十二齒小蠹形態(tài)特征及DNA條形碼技術(shù)快速鑒定研究

胡淑青 李獻(xiàn)鋒 魏霜 丁鈿

摘要 介紹了我國(guó)口岸進(jìn)口木材中多次截獲的松十二齒小蠹，對(duì)該蟲(chóng)的分類(lèi)地位、分布、寄主、危害及成蟲(chóng)形態(tài)特征進(jìn)行了描述。將獲得的該蟲(chóng)COⅠ序列通過(guò)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)分析，以及用鄰接法（NJ）構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，建立了該蟲(chóng)的DNA條形碼檢測(cè)方法，以期為口岸一線(xiàn)的檢測(cè)鑒定提供參考。

關(guān)鍵詞 十二齒小蠹;分布;形態(tài)特征;DNA條形碼

中圖分類(lèi)號(hào) S41-30? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2022）10-0119-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.10.027

Morphological Character and DNA Barcoding Technique Rapid Identification of Ips sexdentatus

HU Shu-qing，LI Xian-feng，WEI Shuang et al （Guangzhou Customs Technology Center，Guangzhou，Guangdong 510623）

Abstract Ips sexdentatus frequently intercepted in imported wood from domestic port was described based on its classification，distribution，host plants，harm，morphological characteristics，etc.COⅠ sequence was blasted with released data in GenBank，and phylogenetic tree based on the Neighbor-Joining Algorithm（NJ） was constructed，and finally DNA barcoding technique indentifying this pest was created，with the hope that it will provide references on inspection and identification of port line.

Key words Ips sexdentatus;Distribution;Morphological characteristics;DNA barcode

作者簡(jiǎn)介 胡淑青（1992—），女，廣東廣州人，助理工程師，從事植物檢疫及生物技術(shù)研究。通信作者，農(nóng)藝師，碩士，從事植物檢疫及分子生物學(xué)研究。

收稿日期 2021-04-27

十二齒小蠹[Ips sexdentatus（Boerner，1767）]，又名松十二齒小蠹，是古北區(qū)林業(yè)重要蛀干害蟲(chóng)，被列入我國(guó)林業(yè)危險(xiǎn)性有害生物名錄，其主要危害松屬、云杉屬植物等針葉樹(shù)[1-2]。近年來(lái)，我國(guó)口岸多次從進(jìn)境的木材和木質(zhì)包裝中截獲十二齒小蠹活幼蟲(chóng)和成蟲(chóng)。筆者介紹了十二齒小蠹的分類(lèi)地位、分布、寄主和形態(tài)學(xué)特征等，并研究了該蟲(chóng)的DNA條形碼檢測(cè)方法，以期為口岸檢疫鑒定提供參考。

1 名稱(chēng)與分類(lèi)地位

學(xué)名：Ips sexdentatus（Boerner，1767）。

異名：Bostrichus pinastri Bechstein，1818;Bostrichus sexdentatus （Boerner，1776）;Bostrichus stenographus Duftschmidt，1825;Bostrycus pinastri Bechstein;Dermestes sexdentatus Borner;Dermestes sexdentatus Borner，1776;Ips sexdentatus junnanicus Sokanovskii，1959;Ips stenographus （Duftschmidt，1825）;Tomicus sexdentatus （Boerner，1776）;Tomicus stenographus （Duftschmidt，1825）;Tomicus stenographus Duftschmidt。

中文名：十二齒小蠹、松十二齒小蠹。

分類(lèi)地位：鞘翅目Coleoptera，小蠹科Scolytidae，齒小蠹亞科Ipinae，齒小蠹族（Ipini），齒小蠹屬I(mǎi)ps De Geer[1]。

