路垚 劉雅輝 孫建平 何宗均 趙琳娜 戴相林 趙子婧

摘要 [目的]篩選適合我國北方冬春季秸稈降解的高效低溫纖維素降解菌株。[方法]在低溫地區(qū)采集土壤，10 ℃初篩耐低溫菌株，通過剛果紅染色液法進(jìn)行復(fù)篩，利用DNS法測定CMC酶活性。將篩得菌株和實(shí)驗(yàn)室自存菌株結(jié)合拮抗試驗(yàn)構(gòu)建復(fù)合菌系，測定復(fù)合菌系CMC酶活性，測定秸稈降解率，并對代表性菌株進(jìn)行產(chǎn)酶條件優(yōu)化，對最終確定的復(fù)合菌系中的菌株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。[結(jié)果]10 ℃低溫培養(yǎng)初篩得到55株耐低溫菌株，剛果紅染色法復(fù)篩得到8株具有明顯水解圈的單菌株，其中包括細(xì)菌3株、真菌2株、放線菌3株，其中纖維素酶活性最高達(dá)到47.0 U/mL;根據(jù)拮抗試驗(yàn)構(gòu)建了2個(gè)復(fù)合菌系，其纖維素酶活性分別達(dá)到31.0和53.0 U/mL;秸稈降解試驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)室和沙袋法的復(fù)合菌系2對秸稈的降解率分別達(dá)31.8%和45.1%，顯著高于復(fù)合菌系1和對照組;對JGDZTX3進(jìn)行產(chǎn)酶條件優(yōu)化，確定最佳氮源為牛肉膏，培養(yǎng)溫度為10 ℃，培養(yǎng)時(shí)間為4 d，初始pH為7，在此條件下CMC酶活性達(dá)到66.5 U/mL，這4個(gè)條件對產(chǎn)酶均有顯著影響（P<0.05）;對復(fù)合菌系2的4個(gè)未知菌株進(jìn)行鑒定，鑒定結(jié)果分別為白蟻菌、葡萄球菌、長柄木霉、芬萊氏鏈霉菌。[結(jié)論]通過該試驗(yàn)篩選得到的耐低溫可降解纖維素復(fù)合菌系有較強(qiáng)的纖維素分解能力，在北方低溫地區(qū)有良好的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞 纖維素降解菌;復(fù)合菌系;低溫;纖維素酶;篩選;菌株鑒定

中圖分類號 S182? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A? 文章編號 0517-6611（2022）10-0006-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.10.002

Screening of Low Temperature Cellulose Degradation Strains and Construction of Complex Microbial System

LU Yao1，LIU Ya-hui2，SUN Jian-ping2 et al

（1.Institute of Agricultural Resources and Environment Sciences，Tianjin Academy of Agricultural Sciences，Tianjin 300384;2.Institute of Coastal Agriculture， Hebei Academy of Agriculture and Forestry Sciences，Tangshan，Hebei 063299）

Abstract [Objective] In order to screen the high efficiency low temperature cellulose degradation strains suitable for winter and spring straw degradation in north China. [Method]Soil samples were collected in low temperature area， low temperature strains were screened at 10 ℃， the isolated strains were screened by Congo red staining solution， and CMC enzyme activity was determined by DNS method. The complex microbial system was constructed by combining the screened strain and the laboratory self-existing strain with antagonistic test. CMC enzyme activity of the complex microbial system was determined， and the straw degradation rate was determined. The enzyme production conditions of the representative strain was optimized， and the strains in the final determined complex microbial system were identified by molecular biology. [Result]A total of 55 low temperature strains were obtained by initial screening at 10 ℃， and 8 strains were obtained by Congo red staining after screening， including 3 strains of bacteria， 2 strains of fungi and 3 strains of actinomycetes with obvious hydrolytic circles. The highest cellulase activity reached 47.0 U/mL. According to the antagonistic test， the cellulase activity of two complex microbial systems reached 31.0 and 53.0 U/mL， respectively. In the straw degradation test， the degradation rates of the compound strain 2 in the laboratory and the sandbag method were 31.8% and 45.1%， respectively， which were significantly higher than those of the compound strain 1 and the control group.The optimum conditions for JGDZTX3 enzyme production were optimized， and the optimal nitrogen source was beef paste， culture temperature was 10 ℃， culture time was 4 d， and initial pH was 7. Under the optimum conditions， CMC enzyme activity reached 66.5 U/mL ，all the four conditions had significant effects on enzyme production （P< 0.05）.The four unknown strains of the complex microbial system were identified， and the identification results were Isoptericola sp.， Staphylococcus sp.， Trichoderma longibrachiatum and Streptomyces finlayi.[Conclusion]The low temperature cellulose-degradable complex microbial system screened by this experiment has strong cellulose-decomposing ability， and has a good application prospect in the low temperature area of north China.

