付 勛,張海彬,聶青玉,馮婷婷,劉 丹,張 艷,李 翔
(1.重慶三峽職業(yè)學(xué)院,重慶 404155;2.重慶市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全中心,重慶 400070)
獼猴桃,又稱奇異果,俗稱羊桃,獼猴桃科獼猴桃屬落葉藤本株。獼猴桃富含糖、酸、黃酮及酚類等多種營養(yǎng)物質(zhì)成分,其中VC含量較大部分水果高,作為天然可食營養(yǎng)物質(zhì)具有重要作用。目前,獼猴桃主要有綠心、黃心和紅心3 個(gè)品種,其中紅心品種最少,且價(jià)格相對較高。獼猴桃果肉橫切面為以中軸為中心呈放射狀生長,色澤鮮美,口感極佳。相關(guān)研究表明,果實(shí)的品質(zhì)受品種、環(huán)境氣候等因素影響。目前對獼猴桃果實(shí)品質(zhì)特征分析主要比較達(dá)到一定成熟度果實(shí)的外觀(單果質(zhì)量、橫縱徑等)、出汁率、可溶性固形物、總糖、可滴定酸、VC及總酚等含量,再通過模糊數(shù)學(xué)綜合評判、主成分分析(principal component analysis,PCA)、聚類分析等進(jìn)行綜合評價(jià),但結(jié)合分析果汁揮發(fā)性成分,綜合比較果實(shí)品質(zhì)差異鮮見相關(guān)研究。果汁揮發(fā)性物質(zhì)分析常規(guī)方法有氣相色譜-質(zhì)譜技術(shù)、頂空固相微萃取法并結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜技術(shù)等,近年來應(yīng)用頂空氣相色譜離子遷移譜(gas chromatography-ion mobility spectrometry,GC-IMS)技術(shù)測定果蔬、肉制品及酒類等揮發(fā)性成分有相關(guān)報(bào)道。本研究以3 個(gè)紅心獼猴桃品種(紅陽、東紅和萬州紅心)、一個(gè)黃心獼猴桃品種(金艷)為研究對象,通過比較果實(shí)外觀指標(biāo)及主要品質(zhì)指標(biāo),同時(shí)采用GC-IMS對果汁揮發(fā)性成分分析,通過PCA法、指紋圖譜、聚類分析等方法分析不同品種揮發(fā)性物質(zhì)特征差異及相似度,綜合比較果實(shí)品質(zhì)差異性,為果實(shí)的深加工提供理論基礎(chǔ)。
金艷、紅陽、東紅及萬州紅心共4 個(gè)獼猴桃品種,其中紅陽、東紅及萬州紅心為紅心品種,金艷為黃心品種;均為市購。
沒食子酸(分析純) 天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司;福林-酚試劑 上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;無水乙醇、草酸、抗壞血酸、酚酞、鄰苯二甲酸氫鉀、碳酸鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、2,6-二氯酚靛酚、鎢酸鈉、磷鉬酸、HPO、NaCO均為國產(chǎn)分析純。
榨汁機(jī) 九陽股份有限公司;CP-214電子天平奧豪斯儀器(上海)有限公司;PUS-3C pH計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;2WAJ阿貝折光儀 上海光學(xué)儀器廠;B-220恒溫水浴鍋 上海亞榮生化儀器廠;GNP-9160BS-III隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海圣科儀器設(shè)備有限公司;FlavourSpec? GC-IMS聯(lián)用儀 德國G.A.S.公司。
1.3.1 樣品采集及保存
所有品種樣品檢查,去除壞果、異型果,放入冷庫進(jìn)行貯藏(4 ℃),所有品種提前取出,自然放置至果實(shí)成熟(果肉硬度:1.0~1.5 kg/cm)時(shí)測定各指標(biāo)。
1.3.2 獼猴桃各品質(zhì)指標(biāo)測定