2 分布

國(guó)外主要分布于俄羅斯（遠(yuǎn)東及西伯利亞）、白俄羅斯、比利時(shí)、土耳其、烏克蘭、南斯拉夫、瑞典、瑞士、塞爾維亞和黑山、斯洛伐克、斯洛文尼亞、愛(ài)沙尼亞、奧地利、保加利亞、波蘭、德國(guó)、法國(guó)、芬蘭、荷蘭、捷克、克羅地亞、拉脫維亞、立陶宛、盧森堡、羅馬尼亞、馬其頓、摩爾多瓦、挪威、葡萄牙、西班牙、希臘、匈牙利、意大利、英國(guó)、阿塞拜疆、格魯吉亞、美國(guó)、朝鮮、韓國(guó)、蒙古、緬甸、日本、泰國(guó)、亞美尼亞[3-5]。

國(guó)內(nèi)原發(fā)生于黑龍江林區(qū)，目前在吉林、遼寧、新疆、內(nèi)蒙古、陜西、四川、云南等地均有分布[6]。

3 寄主與危害

寄主主要為針葉樹(shù)，如高加索冷杉（Abies nordmanniana）、云杉（Picea asperata）、歐洲云杉（Picea excelsa）、魚(yú)鱗云杉（Picea jezoensis var.microsperma）、紅皮云杉（Picea koraiensis）、東方云杉（Picea orientalis）、落葉松（Larix gmelinii）、華山松（Pinusarmandii）、高山松（Pinus densata）、思茅松（Pinus kesiya var.langbianensis）、紅松（Pinus koraiensis）、歐洲白皮松（Pinus leucodermis）、黑松（Pinus nigra）、海岸松（Pinus pinaster）、意大利傘松（Pinus pinea）、輻射松（Pinus radiata）、西伯利亞五針?biāo)桑≒inus sibirica）、歐洲赤松（Pinus sylvestris）、樟子松（Pinussylvestris var.mongolica）、油松（Pinus tabulaeformis）、油松（Pinus tabuliformis）、黃山松（Pinus taiwanensis）、云南松（Pinus yunnanensis）等[3-4]。

主要危害風(fēng)倒木、火燒木、衰老、生長(zhǎng)勢(shì)差的衰弱木，是次期性害蟲(chóng)的先鋒軍[1-2]。陳輝等[7]研究表明，十二齒小蠹是秦嶺華山松的主要次期性小蠹，能迅速入侵衰弱的寄主華山松，利用寄主樹(shù)木樹(shù)干基部的營(yíng)養(yǎng)空間。危害嚴(yán)重時(shí)能直接攻擊健康的活立木，曾在法國(guó)中部、西班牙和葡萄牙引起遭受干旱影響的歐洲赤松死亡，并在土耳其的東方云杉上暴發(fā)危害[4]。十二齒小蠹危害的坑道狀見(jiàn)圖1。

4 形態(tài)特征

雌雄成蟲(chóng)形態(tài)、大小相似，體長(zhǎng) 5.8～7.5 mm，褐色至黑褐色，頭部、斜面及側(cè)面體被長(zhǎng)細(xì)毛[3]。觸角膝狀，錘狀部膨大明顯;復(fù)眼完整，呈腎形;額面有一橫向隆堤，凸起在兩眼之間，堤基寬厚，堤頂狹窄光亮，呈一字形，橫堤與口上片之間有中隆線(xiàn)與橫堤連成“丁”字。下部刻點(diǎn)細(xì)而密，上部刻點(diǎn)粗大疏散。前胸背板無(wú)側(cè)緣，正面看前圓后方，呈盾形，長(zhǎng)約是寬的1.1 倍，全部背板以縱中線(xiàn)為軸，左右對(duì)稱(chēng)，瘤區(qū)和刻點(diǎn)區(qū)各占背板長(zhǎng)度的一半，瘤區(qū)中的顆瘤低平微弱，后部顆瘤扁平，形如鱗片。鞘翅長(zhǎng)為前胸背板的1.5 倍，為兩翅合寬的1.6倍，溝間部無(wú)點(diǎn)無(wú)毛;鞘翅斜面每側(cè)緣上隆起6個(gè)齒，前3齒基闊頂尖，呈錐形，其中第2、3 兩齒略大，第1齒稍小，第4齒粗壯挺拔最大，尖端呈紐扣狀（圖2）[4]。

