扁吻魚爛鰓病病原分離鑒定及藥敏試驗

封永輝，焦 飛，李曉東，韓軍軍，陳 朋，海薩·艾也力汗

（新疆維吾爾自治區(qū)水產科學研究所，新疆 烏魯木齊 830000）

扁吻魚（Aspiorhynchus laticeps） 又名新疆大頭魚，屬鯉形目鯉科裂腹魚亞科扁吻魚屬。該魚是塔里木河盆地動物區(qū)系中的旗艦性物種，僅分布于塔里木河水系，是中國新疆獨有的魚類，具有極高的經濟和學術研究價值。該魚曾廣泛分布于塔里木河水系的博斯騰湖、羅布泊等地，但因多重因素的影響，目前該魚的自然種群數量急劇下降，1988 年被列為國家I 類保護水生野生動物，1998 年被收錄入《中國瀕危動物紅皮書（魚類）》[1]。

目前關于新疆扁吻魚的研究集中在生態(tài)、生物學、資源調查、胚胎發(fā)育等方面[2-5]，在扁吻魚的病害研究方面，只有馬燕武等[6]對魚苗的寄生蟲病防治進行初步研究，謝春剛等[7]對扁吻魚幼魚進行了7 種藥物的急性毒性試驗，對細菌性病害的深入研究尚未見報道。在以往開展的扁吻魚人工繁育試驗過程中，經常發(fā)生爛鰓引起的魚類死亡事件，但其體表和內部臟器卻正常，筆者從扁吻魚爛鰓部位及其水體中分離出了5 株菌株，以這5 株菌株為研究對象，進行耐藥性試驗，以期確定病原菌的耐藥性，為扁吻魚的人工繁育和保種工作提供必要的技術參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗用魚發(fā)病扁吻魚，鰓絲糜爛，體表及解剖體內重要組織器官未見異常（如圖1），采集新疆水生野生動物救護中心發(fā)病的扁吻魚5尾作為試驗材料。

圖1 發(fā)病扁吻魚

1.1.2 主要試劑培養(yǎng)基RS、TSA、MH、MHA（青島海博生物有限公司和廣州環(huán)凱微生物科技有限公司）；藥敏紙片多西環(huán)素30 μg/片、甲氧芐啶5 μg/片、恩諾沙星10 μg/片、新霉素30 μg/片（杭州天和微生物試劑有限公司）；藥敏紙片土霉素30 μg/片、氟苯尼考30 μg/片（上海源葉生物科技有限公司）；PCR、引物及提取試劑盒[生工生物工程（上海）股份有限公司]；60 mm 一次性平板。

1.2 試驗方法

1.2.1 病原菌分離取剛剛死亡的扁吻魚5 尾，在無菌環(huán)境下取下爛鰓，接種于RS 一次性平板上，置于18℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～36 h，挑取菌落形態(tài)大小、顏色不一樣的菌落分別進一步劃線純化，分離純化后的單菌株用25%的甘油保存于－20℃冰箱中。

1.2.2 病原菌16S rDNA 序列分析病原菌的分子鑒定交由上海海洋大學完成，16S rDNA 序列分析采取通用引物，正向27F：5′-AGAGTTTGATC（C/A）TGGC TCAG-3′，反向1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACT T-3′。參照常規(guī)方法進行PCR 反應擴增目的片段。擴增產物確定為目的片段后送生工生物工程（上海）股份有限公司純化及測序。

1.2.3 系統(tǒng)發(fā)育樹構建將擴增的菌株16S rDNA 目的片段序列在NCBI 中比對，根據比對結果檢索出同源性較高的序列采用Clustal X 軟件進行多序列匹配分析，采用MEGA5.0 軟件中的Neighbor-Joining 法構建系統(tǒng)進化樹，以1 000 次Bootstrap 檢驗置信度[8]。

1.2.4 藥敏特性研究通過紙片擴散法進行藥敏特性相關研究，將分離的菌株接種于MH 培養(yǎng)基，18℃震蕩（200 r/min） 24 h 后，調整菌液濃度為2.0×107CFU/mL，取200 μL 菌液均勻涂布在MH、TSA、RS平板上，貼上6 種不同的抗生素紙片，分別在10、20、30℃下培養(yǎng)18～46 h 后用游標卡尺測量不同藥物的抑菌圈直徑（cm）, 根據表1 判定菌株對抗生素的敏感性[9-11]。