外觀、果肉及果心描述:參照張維等方法對果實(shí)外觀形狀及內(nèi)部橫切面形態(tài)進(jìn)行描述;單果質(zhì)量:采用電子天平稱質(zhì)量,隨機(jī)挑選20 顆果實(shí)稱質(zhì)量,求平均值;果形指數(shù):采用游標(biāo)卡尺測20 顆果實(shí)橫徑、縱徑,果形指數(shù)=果實(shí)縱徑/果實(shí)橫徑;出汁率:隨機(jī)挑取5 顆果實(shí),去皮、果汁機(jī)破碎,無菌紗布過濾出果汁稱質(zhì)量,測定其出汁率;可溶性固形物、總糖、pH值、可滴定酸、VC含量測定,參照文獻(xiàn)[17]方法測定;總酚含量:采用Folin-Ciocalteu分光光度測定;黃酮含量:采用Al(NO)-NaNO-NaOH顯色法測定;花色苷含量:采用pH示差法;單寧含量:參照NY/T 1600—2008《水果、蔬菜及其制品中單寧含量的測定 分光光度法》測定。
1.3.3 獼猴桃中揮發(fā)性物質(zhì)分析測定
采用GC-IMS聯(lián)用技術(shù)測定,取無菌紗布過濾后的果汁2 g,置于20 mL頂空瓶中,40 ℃孵育15 min后進(jìn)樣700 μL。
GC-IMS條件:分析時(shí)間20 min,MXT-5色譜柱(15 m×0.53 mm),柱溫60 ℃,載氣/漂移氣為N,IMS溫度45 ℃。
自動(dòng)頂空進(jìn)樣條件:進(jìn)樣體積700 μL,孵育時(shí)間15 min,孵育溫度40 ℃,進(jìn)樣針溫度85 ℃,孵化轉(zhuǎn)速500 r/min。
不同獼猴桃樣品中揮發(fā)性物質(zhì)分析:采用FlavourSpec?風(fēng)味分析儀配套的VOCal軟件內(nèi)置的NIST2014數(shù)據(jù)庫和IMS數(shù)據(jù)庫對物質(zhì)定性分析;通過Reporter插件對比樣品之間的譜圖差異(二維俯視圖、三維譜圖和差異譜圖);通過Gallery Plot插件指紋圖譜對比,定量比較不同樣品間揮發(fā)性有機(jī)物差異;通過Dynamic PCA插件(動(dòng)態(tài)PCA和相似度分析圖),用于樣品聚類分析和相似度分析;通過“最近鄰”指紋分析,計(jì)算樣本間的歐式距離,檢索最小距離找到“最近鄰”,觀察與更遠(yuǎn)的群體相比,相對緊密的群體測量結(jié)果。
采用SPSS 23.0數(shù)據(jù)處理軟件,對獼猴桃指標(biāo)進(jìn)行PCA和樣品聚類分析。數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后,以獼猴桃檢測指標(biāo)相對含量矩陣為數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,得到PC的特征根值和特征向量。以獼猴桃指標(biāo)累計(jì)貢獻(xiàn)率大于85%,確定PC個(gè)數(shù)以及各PC中因子。根據(jù)PC特征向量和方差貢獻(xiàn)率得出獼猴桃果實(shí)指標(biāo)綜合評價(jià)模型,計(jì)算出不同品種獼猴桃綜合得分,同時(shí)結(jié)合聚類分析對4 個(gè)獼猴桃品種進(jìn)行分類。采用Origin Pro 2021軟件進(jìn)行繪圖,對數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA與聚類分析。
2.1.1 不同品種獼猴桃感官品質(zhì)分析獼猴桃外觀形態(tài)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)的鑒別主要從形狀、絨毛、色澤等進(jìn)行外部鑒別,從色澤、果心柱及籽等結(jié)構(gòu)進(jìn)行品種區(qū)分,從圖1和表1可看出,金艷較易區(qū)別,外觀形狀近橢圓、臍部稍尖,其余3 個(gè)品種形狀相似,都為近橢圓;外觀色澤上,金艷為黃褐色,與其他3 個(gè)品種存在明顯差異,東紅在色澤上較另2 個(gè)品種深;4 個(gè)品種均有細(xì)短、密集絨毛,差異不明顯;果心內(nèi)部結(jié)構(gòu)上,3 個(gè)紅心品種中,萬州紅心獼猴桃紅心分布區(qū)域較寬,顏色較深;4 個(gè)品種中,果心柱存在明顯區(qū)別,金艷呈近圓形,東紅為近三角分布,紅陽為細(xì)長形,萬州紅心獼猴桃為近橢圓狀,且4 個(gè)品種均以果心柱為中心呈放射狀,紅心品種較黃心品種籽多。