5 DNA條形碼分子檢測(cè)方法

5.1 DNA提取、PCR擴(kuò)增及序列分析 取3頭成蟲(chóng)樣品分別用于DNA提取，分3個(gè)反應(yīng)同時(shí)進(jìn)行，提取方法參照Qiagen公司基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū) （DNeasy Blood & Tissue Kit Cat No./ID：69504）。采用從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)下載的十二齒小蠹COⅠ基因序列（AF113380.1、KP314288.1）設(shè)計(jì)的特異性引物Ips sex_11：5′-AGATTCTGATTACTTCCACCCT-3′和Ips sex_12：5′-GAGAAACTAAGCCAAATCCTG-3′。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃變性30 s，57 ℃退火

30 s，72 ℃延伸2 min，循環(huán)30次;72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳分析，將正確條帶的PCR產(chǎn)物送上海生工（Sanggon）進(jìn)行正反雙向測(cè)序。測(cè)序結(jié)果采用SeqMan軟件進(jìn)行序列校對(duì)和拼接，去除兩端引物序列，獲得長(zhǎng)度為855 bp的COⅠ條形碼序列（圖 3）。

將序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行相似性比對(duì)分析，依據(jù)相似性的高低和形態(tài)近似種屬，將十二齒小蠹、北海齒小蠹（I.amitinus）、 波若混齒小蠹（I.perroti）、刺形齒小蠹 （I.spini-fer）、大體齒小蠹（I.emarginatus）、短喙齒小蠹（I.avulsus）、高山齒小蠹（I.montanus）、混點(diǎn)齒小蠹（I.confusus）、間隔齒小蠹（I.integer）、攪擾齒小蠹（I.perturbatus）、刻紋齒小蠹（I.plas-

tographus）、落葉松齒小蠹（I.cembrae）、美雕齒小蠹（I.cal-ligraphus）、木齒小蠹（I.woodi）、似混齒小蠹（I.paraconfusus）、西南間隔齒小蠹（I.knausi）和亞利桑那齒小蠹（I.lecontei）18種齒小蠹屬COⅠ序列片段下載保存。將所有序列用Clustal X1.83軟件進(jìn)行序列比對(duì)，并轉(zhuǎn)換成FASTA格式，再利用MEGA 6.0軟件計(jì)算各物種間的遺傳距離，并基于鄰接法（NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)各分支置信區(qū)間（bootstrap）均進(jìn)行1 000次重復(fù)檢驗(yàn)，以此確定待鑒定昆蟲(chóng)種類(lèi)。

5.2 結(jié)果分析

通過(guò)Clustal X1.83軟件比對(duì)分析上述所得的COⅠ序列，發(fā)現(xiàn)3頭測(cè)試樣品的序列完全一致。將COⅠ序列上傳至GenBank中進(jìn)行“Blastn”相似性檢索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該序列與序列號(hào)為KX035215.1十二齒小蠹線(xiàn)粒體基因序列相似度達(dá)99%，覆蓋率達(dá)97%;與AF113380.1的十二齒小蠹COⅠ序列相似度達(dá)99%，覆蓋率達(dá)89%。在NCBI上下載15種齒小蠹屬COⅠ基因序列，并以歐洲榆小蠹（Scolytus multistriatus（KU91237.1））為外群，應(yīng)用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，發(fā)現(xiàn)待測(cè)鑒定昆蟲(chóng)與十二齒小蠹聚為同一分支，其置信度為99%，且與其他齒小蠹屬明顯分開(kāi)（圖4）。GenBank比對(duì)結(jié)果、構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)與形態(tài)學(xué)分類(lèi)結(jié)果都一致，因此可以判定待鑒定昆蟲(chóng)為十二齒小蠹。所得的COⅠ序列已上傳至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，序列登記號(hào)為MH260900。