表1 藥敏紙片判定標準

2 結果與分析

2.1 優(yōu)勢菌株的菌落形態(tài)

從患病扁吻魚的爛鰓及水樣中分離出顏色、菌落形態(tài)不同的5 株優(yōu)勢菌進行純化鑒定，其菌落形態(tài)特征詳見表2。其中，編號33、36 和38 的菌株是從扁吻魚鰓中分離純化的，而編號35 和37 的菌株來源于養(yǎng)殖扁吻魚的水樣。

表2 5 株優(yōu)勢菌株的來源及菌落形態(tài)

2.2 優(yōu)勢菌株的生長曲線

從圖2 中可以看出，5 株細菌采用MH 培養(yǎng)基在18℃培養(yǎng)時，0～18 h 都處于適應期；編號33 的菌株在22～26 h 處于穩(wěn)定期，隨后進入衰亡期；編號35 的菌株在培養(yǎng)22 h 時最先達到生長高峰，隨后OD450值顯著降低，培養(yǎng)24～28 h 時OD450值維持在相對穩(wěn)定的狀態(tài)，說明菌株生長已經到達穩(wěn)定期；編號36 的菌株在18 h 進入對數生長期，到26 h 時OD450值達到最大值，隨后急劇下降，培養(yǎng)28 h 時，OD450值僅為0.599，可能菌株搖瓶培養(yǎng)時，因各種理化因子影響無穩(wěn)定期；編號37 的菌株在培養(yǎng)28 h 時，OD450值達到頂峰，隨后也是急劇下降，到32 h時OD450值僅為2.769，可能菌株在這期間釋放了細胞死亡物質，到達穩(wěn)定期后，快速進入衰亡期；編號38 的菌株在18～28 h 處于對數生長期，在28～32 h 處于穩(wěn)定期，隨后進入衰亡期。

圖2 5 株優(yōu)勢菌株的生長曲線

2.3 菌株的分子鑒定

對5 種優(yōu)勢菌株的16S rDNA 進行PCR 擴增，將目的基因序列與NCBI 基因庫中已有序列進行比對，并構建系統(tǒng)發(fā)育樹，結果如圖3 所示，菌株33（序列號：OK287125）、37（序列號：OK287129）、38（序列號：OK287130）與檸檬酸桿菌屬（Citrobactersp.），菌株35（序列號：OK287127）、36（序列號：OK287128）與氣單胞菌屬（Aeromonassp.）種類同源性較高。

圖3 五株細菌根據16S rDNA 基因序列構建的系統(tǒng)進化樹

2.4 影響優(yōu)勢菌株對抗生素敏感性的因素

2.4.1 培養(yǎng)基由表3 可知，對土霉素敏感的菌株為33 和38，對恩諾沙星敏感的菌株為35、37 和38，對氟苯尼考敏感的菌株為33、35、36 和38，對多西環(huán)素敏感的菌株為33 和38，5 種菌株對新霉素和甲氧芐啶均不敏感。6 種抗生素種類、5 株菌株共30 組數據中有11 組數據的結果一致，占比為37%，表明培養(yǎng)基會影響菌株對抗生素的敏感性，且影響較大；從菌株來看，33 號菌株在不同培養(yǎng)基中培養(yǎng)對土霉素、氟苯尼考和多西環(huán)素的敏感性一致，35 號菌株在不同培養(yǎng)基中培養(yǎng)對恩諾沙星、氟苯尼考的敏感性一致，36 號菌株在不同培養(yǎng)基中培養(yǎng)對氟苯尼考的敏感性一致，37 號菌株在不同培養(yǎng)基中培養(yǎng)對恩諾沙星的敏感性一致，38 號菌株在不同培養(yǎng)基中培養(yǎng)對土霉素、恩諾沙星、氟苯尼考和多西環(huán)素的敏感性一致；從抗生素來看，培養(yǎng)基對氟苯尼考和恩諾沙星的影響較小，5 株菌株中分別有4（占比80%）和3 株（占比60%）的敏感性結果一致，但對新霉素和甲氧芐啶的影響較大，同一菌株在不同培養(yǎng)基中培養(yǎng)對這2 種抗生素的敏感性結果均不一樣。