圖1 不同品種獼猴桃外觀及內(nèi)部形態(tài)比較Fig.1 Observation of appearance and cross-section of different varieties of kiwifruit
表1 不同品種獼猴桃形態(tài)比較Table 1 Comparison of appearance,cross-sectional morphology,and fruit traits of different varieties of kiwifruit
2.1.2 不同品種獼猴桃品質(zhì)分析
精選紅陽、金艷、萬州紅心及東紅4 個(gè)品種,在相同實(shí)驗(yàn)條件下,對比不同品種的出汁率、可溶性固形物、總糖、pH值、可滴定酸及果肉色澤等指標(biāo),由表2可知,4 個(gè)品種各品質(zhì)間的差異顯著性,金艷出汁率最高,但東紅、金艷及萬州紅心品種出汁率差異不大,紅陽出汁率最低,果酒釀造過程中,果汁的出汁率對果酒釀造過程中出酒量等具有重要影響,可通過酶解等措施進(jìn)一步優(yōu)化工藝條件;其次,4 個(gè)品種可溶性固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10.30%~15.94%,總糖質(zhì)量濃度為90.36~103.26 g/L,其中以紅心品種含量較高,紅心品種中,萬州紅心獼猴桃含量最高,水果含糖量是另一影響果酒釀造的重要條件,是酵母代謝的重要碳源,發(fā)酵產(chǎn)生酒精及能量物質(zhì)等,同時(shí)也是形成果酒中風(fēng)味物質(zhì)的前體;4 個(gè)品種pH值在3.40~3.82之間,可滴定酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.73%~0.91%,4 個(gè)品種中,紅心品種可滴定酸較黃心品種略低,但差異不明顯,酸類物質(zhì)是果酒中酯類形成的前體,也是形成果酒風(fēng)味的重要物質(zhì);4 個(gè)品種,萬州紅心VC含量達(dá)到81.37 mg/100 g,遠(yuǎn)高于其他3 個(gè)品種,黃心品種VC較紅心品種低。4 個(gè)品種總酚含量為90.25~181.62 mg/100 g,花色苷含量為16.13~71.70 mg/kg,均為萬州紅心含量最高,金艷含量最低;黃酮含量為46.07~71.20 mg/100 g,萬州紅心含量較高,東紅含量較低;單寧含量為70.76~101.02 mg/100 g,金艷含量最高,萬州紅心和東紅含量相對較低,但差異不顯著。
表2 不同品種獼猴桃品質(zhì)指標(biāo)比較Table 2 Comparison of physicochemical properties of different varieties of kiwifruit
2.2.1 獼猴桃果實(shí)指標(biāo)數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化
獼猴桃測定的總酚等12 個(gè)指標(biāo)單位及量程的差異,需對12 個(gè)指標(biāo)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理,采用SPSS對果實(shí)各項(xiàng)測定指標(biāo)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理,數(shù)據(jù)見表3,標(biāo)準(zhǔn)化處理后得數(shù)據(jù)可進(jìn)行PCA和聚類分析。