Key words Cellulose degradation strains;Complex microbial system;Low temperature;Cellulase;Screening;Strain identification

基金項(xiàng)目 河北省省級科技計(jì)劃項(xiàng)目（19227307D）;天津市農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化與推廣項(xiàng)目（201701090）。

作者簡介 路垚（1989—），女，山東臨沂人，助理研究員，碩士，從事農(nóng)業(yè)微生物研究。通信作者，副研究員，從事農(nóng)業(yè)微生物研究。

收稿日期 2021-12-06;修回日期 2022-01-18

我國有大量秸稈，每年各類秸稈產(chǎn)生量高達(dá)8 億t，如果能合理利用，將會是很重要的生物資源[1-2]。秸稈的資源化處理有多種方式，其中微生物降解的方法具有安全性高、能耗低等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用[3]。但是自然條件下土壤中纖維素分解菌的數(shù)量較少，降解效率低，秸稈直接還田后不能被快速分解，因此通常人工添加一些纖維素分解菌加快秸稈的腐解[4-5]。已發(fā)現(xiàn)的纖維素分解菌有很多種，涵蓋了細(xì)菌、真菌、放線菌等各類菌株[6]，國內(nèi)外也有很多人在自然界中進(jìn)行了纖維素分解菌菌株的篩選和應(yīng)用。

鄭麗等[7]在木薯生境里分離篩選得到57株纖維素分解菌株;姜立春等[8]從綿陽濕地朽木和土樣中，篩選得到28株產(chǎn)纖維素酶的細(xì)菌菌株;趙旭等[9]在土壤中篩選的Penicillium sp.D5菌株，以玉米秸稈為碳源發(fā)酵10 d，可使玉米秸稈減重29.8%;Selvam等[10]研究表明纖維素降解是菌株間相互協(xié)同作用產(chǎn)生的結(jié)果;王天生等[11]研究發(fā)現(xiàn)復(fù)合菌系的纖維素分解能力好于單一菌株;王垚等[12]研究表明 H57.1 和 H08.1菌株復(fù)合后具有較高的秸稈分解能力，其秸稈降解率可達(dá)到55.7%。

微生物降解受環(huán)境影響較大，很多纖維素分解菌在低溫環(huán)境下不能生長代謝，不能正常發(fā)揮降解作用。我國北方地區(qū)冬春季溫度低，常溫條件下篩選的纖維素分解菌難以發(fā)揮作用。目前，對纖維素分解菌的研究主要集中在常溫環(huán)境的篩選，對低溫環(huán)境下纖維素分解菌的研究相對較少[13-14]。該研究通過從河北濱海區(qū)低溫土壤中分離篩選纖維素酶活性較高的菌株，構(gòu)建復(fù)合菌系，以期為北方低溫地區(qū)秸稈的資源化利用提供菌種資源。

1 材料與方法

1.1 樣品和培養(yǎng)基

1.1.1 樣品來源。

河北省唐山市曹妃甸區(qū)河北省農(nóng)林科學(xué)院研究基地土樣，分別為水稻田秸稈還田2年土、水稻田秸稈還田3年土、水稻秸稈還田咸水土、秸稈堆置土。存放于自封袋中，封口，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 培養(yǎng)基。

（1）CMC分離培養(yǎng)基。CMC-Na 10 g，（NH4）2SO4 4 g，K2HPO4 1 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KH2PO4 1 g，蛋白胨1 g，酵母膏1 g，H2O 1 000 mL，pH 7.0～7.2。