6 討論

小蠹科是重要的森林蛀干害蟲(chóng)之一，其成蟲(chóng)和幼蟲(chóng)蛀食樹(shù)皮或木質(zhì)部，危害極其隱蔽，被認(rèn)為是通過(guò)國(guó)際貿(mào)易傳播最為普遍的一類(lèi)昆蟲(chóng)，也是口岸截獲最為普遍的類(lèi)群之一。我國(guó)口岸截獲小蠹的分類(lèi)鑒定主要是依靠傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)分類(lèi)技術(shù)，然而小蠹個(gè)體較小，有許多近似種之間形態(tài)特征差異甚微，因此，鑒定人員應(yīng)當(dāng)具備較高的昆蟲(chóng)分類(lèi)知識(shí)水平和顯微鏡操作技術(shù)。此外，口岸截獲的小蠹蟲(chóng)很大部分為幼蟲(chóng)，難于在實(shí)驗(yàn)室條件下飼養(yǎng)成成蟲(chóng)，僅依靠幼蟲(chóng)的特征來(lái)判定該蟲(chóng)種類(lèi)非常困難，這進(jìn)一步加大口岸對(duì)截獲小蠹蟲(chóng)分類(lèi)鑒定的難度。

近年來(lái)，昆蟲(chóng)DNA條形碼技術(shù)已廣泛應(yīng)用于種類(lèi)分子鑒定，成為昆蟲(chóng)分類(lèi)形態(tài)鑒定的重要補(bǔ)充手段。目前，DNA條形碼技術(shù)已在鱗翅目[8]、半翅目[9]、雙翅目[10-11]、膜翅目[12]、鞘翅目[13]、蜉蝣目[14]、彈尾目[15]、直翅目[16-17]和蜻蜓目[18]等中被證實(shí)可以進(jìn)行物種分類(lèi)鑒定。此外，Greenstone 等[19]通過(guò)對(duì)步甲科Carabidae 的卵、幼蟲(chóng)、蛹與成蟲(chóng)COⅠ序列比較研究，認(rèn)為可以對(duì)未成熟步甲進(jìn)行種間鑒定;Mitchell等[20]結(jié)合DNA條形碼技術(shù)和形態(tài)學(xué)分類(lèi)，成功對(duì)澳大利亞堅(jiān)果植物上的外侵害蟲(chóng)小蠹蟲(chóng)亞科的不成熟階段進(jìn)行分類(lèi)研究，顯示了DNA條形碼技術(shù)在昆蟲(chóng)卵、幼蟲(chóng)鑒定時(shí)具有的優(yōu)越性。常虹等[21]采用小蠹科通用引物和小蠹科COⅠ序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行巢式PCR，獲得包括十二齒小蠹在內(nèi)的11種齒小蠹屬的COⅠ序列。該研究在形態(tài)學(xué)特征的基礎(chǔ)上，結(jié)合DNA條形碼技術(shù)，設(shè)計(jì)1對(duì)特異性COⅠ引物獲得COⅠ序列，成功鑒定了待鑒定昆蟲(chóng)，此方法更為簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確。

目前，十二齒小蠹并未被列為我國(guó)重點(diǎn)關(guān)注的檢疫性有害生物名錄，但該蟲(chóng)僅在我國(guó)的幾個(gè)省區(qū)有分布，且該蟲(chóng)是全國(guó)口岸截獲頻率較高的小蠹種類(lèi)之一，據(jù)動(dòng)植物檢疫信息資源共享服務(wù)平臺(tái)統(tǒng)計(jì)全國(guó)口岸于2010—2021年共截獲181次，分別從烏克蘭、阿根廷、加蓬、法國(guó)、立陶宛、美國(guó)、德國(guó)、菲律賓、加拿大、愛(ài)沙尼亞、澳大利亞和英國(guó)等國(guó)家截獲。其成蟲(chóng)、幼蟲(chóng)均可造成危害，且寄主是我國(guó)常見(jiàn)松屬、云杉屬植物等針葉樹(shù)，分布遍及全國(guó)，因此該蟲(chóng)極易在我國(guó)找到適宜的生活環(huán)境，對(duì)我國(guó)林業(yè)造成嚴(yán)重威脅。因此，建議各監(jiān)管部門(mén)應(yīng)加強(qiáng)對(duì)該蟲(chóng)的檢疫力度，研究針對(duì)該蟲(chóng)的檢疫處理措施，防止其進(jìn)一步擴(kuò)散。

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