表3 獼猴桃果實(shí)指標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)Table 3 Standardized data for quality indexes of kiwifruit
2.2.2 PCA結(jié)果
由表4可知,特征值大于1的PC有2 個(gè),這2 個(gè)PC的累計(jì)方差貢獻(xiàn)率達(dá)到93.483%,故選取前2 個(gè)PC,可反映4 種獼猴桃果實(shí)指標(biāo)的大部分信息。
表4 方差貢獻(xiàn)率Table 4 Contribution rates to total variance of principal components
由圖2A可知,紅陽和萬州紅心在PC1上較接近,東紅和萬州紅心在PC2上較接近,金艷在PC1和PC2上與東紅、紅陽和萬州紅心3 個(gè)品種距離較遠(yuǎn)。因此,金艷與其他3 個(gè)品種可分為2 類。由圖2B可知,單果質(zhì)量、可滴定酸、單寧、果型指數(shù)、可溶性固形物、花色苷、總糖、VC、pH值、總酚等在PC1上具有較高的載荷,說明其相關(guān)性較高。在PC2上,出汁率指標(biāo)具有較高載荷,說明PC2主要受該指標(biāo)影響。因此,以紅陽、東紅和萬州紅心因其花色苷、VC、總酚等相對含量較高的品種分為一類,以單寧含量相對較高的金艷品種分為一類。
圖2 獼猴桃果實(shí)PC分類圖(A)和指標(biāo)載荷矩陣圖(B)Fig.2 PCA plot showing classification of different varieties of kiwifruit (A) and loading plot of quality indexes of kiwifruit (B)
由表5可知,PC1中對果實(shí)產(chǎn)生正向影響的有總糖、pH值、VC、總酚和花色苷。其中,載荷數(shù)較大的有總酚、VC、pH值和總糖,數(shù)值分別為1.000、0.992、0.980、0.900。因?yàn)榭偡?、VC和花色苷等都屬于抗氧化性物質(zhì),因此PC1含量高的獼猴桃品種具有極強(qiáng)的抗氧化特性。載荷較高但對PC1產(chǎn)生負(fù)向影響的指標(biāo)有可滴定酸、單果質(zhì)量、果形指數(shù)和單寧,數(shù)值分別為-0.997、-0.951、-0.946、-0.890。
表5 獼猴桃果實(shí)指標(biāo)的PC載荷矩陣Table 5 Principal component loading matrix of quality indexes of kiwifruit
對PC2產(chǎn)生正向影響的指標(biāo)為獼猴桃出汁率,載荷數(shù)為0.870。含糖量和出汁率等都是影響果酒等發(fā)酵的重要因素,可選擇糖分及出汁率相對較高品種用于果酒發(fā)酵。
2.2.3 4 種獼猴桃果實(shí)綜合評價(jià)
通過求特征向量系數(shù)值構(gòu)建兩個(gè)PC的函數(shù)表達(dá)式,可得2 個(gè)函數(shù)表達(dá)式:
=-0.129+0.273+0.296+0.322+0.326+0.329+0.279+0.197-0.292-0.313-0.311-0.328
=0.622+0.324+0.309-0.143-0.032-0.021+0.302-0.474-0.031+0.216-0.156+0.053
式中:、分別代表PC1、PC2的特征向量權(quán)重值;為結(jié)合型出汁率、為可溶性固形物、為總糖、為pH值、為VC、為總酚、為花色苷、為黃酮、為單寧、為單果質(zhì)量、為果形指數(shù)、為可滴定酸。由方差貢獻(xiàn)率和PC函數(shù)表達(dá)式可得到綜合評價(jià)函數(shù)可得:=0.77+0.16。
根據(jù)PC綜合評價(jià)函數(shù)值可知4 個(gè)品種獼猴桃的綜合得分和排序結(jié)果見表6,綜合得分在前3 位的獼猴桃是萬州紅心、紅陽和東紅,為3 個(gè)紅心獼猴桃品種。
