王瑩雪，樊雨梅，廖 峰，于志鵬

（1.渤海大學食品科學與工程學院，遼寧 錦州 121013；2.國家膠類中藥工程技術研究中心，東阿阿膠股份有限公司，山東 聊城 252201；3.海南大學食品科學與工程學院，海南 ?？?570228）

阿膠是采用馬科動物驢的鮮皮或干皮經(jīng)去毛漂泡、煎煮、濃縮，并加入冰糖、豆油等輔料制成的固體膠，也被稱為驢皮膠，主要成分是膠原蛋白、多肽和硫酸皮膚素，其中蛋白質(zhì)含量較高約為60%～80%。阿膠具有補血止血、增強免疫、抗疲勞、抗衰老、抑制腫瘤、促進骨愈合和滋陰潤肺等作用?，F(xiàn)代藥理研究表明阿膠可能對白血病K562細胞和肺癌PG細胞等癌細胞的生長具有抑制作用，可以抑制荷瘤S180肉瘤小鼠體內(nèi)的腫瘤生長并延長模型小鼠的存活時間。體外細胞實驗證明阿膠酶解物對阿爾茲海默癥（老年癡呆癥）具有改善作用，抑制了神經(jīng)元樣PC12細胞中的乙酰膽堿酯酶（acetyl cholinesterase，AChE）活性，阻止了過氧化氫誘導的AChE異常惡化，提高了淀粉樣蛋白的清除率。

阿膠發(fā)揮主要功效的組分以多肽和蛋白質(zhì)為主，尤其酶解后的小分子阿膠肽分子質(zhì)量在1 000 Da以下，分子質(zhì)量的降低使阿膠具有較好的溶解性，更容易被機體消化吸收，減輕了阿膠的滋膩性，提高了阿膠的生物利用率。另外，樊雨梅等證明了阿膠低聚肽清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基、2,2’-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)陽離子自由基和減輕HO誘導的成纖維細胞氧化損傷的效果優(yōu)于阿膠。因此，從分子質(zhì)量低于1 000 Da的阿膠多肽中篩選降壓肽、抗老年癡呆肽和抗腫瘤肽等活性肽具有重要的商業(yè)價值和應用前景。

本研究利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）技術分離鑒定阿膠模擬胃腸道消化產(chǎn)物中活性肽的結(jié)構(gòu)，重點圍繞六肽、七肽和八肽與受體靶標進行分子對接，篩選具有降血壓、抗腫瘤和抗老年癡呆活性的阿膠肽。本研究將有助于揭示阿膠發(fā)揮多種生物活性的組分及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

阿膠（批號：1502004） 東阿阿膠股份有限公司。

純水、乙腈、甲酸、三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）（均為質(zhì)譜純） 美國Fisher Scientific公司；碳酸氫銨（生化純） 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

10 kDa超濾管（Amicon ultra,Centrigμgal Filter） 德國Merck Millipore公司；EASY-nLC 1000超高壓納升級液相色譜儀、Orbitrap Fusion質(zhì)譜儀、納升級肽段分析柱（Acclaim PepMap C，75 μm×250 mm） 美國Thermo Scientific公司；alpha1-2LD冷凍干燥機 德國Christ公司；制冰機 日本松下公司；sep-Pak C除鹽柱（100 mg） 美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 消化液的配制

根據(jù)2015版《中國藥典》規(guī)定的方法，取5 mL鹽酸（12 mol/L）加水至19 mL配制成稀鹽酸，取0.82 mL稀鹽酸，加約40 mL水和0.5 g胃蛋白酶，搖勻使其充分溶解，調(diào)節(jié)pH值至1.3，加水定容至50 mL，制成人工胃液。取0.34 g磷酸二氫鉀，加25 mL水使其溶解，用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至6.8，另外稱取0.5 g胰蛋白酶加適量水溶解，兩液混合后，加水定容至50 mL，制成人工腸液。

1.3.2 阿膠胃腸道消化產(chǎn)物的制備

取2 g阿膠粉末溶于50 mL 60 ℃熱水中，稱取10 mL放入圓底燒瓶中，加入10 mL人工胃液，封口，置于37 ℃恒溫振蕩水浴鍋內(nèi)水浴2 h。胃液消化結(jié)束后，用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至6.8，加入20 mL人工腸液，繼續(xù)恒溫攪拌4 h。消化結(jié)束后，將混合溶液進行冷凍干燥，收集固體粉末避光保存。

