呂正昊，史曉龍，周東英，鐘 超，劉喜波，張 鶴，康樹立，趙新華，王傳堂，于海秋

（1.沈陽農業(yè)大學農學院，沈陽 110161；2.山東省花生研究所，青島 266000）

花生(

Arachis hypogaea

L.)是一種重要的油料作物和經(jīng)濟作物，能為人類提供蛋白質、必需脂肪酸等營養(yǎng)物質，在我國以及世界范圍內被廣泛種植。近年來，我國對食用油的需求量不斷增加，花生已成為我國植物油的第二大來源。遼寧是我國新興的花生產(chǎn)區(qū)，常年種植30 萬hm以上，但多種植于土壤貧瘠的地塊，提高花生的產(chǎn)量潛力對培育高產(chǎn)、優(yōu)質的花生新品種及保障食用油供給具有重要意義。

產(chǎn)量是花生最重要的育種目標之一，花生的產(chǎn)量與單株莢果數(shù)、莢果重和種子重成正比?；ㄉv果由果殼和種子兩部分組成，在多數(shù)情況下，花生莢果大小和種子大小為正相關，種子的生長受到果殼大小的制約，較大的果殼能給種子提供更充分的發(fā)育空間。果殼由子房壁發(fā)育而來，分為外果皮、中果皮和內果皮。在果針入土后，果殼率先發(fā)育，并作為保護和感知器官使種子免受外界脅迫，確保其正常發(fā)育。其中花生的內果皮是供應種子發(fā)育的光合產(chǎn)物臨時貯存場所，而種子重及飽滿與否，取決于光合產(chǎn)物的可用性以及向種子中的轉運?？偠灾?，花生的果殼對種子的形成及產(chǎn)量有直接影響。目前已有許多關于果針、莢果和種子發(fā)育的研究，但對于花生果殼形成及發(fā)育的研究還相對較少。

利用誘變技術創(chuàng)制新種質，是加速花生育種的重要手段。EMS 誘變具有操作方便、突變率較高、損傷較小等優(yōu)點，被廣泛應用到花生突變體創(chuàng)制中。課題組前期從Tifrunner的誘變后代中篩選出一個大果突變體，命名為

ps

。本研究對突變體及其野生型親本進行調查研究，以期探明突變體的表型變異及花生莢果大小與種子大小的關系，為進一步研究花生莢果大小的調控機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料的野生型為美國栽培花生Tifrunner（花生四倍體參考基因組），為匍匐型花生。突變體為山東省花生研究所分子育種課題組于2018年誘變而來，經(jīng)M單株選擇后，M和M被種植于2020年和2021年，突變體命名為

ps

。

1.2 方法

稱取EMS 45g，用少量70%酒精溶解，再加pH 值7.0 磷酸緩沖液（0.1mol·L）5L，配成濃度為0.9%的試劑。按每粒種子2mL用量，種子經(jīng)EMS預浸泡6h，搖動浸泡4h。處理完成后，用流水沖洗種子約4h。

突變體和野生型材料在2020、2021 年均種植于山東省花生研究所萊西試驗站。2020 年4 月30 日播種，一壟雙行，行長1m，株距20cm；2021年5月1日播種，一壟單行，行長4m，株距30cm。田間管理同常規(guī)。田間種植均采用完全隨機設計，每個材料3 次重復。盆栽試驗于2021 年4 月8 日在室內播種，出苗后待溫度適宜，移到室外。盆深21cm，直徑33cm，每個材料播種10 盆，每盆2 粒，即每個材料20 個單株，用于調查開花特性。單株開花數(shù)=總開花數(shù)/單株數(shù)。果針標記于2021年大田進行，在盛花期用彩線進行標記，標記后覆土。

突變體的表型鑒定，植株性狀測量參考《花生種質資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標準》，在花生成熟期每個材料隨機選取5 株有代表性植株，測定主莖高、第一對側枝長、總分枝數(shù)、結果枝數(shù)、結實范圍、雙仁果數(shù)，收獲晾干后各材料分別取5個有代表性的莢果，3次重復，測定莢果長、莢果寬、莢果重、種子長、種子寬、種子重。開花數(shù)量統(tǒng)計是從植株第1朵花出現(xiàn)開始，每天記錄所有花生每株當天的開花量，連續(xù)觀測60d。