表6 不同品種獼猴桃PCA綜合得分Table 6 Scores of principal components of different kiwifruit varieties
2.2.4 4 種獼猴桃品種聚類分析
對4 個(gè)獼猴桃品種各項(xiàng)品質(zhì)指標(biāo)進(jìn)行聚類分析,結(jié)果如圖3所示。黃酮、總酚、VC、pH值、花色苷、總糖及可溶性固形物指標(biāo)先聚為1類。其中總酚和VC、pH值、可溶性固形物和總糖、花色苷首先聚為1類,再與黃酮聚為1類,能先聚集在一起的指標(biāo)之間相關(guān)性較強(qiáng),其中黃酮、總酚、VC及花色苷等都是獼猴桃中重要的抗氧化成分。4 個(gè)獼猴桃品種聚類2類,其中東紅、萬州紅心和紅陽聚為1類,金艷聚為1類,這一結(jié)果與PCA結(jié)果較一致。
圖3 不同獼猴桃品種各品質(zhì)指標(biāo)聚類熱圖Fig.3 Clustering heat map for quality indexes of four different varieties of kiwifruit
由圖4可知,1.0處為反應(yīng)離子峰,峰兩側(cè)每個(gè)點(diǎn)表示1 種揮發(fā)性物質(zhì),顏色深淺表示物質(zhì)含量高低;4 個(gè)不同品種獼猴桃果汁樣品揮發(fā)性組分采用GC-IMS技術(shù)分離效果較好,且不同樣品之間特征風(fēng)味物質(zhì)種類和含量差異明顯。由圖5可知,為了便于比較不同獼猴桃品種中揮發(fā)性物質(zhì)含量差異,選取1#紅陽為參比,其余3 個(gè)樣品圖譜為扣除參比,扣除后背景為白色,圖中紅色表示物質(zhì)濃度高于1#,藍(lán)色越深則反之。其中2#樣品紅色、藍(lán)色部分均較少,說明2#樣品部分揮發(fā)性物質(zhì)高于1#樣,同時(shí)也含有較少部分風(fēng)味物質(zhì)較低;3#、4#樣品紅色部分明顯較多,說明樣品中存在較多風(fēng)味物質(zhì)高于1#樣品,風(fēng)味物質(zhì)成分特征較為突出。
圖4 不同品種獼猴桃中揮發(fā)性物質(zhì)成分Fig.4 GC-IMS spectra of volatile substances in different varieties of kiwifruit
圖5 不同品種獼猴桃中揮發(fā)性物質(zhì)成分差異Fig.5 Differential volatile compounds among different kiwifruit varieties
根據(jù)獼猴桃果汁種揮發(fā)性成分的氣相色譜保留時(shí)間和IMS遷移時(shí)間,以C~C正酮作為外標(biāo)參考,計(jì)算每種化合物的保留指數(shù),對照NIST2014數(shù)據(jù)庫和IMS數(shù)據(jù)庫定性對果汁種揮發(fā)性成分定性分析,如圖6所示,由于NIST2014數(shù)據(jù)庫和IMS數(shù)據(jù)庫不段完善中,可定性的獼猴桃中主要揮發(fā)性成分含單體及二聚體物質(zhì)共55 種,圖譜中部分揮發(fā)性物質(zhì)見表7,定性結(jié)果可知,4 個(gè)不同品種獼猴桃中共檢測出的部分揮發(fā)性物質(zhì)有醛類25 種,酯類13 種,醇、烯、酮類物質(zhì)各3 種,呋喃類2 種,吡嗪、酸類各1 種。其中,能體現(xiàn)出獼猴桃等水果等特征香味的己酸乙酯、乙酸異戊酯、乙酸異丁酯、丙酸乙酯、甲酸乙酯、丁酸乙酯等揮發(fā)性物質(zhì)均檢測出,圖5中相應(yīng)成分位點(diǎn)顏色深淺可明確成分含量差異。
圖6 獼猴桃揮發(fā)性成分定性分析Fig.6 Qualitative analysis of volatile compounds of kiwifruit
表7 獼猴桃中部分揮發(fā)性物質(zhì)定性結(jié)果Table 7 Results of qualitative analysis of volatile compounds of kiwifruit
續(xù)表7