（2）種子培養(yǎng)基。（NH4）2SO4 3.0 g，KH2PO4 1.0 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 5.0 mg，MnSO4·H2O 1.6 mg，CaCl2 0.1 g，ZnSO4·7H2O 1.7 mg，MgSO4·7H2O 0.5 g，CoCl2 2.0 mg，NaCl 0.1 g，葡萄糖 20 g，蛋白胨5 g，酵母膏1 g，H2O 1 000 mL，pH 7.0～7.2。

（3）牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂15～20 g，H2O 1 000 mL，pH 7.0～7.2。

（4）PDA培養(yǎng)基。馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g，H2O 1 000 mL，pH自然。

（5）高氏一號培養(yǎng)基?？扇苄缘矸?0 g，KNO3 1 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，K2HPO4 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，NaCl 0.5 g，瓊脂 20 g，H2O 1 000 mL，pH 7.4～7.6。

（6）秸稈降解培養(yǎng)基。秸稈3 g，CMC-Na 10 g，（NH4）2SO4 4 g，K2HPO4 1 g，MgSO4· 7H2O 0.5 g，KH2PO4 1 g，蛋白胨1 g，酵母膏1 g，H2O 1 000 mL，pH 7.0～7.2。

1.2 菌株分離篩選

1.2.1 菌株的初篩。

將采集到的土壤樣品用無菌水制成10-4、10-5、10-6稀釋度的菌懸液，在CMC培養(yǎng)基上涂布，放置生化培養(yǎng)箱10 ℃培養(yǎng)5 d。將初篩得到的菌株在固體平板上分別編號，并分別劃線純化，然后每個(gè)平板倒入15 mL剛果紅溶液（1 mL/mg）染色30 min，用1 mol/L氯化鈉溶液脫色2～3次，只保留有透明圈的對應(yīng)標(biāo)號菌株，將得到的細(xì)菌保存至牛肉膏蛋白胨試管斜面培養(yǎng)基，真菌保存至 PDA 試管斜面培養(yǎng)基，放線菌存放至高氏一號試管斜面培養(yǎng)基，放置 4 ℃冰箱保存。

1.2.2 菌株的復(fù)篩。

將保存的菌株接種于CMC培養(yǎng)基，放至搖床10 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)5 d，在CMC固體平板上放置牛津杯，在牛津杯中加入100? μL菌液，10 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 d，取出牛津杯，測量菌落直徑（d），每個(gè)平板倒入15 mL 剛果紅溶液（1 mL/mg）染色30 min，然后用 1 mol/L氯化鈉溶液清洗脫色 2～3次，測量透明圈的直徑（D），每個(gè)菌株做3個(gè)重復(fù)。

1.3 DNS法測定酶活

1.3.1 原樣酶液的制備。

將待測菌株接種到種子培養(yǎng)基，10 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)3 d，轉(zhuǎn)接至CMC分離培養(yǎng)基培養(yǎng)5 d，取菌液10 mL，3 000 r/min離心10 min，離心后的上清液即為原樣酶液，供測試用。

1.3.2 測定步驟。

每個(gè)樣品取2支大試管，1支作為空白對照。樣品管中加1.0 mL原樣酶液，然后2支試管中分別加入4.0 mL已預(yù)熱至60 ℃的CMC緩沖液，在60 ℃的水浴鍋中反應(yīng)20 min取出，每管立即加入3.0 mL DNS顯色液，搖勻后在對照管中再加入1.0 mL原樣酶液。將2支試管放入沸水浴中，顯色5 min后立即取出，流水冷卻，用分光光度計(jì)于490 nm處測其OD值，與標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖曲線對照，計(jì)算出樣品和對照的葡萄糖量，通過公式計(jì)算酶活性：U=k（m1-m0）/20，式中，U為樣品的酶活，1個(gè)酶活單位代表1 mL原樣酶液1 min產(chǎn)生1 μg葡萄糖;k為樣品稀釋倍數(shù);m1為樣品葡萄糖量;m0為對照葡萄糖量;20為酶與底物反應(yīng)時(shí)間。