1.3.3 阿膠活性肽的分離

取120 mg模擬胃腸道消化后的阿膠固體粉末溶于1 mL 1%甲酸溶液中，冰上超聲10 min使其充分裂解。隨后4 ℃、20 000×離心30 min取上清液。吸取400 μL上清液使用10 kDa超濾管超濾（10 000×）至40 μL，收集濾液得到阿膠活性肽溶液。

1.3.4 阿膠活性肽的除鹽

首先用含0.1% TFA和80%乙腈的水溶液200 μL活化除鹽柱，再用含0.1% TFA和1%乙腈的水溶液400～600 μL平衡除鹽柱。將阿膠活性肽溶液緩慢流過平衡后的除鹽柱收集多肽，鹽等其他非疏水性小分子流出。加入含0.1% TFA和0.5%乙腈的水溶液200 μL清洗除鹽柱，洗去殘留鹽類。最后，用含0.1% TFA和80%乙腈的水溶液300 μL將除鹽柱中的多肽洗脫下來，洗脫液收集到EP管中冷凍干燥。

1.3.5 阿膠活性肽的LC-MS/MS分析

1.3.5.1 LC條件

流動相：A為0.1%甲酸溶液，B為0.1%甲酸-乙腈溶液。進樣量2 μL，上樣流速500 nL/min，分離流速300 nL/min。梯度洗脫條件：0～105 min，95%～70% A、5%～30% B；105～110 min，70%～10% A、30%～90% B；110～112 min，10% A、90% B；112～113 min，10%～95% A、90%～5% B；95% A、5% B保持7 min。

1.3.5.2 MS條件

離子源噴霧電壓2.2 k V，加熱毛細管溫度320 ℃，在MS和MS/MS間切換采集。全掃描MS：掃描范圍/400～1600，掃描分辨率120000（/200處），離子最大引入時間50 ms，自動增益控制（automatic gain control，AGC）設定為1.0×10。MS/MS：掃描分辨率15 000，掃描范圍/110～2 000，最低離子強度50 000，離子最大引入時間100 ms，AGC設定為1.0×10，母離子選擇設定為1.6 Da。

1.3.6 Proteome Discoverer軟件搜庫定性分析

通過Proteome Discoverer（version 2.4.0.305）軟件應用Sequest HT搜索引擎對質(zhì)譜原始文件（raw文件）進行搜索。檢索參數(shù)：無固定修飾，可變修飾為甲硫氨酸氧化、蛋白N端乙?；灰患壻|(zhì)譜精度1.0×10，二級質(zhì)譜精度0.02 Da；Uniprot數(shù)據(jù)庫Equus asinus（Mnemonic:EQUAS）種屬；肽段及蛋白假陽性率≤1%；肽段最少包含6 個氨基酸。

1.3.7 阿膠源活性肽的活性篩選

通過RCSB PDB數(shù)據(jù)庫獲得降血壓靶標血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（angiotensin converting enzyme，ACE），抗老年癡呆靶標AChE、丁酰膽堿酯酶（butyrylcholinesterase，BChE）、-淀粉樣前體蛋白裂解酶1（-site amyloid precursor protein cleavage enzyme 1，BACE1）和抗腫瘤靶標氨肽酶N（aminopeptidase N，APN）的X射線晶體結(jié)構(gòu)。通過Discovery Studio（DS）2017 R2（Dassault Systemes Biovia,San Diego,CA,USA）軟件對受體靶標去除水分子、添加氫原子后，在“Receptor-Ligand Interactions”模塊中定義其活性中心，活性中心（,,）及對接半徑（）信息見表1。通過DS軟件的“Macromolecules”模塊繪制肽的結(jié)構(gòu)，利用“Minimize Ligands”和“Prepare Ligands”工具在CHARMm力場下對肽的結(jié)構(gòu)進行能量優(yōu)化。通過“Receptor-Ligand Interactions”模塊的“CDOCKER”工具對受體和肽進行分子對接，根據(jù)－CDOCKER_Energy值分別篩選潛在降血壓、抗老年癡呆和抗腫瘤效果較好的活性肽。