為了更直觀比較不同獼猴桃樣品、不同階段中揮發(fā)性物質(zhì)的變化規(guī)律及相對含量差異,每個(gè)樣品重復(fù)3 次測定,采用Gallery Plot繪制揮發(fā)性物質(zhì)指紋譜圖,圖中顏色深淺反映揮發(fā)性成分含量差異。由圖7可看出,不同品種之間的差異較大,紅框所示物質(zhì)在各自樣本中含量相對較高。其中,具有香氣成分的有,乙酸乙酯(類似水果香味)、()-2-戊烯醛、己醛(類似于剛切好的草)等揮發(fā)性物質(zhì)為4 個(gè)品種共同含有且含量接近。東紅品種中,2-甲基丁醛(稀釋后有獨(dú)特的可可和咖啡樣的香氣,甜的、微帶水果味的、巧克力樣的風(fēng)味)、3-甲基丁醛(干酪香氣和切草的青香味)、乙酸異戊酯(有香蕉氣味)、乙酸異丁酯(有梨似的果香香氣以及風(fēng)信子和玫瑰樣的花香香氣)等含量最高,萜類物質(zhì)含量相對較高,包括1,8-桉葉素(有樟腦氣息和清涼的草藥味道)、檸檬烯(有類似檸檬的香味)、-松油烯(柑橘香味)等,以及蒎烯(有松木、針葉及樹脂樣的氣息)和-蒎烯(松節(jié)油香氣,干燥木材和松脂氣味)。紅陽品種中,水楊酸甲酯、壬醛(具有玫瑰、柑橘等香氣)、辛醛(有很強(qiáng)的水果香味)、己酸乙酯(有菠蘿果香氣)、丙酸乙酯(有菠蘿香味)、丁酸乙酯(強(qiáng)烈的甜果香,有菠蘿、香蕉、蘋果氣息)等含量較高;萬州紅心中,揮發(fā)性物質(zhì)最多,其中乙酸甲酯(具有芳香味)、2-乙基呋喃、2-戊基呋喃、苯甲醛(具有苦杏仁、櫻桃及堅(jiān)果香)、二戊烯、1,8-桉葉素(清涼的草藥味道)、2-辛烯醛、2-壬烯醛(黃瓜清香氣味)等物質(zhì)較其他品種含量高。
圖7 不同品種獼猴桃Gallery Plot指紋譜圖Fig.7 Gallery Plot fingerprints of different varieties of kiwifruit
采用Dynamic PCA對不同獼猴桃樣品揮發(fā)性成分進(jìn)行動(dòng)態(tài)PC和相似度分析。由圖8可知,降維后前2 個(gè)PC累計(jì)貢獻(xiàn)率為87%,能夠較好表征原始數(shù)據(jù)的特征。
圖8 不同品種獼猴桃PCAFig.8 PCA plot of different cultivars of kiwifruit
不同獼猴桃樣品間距離很遠(yuǎn),平行樣間距離緊密,不同品種的樣品特征差異明顯,與指紋譜圖結(jié)果一致,可通過PCA對不用樣品區(qū)分。從圖9可看出,獼猴桃品評平行性很好,聚類清晰,金艷和萬州紅心品種間的歐式距離最遠(yuǎn),相似度最低;紅陽、東紅和萬州紅心3 個(gè)品種相對集中。因此,研究表明通過獼猴桃品質(zhì)指標(biāo)對樣品進(jìn)行聚類與通過獼猴桃揮發(fā)性成分聚類結(jié)果一致。
圖9 不同品種獼猴桃間歐式距離Fig.9 Euclidean distance between different kiwifruit varieties
通過對金艷、紅陽、東紅及萬州紅心4 種獼猴桃的主要感官、品質(zhì)指標(biāo)及果汁揮發(fā)性物質(zhì)成分含量進(jìn)行分析,研究表明,萬州紅心在總糖、VC、花色苷及總酚含量相對較高、金艷品種中單寧含量較高。4 個(gè)樣品聚集為兩類,其中黃心品種金艷聚為1 類,紅心品種紅陽、東紅和萬州紅心聚類為1 類,PCA和聚類分析結(jié)果一致;采用GC-IMS技術(shù)測定4 個(gè)品種中揮發(fā)性物質(zhì)成分,并結(jié)合PCA及聚類分析,研究表明,指紋圖譜顯示4 個(gè)品種中,萬州紅心品種揮發(fā)性物質(zhì)成分特征顯著,其中乙酸甲酯、苯甲醛、二戊烯、1,8-桉葉素、2-辛烯醛、2-壬烯醛等物質(zhì)較其他品種含量高,通過獼猴桃果汁揮發(fā)性物質(zhì)成分進(jìn)行PCA與聚類分析結(jié)果與前者分類結(jié)果一致。研究為消費(fèi)者在獼猴桃營養(yǎng)及風(fēng)味物質(zhì)成分選擇上提高參考,為獼猴桃產(chǎn)品的開發(fā)等提供理論基礎(chǔ)。