1.4 耐低溫復(fù)合菌系的構(gòu)建

將篩選得到的菌株與天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所土壤微生物研究室自存可低溫降解纖維素的菌株（枯草芽孢桿菌KC、膠胨樣芽孢桿菌GSY），根據(jù)細(xì)菌、真菌、放線菌的合理搭配以及各菌株間的拮抗作用，構(gòu)建2組復(fù)合菌系。

1.5 實(shí)驗(yàn)室秸稈降解率測定

在250 mL三角瓶中加入90 mL秸稈降解培養(yǎng)基，玉米秸稈的處理方法為粉碎過40目篩，50 ℃烘干至恒重，滅菌后，2個(gè)試驗(yàn)組每個(gè)三角瓶中加入10 mL復(fù)合菌劑，對照組加入10 mL滅菌蒸餾水，10 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)，15 d后用濾紙過濾收集秸稈，用蒸餾水清洗3次，80 ℃烘干至恒重，計(jì)算失重率，每個(gè)處理設(shè)置3次重復(fù)。

1.6 沙袋法秸稈降解率測定

試驗(yàn)在2019年11—12月進(jìn)行，開始前先稱取3份1 kg的秸稈，切割成3～5 cm 段狀，85 ℃烘干至恒重并稱量記錄。稱取1 kg秸稈，切割成3～5 cm 段狀，試驗(yàn)組加入10 mL復(fù)合菌劑混合均勻，對照組加入10 mL滅菌蒸餾水，裝入長110 cm、寬60 cm、孔徑為0.18 mm的尼龍袋中，埋入土壤25～35 cm的土層中，溫度6～10 ℃，60 d后取出尼龍袋，用自來水將秸稈沖洗干凈，然后85 ℃烘干至恒重并稱量記錄。計(jì)算失重率，每個(gè)處理設(shè)置3次重復(fù)。

1.7 菌株的產(chǎn)酶條件優(yōu)化

選取最具代表性的菌株，即纖維素酶活性最高的菌株，將菌株以接種量10%接種到種子培養(yǎng)基中，分別設(shè)置不同的氮源（硫酸銨、酵母膏、牛肉膏）、不同的培養(yǎng)溫度（4、10、15、20、30 ℃）、不同的培養(yǎng)時(shí)間（2、3、4、5 d）、不同的初始pH（6、7、8），測定菌株的CMC酶活性，以確定菌株最佳的產(chǎn)酶條件。在最佳產(chǎn)酶條件下進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)，測定菌株CMC酶活性。

1.8 菌株的分子生物學(xué)鑒定

將秸稈降解效果較好的復(fù)合菌劑的各菌株進(jìn)行分子生物學(xué)的鑒定。鑒定方法為用引物27F/1492R或ITS1/ITS4進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，然后將PCR 產(chǎn)物切膠純化回收，用引物27F/1492R 或ITS1/ITS4 測序，將測序結(jié)果序列在NCBI 上Blast 比對完成菌種鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 纖維素降解菌的篩選

初步篩選得到可以10 ℃低溫生長的菌株55株，進(jìn)一步通過透明圈在秸稈堆置土中篩選得到低溫纖維素降解細(xì)菌3株、低溫纖維素降解真菌2株，水稻田秸稈還田土中篩選得到低溫纖維素降解放線菌3株。3株細(xì)菌分別編號JGDZTX1、JGDZTX2、JGDZTX3，2株真菌分別編號JGDZTZ2、JGDZTZ3，3株放線菌分別編號SDT2NF1、SDT2NF2、SDT2NF3。

2.2 透明圈直徑

3株細(xì)菌和3株放線菌均測得透明圈直徑，2株真菌因長得過大，未測出透明圈直徑。透明圈結(jié)果見表1和圖1。

從表1可以看出，JGDZTX2的透明圈直徑最大，達(dá)5.27 cm，JGDZTX1、JGDZTX2、JGDZTX3、SDT2NF2、SDT2NF3的D/d值均大于2.00，均具有較強(qiáng)的纖維素分解能力。