表1 受體靶標的活性中心及對接半徑Table 1 Active centers and docking radia of receptor targets

2 結(jié)果與分析

2.1 阿膠模擬胃腸道消化產(chǎn)物中活性肽的結(jié)構(gòu)鑒定

對阿膠模擬胃腸道消化產(chǎn)物中的活性肽進行質(zhì)譜分析和搜庫定性分析。結(jié)果顯示，全部譜圖數(shù)為65 813 個，數(shù)據(jù)庫中能匹配到的譜圖數(shù)有2 015 個，共鑒定到519 種阿膠活性肽。MS分析結(jié)果顯示，檢測到的肽段氨基酸數(shù)目在6～33 個之間，分子質(zhì)量分布在661.4～2 851.4 Da之間，共來源于8 種蛋白，大部分肽段是驢源膠原蛋白和血紅蛋白的酶解產(chǎn)物。其中有248 種肽來自驢源I型膠原蛋白-1鏈（138.9 kDa），有198 種肽來自驢源I型膠原蛋白-2鏈（128.6 kDa），有43 種肽來自驢源血紅蛋白亞基（15.2 kDa），有23 種肽來自驢源血紅蛋白鏈（16 kDa），有3 種肽來自驢源巨噬細胞移動抑制因子（12.4 kDa），有1 種肽來自驢源細胞色素C氧化酶亞基II（26 kDa），有1 種肽來自驢源甘油醛-3-磷酸脫氫酶（片段）（8.8 kDa），還有2 種肽來自驢源白蛋白（68.5 kDa）。肽匹配圖譜（peptidespectrum matches，PSMs）值越大表示肽段在阿膠中的相對含量越高，PSMs≥21的肽段共有13 個，其氨基酸序列、PSMs、分子質(zhì)量及其所屬蛋白的檢測信息見表2?？梢娤鄬孔罡叩碾亩问荌SVPGPMGPSGPR（甲硫氨酸氧化修飾），其次為SGDRGEAGPAGPAGPIGPVGAR和ISVPGPMGPSGPR，這3 種肽段是阿膠多肽中的主要肽段，其二級譜圖見圖1。

表2 消化后的阿膠活性肽的質(zhì)譜鑒定結(jié)果Table 2 Mass spectrometric identification of active peptides from digested Ejiao

圖1 ISVPGPMGPSGPR（甲硫氨酸氧化修飾）（a）、SGDRGEAGPAGPAGPIGPVGAR（b）和ISVPGPMGPSGPR（c）的二級譜圖Fig.1 Secondary mass spectra of ISVPGPMGPSGPR(1×Oxidation[M7]) (a),SGDRGEAGPAGPAGPIGPVGAR (b),and ISVPGPMGPSGPR (c)

SGQPGTVGPAGVR是馬科動物（馬、驢及其雜種）皮相比于牛皮和豬皮所特有的標記肽，在本研究中被鑒定出來；GASGPAGVR是馬和雜種相比于驢的皮中所特有的標記肽，在本研究中沒有被鑒定出來，與先前的研究一致。阿膠消化后的活性肽中含有蘇氨酸（Thr）、纈氨酸（Val）、甲硫氨酸（Met）、異亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、苯丙氨酸（Phe）、賴氨酸（Lys）和色氨酸（Trp）8 種人體必需氨基酸，與前人的研究一致。多肽的疏水性有助于增強其抗氧化特性，多肽中疏水性氨基酸含量越高，其抗氧化作用越強。在519 種阿膠活性肽中，有515 種肽含有Phe、Val、Leu、Ile、丙氨酸（Ala）、脯氨酸（Pro）、Trp和Met中的一種或幾種，這些疏水性氨基酸有可能增強阿膠的抗氧化能力。

2.2 阿膠源活性肽的ACE抑制活性的篩選

在55 個六肽、七肽和八肽中，有42 個阿膠活性肽可與降血壓靶標ACE發(fā)生不同程度的結(jié)合，具有潛在的ACE抑制活性。對接結(jié)果中的－CDOCKER_Energy值代表受體與配體之間的結(jié)合親和力，該值越高則表示受體與配體的結(jié)合親和力越高，即結(jié)合得越容易、越緊密。與ACE結(jié)合的－CDOCKER_Energy值最高的3 個肽依次為KGETGLR（193.40 kcal/mol）、TGEQGDR（176.23 kcal/mol）和VQLSGEEK（172.73 kcal/mol），可以作為ACE抑制劑的候選物，其中KGETGLR是最具潛力的降壓肽，其與ACE的相互作用見圖2。ACE主要有3 個活性口袋：S1（Ala354、Glu384和Tyr523）、S2（Gln281、His353、His513、Lys511和Tyr520）和S1’（Glu162）。KGETGLR、TGEQGDR和VQLSGEEK均通過吸引電荷和氫鍵相互作用與ACE殘基Glu376和Asp377結(jié)合并形成鹽橋，通過氫鍵相互作用與ACE殘基His353、Glu384、Gln281和Ala356結(jié)合。因此，殘基His353、Glu384和Gln281是促使阿膠肽與受體ACE緊密結(jié)合的關鍵氨基酸，氫鍵相互作用和靜電相互作用（鹽橋、吸引電荷相互作用）在阿膠肽與ACE的結(jié)合中起著關鍵作用，與文獻報道的研究結(jié)論相似。