表3 不同培養(yǎng)基培養(yǎng)下各菌株的藥敏試驗結果

2.4.2 培養(yǎng)時間由表4 可知，培養(yǎng)18～22 和48～46 h 期間，5 株菌株對土霉素、恩諾沙星、氟苯尼考、甲氧芐啶和多西環(huán)素均表現為敏感，而新霉素只對35號菌株作用較強，對33、36、37、38 號菌株有一定抑制作用。從表4 中還可以看出，培養(yǎng)時間對抗生素藥物敏感性的結果無明顯影響，不同培養(yǎng)時間的同一菌株對同一抗生素的敏感性結果均表現一致。

表4 不同培養(yǎng)時間培養(yǎng)下各菌株的藥敏試驗結果

2.4.3 培養(yǎng)溫度由表5 可知，培養(yǎng)溫度對抗生素藥物敏感性的結果有一定的影響，除38 號菌株外，其他4 種菌株在10℃下培養(yǎng)對土霉素均未形成抑菌圈。從菌株來看，培養(yǎng)溫度對36 和38 號菌株的影響最小，不同溫度下培養(yǎng)的36 號菌株對同一抗生素（土霉素除外）的敏感性均表現一致，除新霉素以外不同溫度下培養(yǎng)的38 號菌株對其他抗生素均表現敏感；而對33 號菌株影響最大，不同溫度下培養(yǎng)的33 號菌株僅對氟苯尼考和多西環(huán)素的敏感性一致。從抗生素來看，不同溫度下培養(yǎng)的5 種菌株對土霉素、氟苯尼考和多西環(huán)素均表現敏感；對恩諾星沙表現敏感的菌株有35、36 和38 號；對甲氧芐啶表現敏感的菌株有36、37 和38 號；而新霉素對36 和37 號菌株表現為抑制作用；其他未提及的處理，菌株對抗生素的敏感性隨培養(yǎng)溫度變化而表現出一定差異，但總體來看6 種抗生素對5 種菌株均表現出抑制以上的作用。

表5 不同培養(yǎng)溫度培養(yǎng)下各菌株的藥敏試驗結果

3 討 論

國內的藥敏試驗多采用人用或獸用藥物如青霉素、氨芐西林、復方新諾[12]、慶大霉素、卡那霉素[13]、頭孢菌素類[14]、四環(huán)素[15]等，也有用水產禁用藥物氯霉素、停用藥物諾氟沙星[16-17]、氧氟沙星[18]、培氟沙星做基礎研究的，很少能有用《水產養(yǎng)殖用藥明白紙》中允許使用的抗生素來做基礎研究的，該研究采用水產生產實踐中常用抗生素作為藥敏試驗材料，試驗結果可以直接指導生產實踐，同時探討了培養(yǎng)基、培養(yǎng)時間、培養(yǎng)溫度3 個因素對藥敏結果的影響，最終判定，對土霉素敏感的菌株為33 和38 號，對恩諾沙星敏感的菌株為35 和38 號，對氟苯尼考敏感的菌株為33、35、36 和38 號，對多西環(huán)素敏感的菌株為33 和38 號，5 個菌株對新霉素和甲氧芐啶均不敏感；培養(yǎng)時間對藥敏試驗結果的影響較小，而培養(yǎng)基和培養(yǎng)溫度對藥敏試驗結果的影響較大，急需建立水生動物致病生物藥物敏感性的基礎數據庫，包括菌株、藥物、區(qū)域、培養(yǎng)條件等試驗參考標準數據庫，以便今后漁業(yè)生產應用中避免盲目用藥[19]。

該研究采用的對照菌株為E.coli（ATCC25922），但其在10 和20℃時均不生長，只有在30℃下才生長，因此今后還需摸索試驗用藥敏標準菌株；同時，對水生動物病原菌藥敏試驗的標準方法也尚待完善。另外，該研究中編號33、36、38 的菌株是否為真正的致病性菌株，也需后續(xù)攻毒試驗進一步確認。