2.3 CMC酶活性

對JGDZTX1、JGDZTX2、JGDZTX3、JGDZTZ2、JGDZTZ3、SDT2NF1、SDT2NF2和SDT2NF3共8株篩選菌株進(jìn)行CMC酶活性測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其CMC酶活性分別為17.5、31.5、47.0、34.0、13.5、4.0、2.0、33.0 U/mL。其中JGDZTX2、JGDZTX3、JGDZTZ2、SDT2NF3的CMC酶活性均大于30.0 U/mL，有較好的纖維素分解能力。實(shí)驗(yàn)室自存菌株枯草芽孢桿菌（KC）、膠胨樣芽孢桿菌（GSY）的CMC酶活性分別為28.0、25.0 U/mL。

2.4 復(fù)合菌系構(gòu)建

綜合考慮篩選得到的8株菌的CMC酶活性和拮抗作用（表2），將這8個(gè)菌株分為2組，分別與天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所土壤微生物研究室自存的2株菌株混合，構(gòu)建2組復(fù)合菌系。各菌株均按照菌∶鋯石=1∶2的比例吸附于鋯石上。其中復(fù)合菌系1的復(fù)合方法為JGDZTX1∶JGDZTZ3∶SDT2NF1∶SDT2NF2∶KC∶GSY=3∶3∶3∶3∶2∶1，復(fù)合菌系2的復(fù)合方法為JGDZTX3∶JGDZTZ2∶SDT2NF3∶JGDZTX2∶KC∶GSY=3∶3∶3∶3∶2∶1。2組復(fù)合菌系的CMC酶活性分別達(dá)到31.0和53.0 U/mL，均高于單一菌CMC酶活性。

2.5 實(shí)驗(yàn)室秸稈降解率測定

為了得到秸稈降解能力強(qiáng)的復(fù)合菌系，進(jìn)一步在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件下測定了2組復(fù)合菌系對秸稈的降解率。由圖2可知，復(fù)合菌系1對秸稈的降解率為24.4%，復(fù)合菌系2對秸稈的降解率為31.8%，與空白對照相比，2個(gè)復(fù)合菌系在低溫條件下的秸稈降解率均顯著高于對照（P<0.05），2個(gè)復(fù)合菌系相比于對照組的增幅分別達(dá)264.18%和374.63%;復(fù)合菌系2的降解率也顯著高于復(fù)合菌系1。說明2組復(fù)合菌系對秸稈的降解能力都較強(qiáng)，并且復(fù)合菌系2的降解效果更好。

2.6 沙袋法秸稈降解率測定

為了更接近于田間應(yīng)用效果，通過沙袋法模擬田間試驗(yàn)條件，測定2組復(fù)合菌系對秸稈的降解率。由圖3可知，復(fù)合菌系1對秸稈的降解率為28.7%，復(fù)合菌系2對秸稈的降解率為45.1%，空白對照組雖然沒有添加菌劑，但是土壤環(huán)境中也存在纖維素分解菌，會有一定的秸稈降解作用，秸稈降解率為22.6%。2個(gè)復(fù)合菌系的秸稈降解率均顯著高于對照（P<0.05），2個(gè)復(fù)合菌系相比于對照組的增幅分別達(dá)26.99%和99.56%;復(fù)合菌系2的降解率也顯著高于復(fù)合菌系1。說明2組復(fù)合菌系對秸稈的降解能力都較強(qiáng)，并且復(fù)合菌系2的降解效果更好。該試驗(yàn)結(jié)果與實(shí)驗(yàn)室秸稈降解試驗(yàn)結(jié)果相一致，復(fù)合菌系2的秸稈降解能

力更強(qiáng)。

2.7 菌株的產(chǎn)酶條件優(yōu)化

篩選菌株中JGDZTX3的CMC酶活性最強(qiáng)，以JGDZTX3為代表進(jìn)行產(chǎn)酶條件優(yōu)化，通過試驗(yàn)可以看出不同氮源、溫度、培養(yǎng)時(shí)間、pH對該菌株產(chǎn)酶均具有較大影響，結(jié)果如圖4所示。

在不同氮源的試驗(yàn)中，設(shè)置培養(yǎng)溫度為10 ℃，培養(yǎng)時(shí)間為3 d，初始pH為7，結(jié)果顯示，以牛肉膏作為唯一氮源時(shí)CMC酶活性最高，可達(dá)到58.5 U/mL，該試驗(yàn)條件下CMC酶活性顯著高于硫酸銨和酵母膏。