圖2 KGETGLR-ACE相互作用2D圖（a）和3D圖（b）Fig.2 Two-dimensional (a) and 3D diagram (b) of the interaction between KGETGLR and ACE

2.3 阿膠源活性肽的抗老年癡呆活性的篩選

在5 5 個六肽、七肽和八肽與抗老年癡呆靶標AChE、BChE和BACE1的分子對接結(jié)果中，有23 個肽與受體AChE對接成功，有41 個肽與受體BACE1對接成功，其中22 個均可與AChE和BACE1發(fā)生不同程度結(jié)合的阿膠活性肽具有抗老年癡呆活性的可能性更大。在這22 個多肽中，SGLDGAKG、NGLTGAK和GNIGPAGK是與AChE和BACE1 結(jié)合的－CDOCKER_Energy 值綜合 最高的3 個肽，其與A ChE 結(jié)合的－CDOCKER_Energy值分別是143.17、126.23 kcal/mol和124.79 kcal/mol，與BACE1結(jié)合的－CDOCKER_Energy 值分別是134.24、129.11kcal/mol和111.38 kcal/mol，可以作為抗老年癡呆藥物的候選物。其中SGLDGAKG是最具潛力的抗老年癡呆肽，其與AChE和BACE1的相互作用分別見圖3、4。

圖3 SGLDGAKG-AChE相互作用2D圖（a）和3D圖（b）Fig.3 Two-dimensional (a) and 3D diagram (b) of the interaction between SGLDGAKG and AchE

AChE的活性中心包括外圍陰離子位點（Tyr70、Asp72、Tyr121、Trp279、Tyr334）和催化位點（Trp84、Gly118、Gly119、Ala201、Tyr130、His440、Ser200、Glu327、Tyr330、Phe331），其中芳香族殘基Trp279和Trp84發(fā)揮關鍵作用。SGLDGAKG、NGLTGAK和GNIGPAGK均通過吸引電荷和氫鍵相互作用與AChE殘基Glu199結(jié)合并形成鹽橋，通過氫鍵相互作用與AChE殘基Tyr121結(jié)合；另外，SGLDGAKG通過π-烷基與A ChE 殘基Trp 279 結(jié) 合，NGLTGAK 和GNIGPAGK均通過π-陽離子與AChE殘基Trp84結(jié)合。因此，Tyr121、Trp279和Trp84是促使阿膠肽與受體AChE緊密結(jié)合的關鍵氨基酸，氫鍵相互作用和靜電相互作用（鹽橋、吸引電荷相互作用、π-陽離子）在阿膠肽與AChE的結(jié)合中起著關鍵作用，與文獻報道的研究結(jié)論相似。

已有研究表明，Asp32和Asp228是BACE1的活性催化中心。SGLDGAKG、NGLTGAK和GNIGPAGK均通過吸引電荷相互作用與BACE1殘基Lys321結(jié)合并形成鹽橋，通過吸引電荷和氫鍵相互作用與BACE1殘基Asp228結(jié)合并形成鹽橋，通過氫鍵相互作用與BACE1殘基Thr231和Gly230結(jié)合。另外，殘基Asp32可通過氫鍵相互作用與SGLDGAKG結(jié)合，通過吸引電荷和氫鍵相互作用與NGLTGAK結(jié)合并形成鹽橋，但并未與GNIGPAGK產(chǎn)生相互作用，這可能是GNIGPAGK與BACE1結(jié)合的－CDOCKER_Energy值比SGLDGAKG和NGLTGAK小的原因。因此，殘基Lys321、Asp228、Thr231、Gly230和Asp32可能在阿膠肽與受體BACE1的緊密結(jié)合中起著重要作用，同樣氫鍵相互作用和靜電相互作用（鹽橋、吸引電荷相互作用）是阿膠肽與BACE1結(jié)合的主要作用力，與文獻報道的結(jié)論相似。