石蠟切片及甲苯胺藍染色試驗：縱切面是將花生果殼沿腹縫線切開，橫切面是在此基礎上在果腰位置水平切開。隨后將樣品立即固定于FAA 中，無水乙醇梯度脫水(75%、85%、90%、95%和2×100%)，100%二甲苯透明，石蠟包埋。采用RM2016顯微切割儀切割6μm蠟帶，貼于載玻片上。依次將切片放入二甲苯Ⅰ（20min）、二甲苯Ⅱ（20min）、無水乙醇Ⅰ（5min）、無水乙醇Ⅱ（5min）和75%酒精（5min），自來水洗；甲苯胺藍染色：組織切片入染液約2～5min 后水洗，鏡檢，根據(jù)組織著色深淺進行適當?shù)姆只蛘卟环只?，自來水洗后，將切片置于烤箱內烤干；透明封片：切片入干凈的二甲苯透?0min，中性樹膠封片；顯微鏡鏡檢，圖像采集分析。

正置光學顯微鏡及成像系統(tǒng)分別使用日本尼康公司NIKON ECLIPSE E100和NIKON DS?U3。圖像分析使用CaseViewer及ImageJ軟件。細胞數(shù)量按公式計算，細胞面積=單位面積內細胞總面積/單位面積內細胞個數(shù)。試驗數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2013進行統(tǒng)計，采用GraphPad Prism8及OriginPro 2021b 軟件進行方差分析、相關分析及圖片繪制。

2 結果與分析

2.1 突變體的表型鑒定

通過2020～2021 連續(xù)兩年的種植，發(fā)現(xiàn)與Tifrunner（WT）相比，突變體（

ps

）仍表現(xiàn)出匍匐型的特點，葉型、葉色無明顯變化（圖1）。同時，與WT相比，

ps

的主莖高、第一對側枝長、結果枝數(shù)及結實范圍均無顯著差異（表1），而

ps

的總分枝數(shù)顯著減少（

p

<0.05），兩年分別減少47.3%和44.4%。

圖1 ps和WT的表型特征Figure1 Phenotypic characterization of pw and WT lines

表1 和WT的株型相關性狀
Table1 Plant type related traits of and WT lines

注：檢驗，*表示<0.05。
Note:?test;*<0.05.

在莢果及種子相關性狀上，

ps

表現(xiàn)出明顯的表型變異。

ps

的莢果長、莢果寬和莢果重均極顯著大于WT（

p

<0.01）（圖2A,B,C），其中莢果長在兩年分別增加11.1%和18.2%；莢果寬分別增加15.4%和21.4%。在種子大小方面，

ps

在2020年的種子長、種子寬和種子重均顯著大于WT（

p

<0.05），這一差異在2021 年達極顯著（

p

<0.01）（圖2D,E,F）。種子長在兩年分別增加30.8%和20.0%；種子寬分別增加42.9%和11.1%。

圖2 ps和WT的莢果及種子的表型特征Figure2 Phenotypic characterization of pod and seed in the ps and WT lines

2.2 單株開花動態(tài)

由圖3 可知，

ps

在5 月31 日出現(xiàn)第一朵花，于6 月3日進入始花期。WT 在6 月16 日出現(xiàn)第1 朵花，于6 月17 日進入始花期。

ps

于6 月14 日開始進入盛花期，而WT 于7 月4 日開始進入盛花期。相比于WT，

ps

的始花期提前15d，而盛花期提前19d。同時，在調查期內，

ps

的單日最高開花量高于WT。這些結果表明

ps

的花期較WT提前，且植株活力略有提高。

圖3 ps和WT的單株單日開花量Figure3 The number of ps and WT flowering per day

2.3 主要農藝性狀的相關性分析

通過對

ps

及WT 的主要農藝性狀進行相關性分析（表2），發(fā)現(xiàn)主莖高與總分枝數(shù)（

r

=?0.73，

p

<0.01）極顯著負相關，與雙仁果數(shù)（

r

=?0.67，

p

<0.05）存在顯著負相關關系；第一對側枝長與百果重（

r

=0.77，

p

<0.01）極顯著正相關，與百仁重（

r

=0.68，

p

<0.05）顯著正相關；總分枝數(shù)與結果枝數(shù)（

r

=0.72，

p

<0.01）及雙仁果數(shù)極顯著正相關（

r

=0.81，

p

<0.01）；結果枝數(shù)與雙仁果數(shù)間存在顯著正相關關系（

r

=0.61，

p

<0.05）；百果重與百仁重極顯著正相關（

r

=0.87，

p

<0.01）。

表2 主要農藝性狀的相關性分析
Table2 Correlation analysis of main agronomic traits

2.4 莢果大小與種子大小的相關性分析

由圖4可知，花生的莢果長與種子長存在極顯著相關性（

p

<0.0001），相關系數(shù)為0.9162（圖4A），由此可見，隨著莢果長度增加，種子長度也隨之增加。莢果寬與種子寬也存在極顯著的線性關系（

p

<0.0001），相關系數(shù)為0.9154（圖4B）?；ㄉv果的長寬即為果殼的長寬，這一結果表明種子的大小與果殼大小存在正相關關系。

圖4 莢果長、寬與種子長、寬的相關性Figure4 The correlation between pod length and seed length and the correlation between pod width and seed width