在不同溫度的試驗(yàn)中，設(shè)置氮源為硫酸銨3 g和酵母膏1 g，培養(yǎng)時(shí)間為3 d，初始pH為7，結(jié)果顯示，隨著溫度升高CMC酶活性呈現(xiàn)出先增后降的趨勢，溫度為10 ℃時(shí)CMC酶活性達(dá)到最大值（56.5 U/mL），該溫度下CMC酶活性顯著高于其他溫度水平。

在不同培養(yǎng)時(shí)間的試驗(yàn)中，設(shè)置氮源為硫酸銨3 g和酵母膏1 g，培養(yǎng)溫度為10 ℃，初始pH為7，結(jié)果顯示，隨著培養(yǎng)天數(shù)增加CMC酶活性呈現(xiàn)逐漸增高后趨于平穩(wěn)的趨勢，2～3 d的增長較快，3～4 d的增長較緩，4 d時(shí)CMC酶活性達(dá)到最大值（52.6 U/mL），該時(shí)間下CMC酶活性顯著高于2 d和3 d時(shí)的值。

在不同初始pH的試驗(yàn)中，設(shè)置氮源為硫酸銨3 g和酵母膏1 g，培養(yǎng)溫度為10 ℃，培養(yǎng)時(shí)間為3 d，結(jié)果顯示，隨著pH增加CMC酶活性呈現(xiàn)出先增后降的趨勢，pH為7時(shí)CMC酶活性達(dá)到最大值（48.5 U/mL），該pH水平下CMC酶活性顯著高于其他pH水平。

綜上所述，通過單因素試驗(yàn)確定了最佳氮源為牛肉膏，最適培養(yǎng)溫度為10 ℃，最佳培養(yǎng)時(shí)間為4 d，最佳初始pH為7。以此條件對菌株JGDZTX3進(jìn)行了一次優(yōu)化培養(yǎng)，得到CMC酶活性為66.5 U/mL。

2.8 菌株的鑒定

通過前面試驗(yàn)，復(fù)合菌劑2的實(shí)驗(yàn)室秸稈降解效果和沙袋法秸稈降解效果均較好，因此對復(fù)合菌系2中未知的4個(gè)菌株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。鑒定結(jié)果（表3）顯示，JGDZTX2是葡萄球菌（Staphylococcus sp.），JGDZTX3是白蟻菌（Isoptericola sp.），JGDZTZ2是長柄木霉（Trichoderma longibrachiatum），SDT2NF3是芬萊氏鏈霉菌（Streptomyces finlayi）。

3 討論與結(jié)論

利用纖維素降解微生物處理秸稈是一種安全高效的秸稈資源化處理方式[15]。楊娜等[16]從自然發(fā)酵堆肥中篩選得到一株高效降解纖維素的菌株SC2，其濾紙酶活性為17.70 U/mL，對玉米秸稈的降解率可達(dá)到33.07%。孟建宇等[17]從內(nèi)蒙古西部地區(qū)篩選得到23株常溫纖維素降解菌，纖維素酶活性在4～88 U/mL。這些篩選得到的常溫菌株均有較強(qiáng)的纖維素分解能力，但是在低溫環(huán)境下就很難發(fā)揮作用。我國北方地區(qū)冬春季溫度低，低溫纖維素分解菌將有更廣的適用范圍。然而，目前國內(nèi)外的研究多集中在常溫菌株，對于土壤中低溫纖維素降解菌的研究很少[18]，且低溫篩選的條件一般是在15 ℃以上，不適用于北方冬春季10 ℃以下的土壤環(huán)境。張必周等[19]為篩選低溫菌株，在15 ℃下篩選得到11株具有纖維素分解能力的菌株。黃亞麗等[20]為了篩選適用于黃淮海北部秋冬季節(jié)的菌株，在16 ℃下進(jìn)行了秸稈降解真菌的篩選，篩選得到一株長枝木霉，接種45 d的秸稈降解率可達(dá)到56.73%。以上篩選出的低溫菌株，在15 ℃左右可以發(fā)揮出較好的降解能力，但不一定能適用于更低的溫度條件。該研究在10 ℃條件下篩選得到55株耐低溫菌株，進(jìn)一步從中篩選出8株有明顯透明圈的菌株并測定了纖維素酶活性，最高可達(dá)47.0 U/mL，所有的培養(yǎng)條件均是在10 ℃進(jìn)行，保證了所篩菌株在10 ℃條件下具有較強(qiáng)的CMC酶活性，能夠在低溫環(huán)境發(fā)揮較好的秸稈降解效果。

