫瑰香氣，是酵母菌降解苯丙氨酸的產(chǎn)物，3-甲基-1-丁醇具有蘋果白蘭地香氣，2-甲基-1-丁醇具有麥芽香，能賦予醬油香氣的濃郁感，與接合酵母屬呈顯著正相關(guān)。小分子醛類物質(zhì)主要是微生物在碳代謝中產(chǎn)生，含量一般較低，但對醬油香氣具有一定調(diào)和作用，可賦予醬油清香、果香和堅(jiān)果香等芳香。苯甲醛具有特殊的杏仁氣味，對構(gòu)成醬香有一定的作用。苯乙醛具有風(fēng)信子、紫丁香樣的香氣，3-甲基丁醛具有蘋果香氣，這兩種風(fēng)味物質(zhì)具有較高的香氣活性值，可由苯乙醇和3-甲基-1-丁醇經(jīng)過氧化脫氫生成，與3 種優(yōu)勢真菌均無顯著相關(guān)性。醬油中的酯類物質(zhì)主要通過由酵母菌產(chǎn)生的酶催化生成，多以乙酯的形式存在，如乙酸乙酯等，在醬油中起著香甜、濃郁而柔和的基底作用，賦予醬油甜香和果香的氣味。酚類物質(zhì)大多具有香氣明顯的特征，對醬油風(fēng)味有較大貢獻(xiàn)，4-乙基愈創(chuàng)木酚是醬油的特征風(fēng)味物質(zhì)，具有典型煙熏氣味，與接合酵母屬呈顯著正相關(guān)，目前沒有研究報(bào)道接合酵母屬直接代謝生成4-乙基愈創(chuàng)木酚，可能是由細(xì)菌或其他酵母代謝積累。酸類物質(zhì)主要由乳酸菌等產(chǎn)酸細(xì)菌生成，可以將發(fā)酵體系轉(zhuǎn)變?yōu)槠岬沫h(huán)境，能在一定程度上抑制雜菌的污染，還可以作為前體物質(zhì)參與酯類的生成。

3 結(jié)論

應(yīng)用Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)研究高鹽稀態(tài)醬油發(fā)酵過程真菌群落結(jié)構(gòu)變化及優(yōu)勢真菌，結(jié)合隨發(fā)酵時(shí)間變化的醬油重要品質(zhì)指標(biāo)還原糖、氨基酸態(tài)氮、總酸及揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量的變化，得出以下結(jié)論：1）高鹽稀態(tài)醬油發(fā)酵過程中檢出44 個(gè)真菌屬，其中曲霉屬為發(fā)酵0～2 個(gè)月的優(yōu)勢真菌；柯達(dá)酵母屬為發(fā)酵3～5 個(gè)月的優(yōu)勢真菌；接合酵母屬在發(fā)酵6 個(gè)月時(shí)占優(yōu)勢地位。2）還原糖含量在發(fā)酵0～1 個(gè)月快速上升，達(dá)到峰值47.37 g/L，隨后質(zhì)量濃度不斷降低，發(fā)酵結(jié)束時(shí)為17.73 g/L；與醬油呈味密切相關(guān)及醬油分級的重要指標(biāo)氨基酸態(tài)氮含量在發(fā)酵0～3 個(gè)月快速上升，隨后增速放緩，發(fā)酵結(jié)束時(shí)為10.72 g/L；總酸含量在發(fā)酵0～3 個(gè)月上升較快，4～6 個(gè)月增速放緩，發(fā)酵結(jié)束時(shí)為21.68 g/L。3）醬油發(fā)酵過程中共分析出61 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，發(fā)酵結(jié)束時(shí)總質(zhì)量濃度為12 404.15 μg/L，其中醇類物質(zhì)和酸類物質(zhì)含量較高；對發(fā)酵優(yōu)勢真菌與揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵后期出現(xiàn)的優(yōu)勢真菌接合酵母屬與多種酯類物質(zhì)、醇類物質(zhì)、醛類物質(zhì)等呈顯著正相關(guān)，對于醬油風(fēng)味的形成具有重要的作用，而發(fā)酵中期的優(yōu)勢真菌柯達(dá)酵母屬則顯示與揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)無顯著相關(guān)性。

高鹽稀態(tài)醬油發(fā)酵過程中真菌群落結(jié)構(gòu)變化及優(yōu)勢真菌與醬油品質(zhì)及風(fēng)味具有比較顯著的相關(guān)性，因此構(gòu)建有益的醬油發(fā)酵真菌群落將有利于提升釀造醬油品質(zhì)。