圖4 SGLDGAKG-BACE1相互作用2D圖（a）和3D圖（b）Fig.4 Two-dimensional (a) and 3D diagram (b) of the interaction between SGLDGAKG and BACE1

2.4 阿膠源活性肽的抗腫瘤活性的篩選

在55 個六肽、七肽和八肽中，有10 個阿膠活性肽可與抗腫瘤靶標APN發(fā)生不同程度的結(jié)合，分別是ANGLTGAK（146.52 kcal/mol）、TGEQGDR（144.63 kcal/mol）、NGLTGAK（132.21 kcal/mol）、ADGVAGPK（123.17 kcal/mol）、MGLMGPR（107.10 kcal/mol）、PAGPTGAR（103.43 kcal/mol）、ASGPAGPR（99.50kcal/mol）、PQGVQGGK（89.95 kcal/mol）、PAGPAGPR（78.39 kcal/mol）和ASGPMGPR（75.25 kcal/mol），具有潛在的抗腫瘤活性，可以作為抗腫瘤藥物的候選物。

APN的活性位點由3 個口袋組成：S1（Glu355、His388）、S1’（Glu411、His392、Tyr477）和S2’。雖然ANGLTGAK、TGEQGDR和NGLTGAK與APN結(jié)合的－CDOCKER_Energy值最高，但是ANGLTGAK與殘基Arg381和His388發(fā)生不利的供體-供體沖突，TGEQGDR與殘基Glu411發(fā)生不利的受體-受體沖突，NGLTGAK僅與APN活性口袋中的殘基Glu355和Glu411產(chǎn)生吸引電荷相互作用和形成鹽橋。而ADGVAGPK不僅可與APN活性口袋中的殘基Glu355和Glu411產(chǎn)生吸引電荷相互作用和形成鹽橋，與APN活性口袋中的殘基His388和Tyr477產(chǎn)生π-烷基相互作用，另外還可與APN殘基Glu389產(chǎn)生吸引電荷相互作用并形成鹽橋，與APN殘基Arg381、Ala351、Gly352、Gln213、Ala353、Met354、Asn350、Asn900、Ser895和Ser897產(chǎn)生氫鍵相互作用（圖5）。因此，ADGVAGPK是阿膠模擬胃腸道消化產(chǎn)物中最具潛力的抗腫瘤肽，殘基Glu355、Glu411、His388和Tyr477是促使阿膠肽與受體APN緊密結(jié)合的關鍵氨基酸，同樣氫鍵相互作用、靜電相互作用（鹽橋、吸引電荷相互作用）和疏水相互作用（π-烷基）在阿膠肽與APN的結(jié)合中起著關鍵作用，與文獻報道的研究結(jié)論相似。

圖5 ADGVAGPK-APN相互作用2D圖（a）和3D圖（b）Fig.5 Two-dimensional (a) and 3D diagram (b) of the interaction between ADGVAGPK and APN

3 結(jié)論

本研究利用LC-MS/MS技術從阿膠模擬胃腸道消化產(chǎn)物中分離鑒定出519 種活性肽，其分子質(zhì)量均分布在661.4～2 851.4 Da之間，富含人體必需氨基酸和疏水性氨基酸，大多來源于驢源膠原蛋白和血紅蛋白，其中相對含量最高的肽段是ISVPGPMGPSGPR。利用分子對接技術對阿膠模擬消化產(chǎn)物中的六肽、七肽和八肽進行活性篩選，篩選出了最具潛力的降壓肽KGETGLR、抗老年癡呆肽SGLDGAKG和抗腫瘤肽ADGVAGPK。氫鍵相互作用和靜電相互作用（鹽橋、吸引電荷相互作用）在阿膠多肽的降血壓、抗老年癡呆和抗腫瘤活性中都起著至關重要的作用。本研究為開發(fā)阿膠肽粉、阿膠肽膏、阿膠多肽含片、阿膠多肽膠囊、阿膠多肽沖劑、阿膠多肽口服液等一系列具有降血壓、抗老年癡呆和抗腫瘤功效的阿膠活性肽保健品提供了理論依據(jù)。