單一菌株的纖維素酶也相對單一，多種纖維素分解菌株復(fù)配在一起，纖維素酶也相對豐富，并且菌株之間協(xié)同作用有利于纖維素酶活性的提高[21-22]。該研究篩選出8株低溫纖維素降解菌株，加上實(shí)驗(yàn)室自存的2株纖維素降解菌株，共同進(jìn)行復(fù)配。第一組為JGDZTX1（17.5 U/mL）、JGDZTZ3（13.5 U/mL）、SDT2NF1（4.0 U/mL）、SDT2NF2（2.0 U/mL）、KC（28.0 U/mL）、GSY（25.0 U/mL），復(fù)合菌劑的CMC酶活性為31.0 U/mL;第二組為JGDZTX3（47.0 U/mL）、JGDZTZ2（34.0 U/mL）、SDT2NF3（33.0 U/mL）、JGDZTX2（31.5 U/mL）、KC（28.0 U/mL）、GSY（25.0 U/mL），復(fù)合菌劑的CMC酶活性為53.0 U/mL。此次試驗(yàn)中復(fù)合菌劑CMC酶活性均高于單一菌株，說明沒有拮抗作用的纖維素分解菌菌株復(fù)配后，有助于CMC酶活性的提高。

菌株在生長代謝過程中會產(chǎn)生一些具有特定作用的代謝產(chǎn)物，在不同的生長條件刺激下，代謝產(chǎn)物的量會有較大差異。為了獲得需要的特定產(chǎn)物，要對菌株的生長條件進(jìn)行優(yōu)化。邢慧珍等[14]篩選出一株纖維素降解的真菌，并進(jìn)行了產(chǎn)酶條件優(yōu)化，證明接種量、初始pH、培養(yǎng)溫度菌對產(chǎn)酶量具有顯著影響。孟建宇等[17]篩選了59株纖維素分解細(xì)菌，并對代表性菌株進(jìn)行了產(chǎn)酶條件優(yōu)化，結(jié)果表明培養(yǎng)溫度、氮源、培養(yǎng)時(shí)間和初始pH均對菌株產(chǎn)酶有顯著影響。此次試驗(yàn)中，共篩選出包括高效低溫纖維素分解菌8株，包括細(xì)菌3株、真菌2株、放線菌3株，其中CMC酶活性最高的菌株為JGDZTX3，酶活達(dá)到47.0 U/mL。對該菌株進(jìn)行產(chǎn)酶條件優(yōu)化，測定了不同氮源、不同培養(yǎng)溫度、不同培養(yǎng)時(shí)間、不同初始pH對其產(chǎn)酶量的影響，最終確定最佳氮源為牛肉膏，培養(yǎng)溫度為10 ℃，培養(yǎng)時(shí)間為4 d，初始pH為7，試驗(yàn)證明這4個(gè)條件對產(chǎn)酶均有顯著影響（P<0.05），在最佳產(chǎn)酶條件下CMC酶活性值達(dá)到66.5 U/mL。

綜上所述，該研究在河北濱海區(qū)低溫土壤中篩選出低溫纖維素分解菌，并與實(shí)驗(yàn)室自存菌株進(jìn)行復(fù)配，最終得到了一組復(fù)合菌劑，具有較高的CMC酶活性，并已在實(shí)驗(yàn)室秸稈降解試驗(yàn)和低溫田間試驗(yàn)中，證明其具有高效加快秸稈腐解的作用，為北方低溫地區(qū)秸稈的資源化利用提供了菌種來源。但是由于微生物是活體，菌株發(fā)揮作用受到多方面條件的制約，作用效果不穩(wěn)定，在提高纖維素分解菌對秸稈降解的穩(wěn)定性方面還有待進(jìn)一步深入研究。

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