2.5 ps和WT的果型與粒型分析

莢果、種子的長寬比直接決定了果型和粒型，對產(chǎn)量有直接影響。由圖5 可知，相比于WT，

ps

的長寬比并無顯著變化，而種子的長寬比顯著增加（

p

<0.01）。這說明

ps

的果型與WT 一致，在突變后并未發(fā)生變異，但粒型顯著變長。

圖5 ps和WT的莢果、種子長寬比Figure5 Comparative analysis of PL/SL and PW/SW in ps and WT

2.6 ps和WT的細胞學分析

為了進一步分析

ps

莢果變大的原因，在果針入土后20d 對

ps

和WT 的果殼進行了細胞學分析。細胞數(shù)量及細胞面積的統(tǒng)計方法圖6A 和圖6D）。結果表明，在縱切面上，與WT 相比，

ps

的細胞數(shù)量極顯著增加（

p

<0.01），增幅達到18.42%（圖6B），細胞面積與WT無顯著差異（圖6C）；在橫切面上，

ps

的細胞數(shù)量相較于WT 顯著增加了（

p

<0.05）10.32%，（圖6E），而細胞面積與WT無顯著差異（圖6F）。

圖6 ps和WT的細胞學分析Figure6 Cytological analysis of ps and WT

3 討論與結論

在作物育種中，新品種選育的基礎是遺傳變異。而栽培花生的遺傳基礎狹窄，遺傳變異率較低，制約了花生新品種的選育。花生品種改良應通過創(chuàng)制優(yōu)異花生新種質，進而獲得理想的性狀。誘變是拓寬作物遺傳變異以克服遺傳基礎狹窄限制的重要途徑之一，通過誘變獲得優(yōu)異種質，是花生新品種選育的有效途徑。EMS誘變被廣泛應用于花生并成功獲得株型、品質、種皮顏色及莢果發(fā)育突變體。在本試驗中，通過EMS 誘變獲得了一個分枝數(shù)減少、花期提前且莢果變大的突變系

ps

，為選育適宜本地區(qū)機械化種植的花生新品種提供了優(yōu)異種質資源。相關性分析表明，總分枝數(shù)與結果枝數(shù)及雙仁果數(shù)存在顯著正相關關系（表2）。

ps

的分枝數(shù)相比于WT顯著減少（表1），然而結果枝數(shù)卻無顯著變化，這說明

ps

所減少的為無效分枝，促進有效分枝的養(yǎng)分積累?；ㄉ闹晷湍荛g接影響產(chǎn)量，而分枝數(shù)是花生株型構成的重要因素之一，減少無效分枝，有利于有機物向有效分枝的轉運從而提高產(chǎn)量。此外，

ps

進入始花期及盛花期的時間要比WT提前，下針相對較早。研究表明，花生的開花期越早，形成果針及結莢率就越高。莢果大小直接影響花生的產(chǎn)量，增加莢果大小是提高花生產(chǎn)量潛力的有效途徑。在本試驗中，

ps

的莢果及種子大小均顯著大于WT（圖2），且相關性分析表明，莢果長、寬與種子長、寬存在著極顯著的線性關系（圖4），說明

ps

的種子大小隨著莢果的變大而增大。然而，更大的器官不一定產(chǎn)生更大的種子，種子和器官的大小具有不同的調控途徑。在本試驗中，

ps

的果型并未改變，但粒型顯著變長（圖5），說明其果殼和種子的發(fā)育具有不同的調控途徑。正因如此，針對

ps

莢果大小研究時應重點關注果殼的發(fā)育。植物果實的大小主要由細胞數(shù)量和大小決定，細胞學分析表明，造成

ps

莢果長和寬增加的主要原因是細胞數(shù)量的增加（圖6）。綜上，本試驗為研究花生莢果大小及構建定位群體提供了優(yōu)異的突變體材料，并闡明了針對突變體

ps

的果型研究應從果殼發(fā)育入手，為進一步研究其分子機制奠定基礎。