譚國輝，王澤行，王汝鑫，張月星，任夢凡，陳蘇丹*

（河南科技大學園藝與植物保護學院，河南洛陽 471000）

本研究采用單因素和正交試驗設計，在超聲波提取紫葉李葉片總多酚工藝優(yōu)化的基礎上，測定紫葉李葉片總多酚提取物對DPPH·、·OH 和O2·的清除能力，為紫葉李的充分利用和發(fā)展提供理論依據(jù)。

1 試驗材料及主要儀器

在2020 年7 月，于河南科技大學開元校區(qū)采取長勢一致、無病蟲害為害的紫葉李葉片。

所用試劑為沒食子酸、無水乙醇、福林酚試劑（上海藍季科技公司）、20%碳酸鈉、DPPH（上海藍季生物科技公司）、Vc、FeSO4溶液、水楊酸、雙氧水、鄰苯三酚、Tris-HCl、濃鹽酸。所用主要儀器為HX-HH5A4 型恒溫水浴鍋（深圳市力通世紀科技有限公司）、可見分光光度計（上海精密科學儀器有限公司）、KQ-500B 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）、Allegra TM64Centrifuge 型高速冷凍離心機（美國Beckman Coulter 公司）。

2 試驗方法

2.1 紫葉李葉片總多酚物質(zhì)提取

取一定量的紫葉李葉片沖洗干凈，在干燥箱中40℃干燥至恒重。粉碎后過篩，經(jīng)精密計算稱得0.5g的細粉，放入100mL 三角瓶中，按相應的料液比加入相應體積分數(shù)的乙醇溶液，搖勻后用封口膜封住瓶口，然后放在恒溫水浴鍋中，在一定溫度下提取一段時間，再進行超聲提取，在高速冷凍離心機中離心，取上清液，得到紫葉李葉片多酚提取液。

2.2 沒食子酸標準曲線的繪制

2.2.1 對照溶液的制備。量取0.5mL 福林酚試劑于10mL 容量瓶中，后取2mL 20%碳酸鈉溶液與福林酚反應，最后定容至10mL。避光靜置2h。

2.2.2 標準曲線繪制。參照高劍[7]的方法并做適當改動，得到回歸方程y=1.2728x+0.0455，相關(guān)系數(shù)R2=0.9992。

2.2.3 總多酚得率的計算。按“2.1”方法制備紫葉李葉片多酚提取液，將提取液定容至50mL，精密量取該溶液1mL，置于10mL 容量瓶中，用體積分數(shù)為50%的乙醇進行定容。精確吸取1.0mL 溶液，再置于10mL 容量瓶中定容，在760nm 波長處測定吸光度，根據(jù)下式計算紫葉李總多酚得率，計算公式如下：

式中：ρ 為所供試驗溶液中總多酚的質(zhì)量濃度（g/L），V 為提取液的體積（mL），K 為總多酚提取液的稀釋倍數(shù)，m 為提取所用紫葉李葉片的質(zhì)量（g）。

2.3 單因素試驗

2.3.1 料液比。按料液比為1∶60、1∶70、1∶80、1∶90、1∶100 分別加入50%乙醇，混合后，在恒溫水浴鍋中60℃下進行水浴提取40min，然后在500W 的功率下通過超聲波提取40min，最后在8000r/min、25℃條件下離心15min。

2.3.2 乙醇體積分數(shù)。按料液比為1∶90 分別加入30%、40%、50%、60%、70%的乙醇溶液，混合后，在恒溫水浴鍋中60℃下進行水浴提取40min，然后在500W 的功率下通過超聲波提取40min，最后在8000r/min、25℃條件下離心15min。

2.3.3 水浴提取溫度。按料液比為1∶90 加入60%的乙醇溶液，混合后，在40、50、60、70、80℃下先進行水浴提取40min，然后在500w 的功率下通過超聲波提取40min，最后在8000r/min、25℃條件下離心15min。

2.3.4 超聲提取時間。按料液比為1∶90 加入60%的乙醇溶液，混勻之后，在40℃下先進行水浴提取40min，然后在500w 的功率下通過超聲波提取20、30、40、50、60min，最后在8000r/min、25℃條件下離心15min。

2.4 正交試驗

基于單因素試驗條件的優(yōu)化結(jié)果，通過L9（34）正交試驗設計，在超聲提取功率為500w 條件下，利用對乙醇體積分數(shù)、超聲提取時間、水浴提取溫度和料液比進行四個因素三組合水平的正交試驗，確定了紫葉李葉片總多酚最佳超聲輔助提取工藝條件，正交試驗設計如表1 所示。

表1 紫葉李葉片總多酚提取的正交試驗設計

2.5 紫葉李葉片對3 種自由基的清除能力測定方法

2.5.1 紫葉李葉片總多酚對DPPH·清除能力測定。使用狄科等[8]和楊艷等[9]中的研究方法并對其加以適當濃度調(diào)整，稱取0.0099g 的DPPH，并用無水乙醇稀釋至250mL。取不同質(zhì)量濃度的總多酚溶液2mL 于試管內(nèi)，分別加入制備的0.1mol/L 的DPPH 乙醇溶液2mL 于試管內(nèi)?；靹蚝?，在黑暗室溫條件下反應30min，在517nm 波長處測量吸光度A1，測量0.1mol/L 的DPPH乙醇溶液2mL 和無水乙醇2mL 的混合液的吸光度A2，及不同質(zhì)量濃度的總多酚溶液2mL 和2mL 無水乙醇混合液的吸光值A0，以Vc 作為陽性對照，DPPH·清除率（Y）計算公式（2）為：

2.5.2 紫葉李葉片總多酚對羥基自由基的清除能力測定。采用閆旭宇等[10]的方法并進行修改。稱取0.0912g的7H2O·FeSO4、0.0829g 水楊酸，分別用無水乙醇定容至100mL。取不同質(zhì)量濃度總多酚溶液2mL，依次加入2mL 濃度為6mmol/L 的硫酸亞鐵、30%的過氧化氫和水楊酸溶液，避光反應30min，在4000r/min 的轉(zhuǎn)速下離心10min，在510nm 波長下測定樣液的吸光度，記為A1。用蒸餾水代替上述水楊酸溶液，按上述條件下反應，記為A2；用蒸餾水代替上述總多酚溶液，在上述條件下反應，記為A0。以Vc 作為陽性對照，同等條件下反應。根據(jù)公式計算清除率。羥基自由基清除率（Y）計算公式（3）為：

2.5.3 紫葉李葉片總多酚對O2·的清除能力測定。采用謝碧秀等[11]及張蕾等[12]的方法并進行修改。稱取0.3153g 鄰苯三酚于100mL 容量瓶中，用10.00mmol/L的鹽酸定容，制成25.00mmol/L 溶液；0.2mol/L 的Tris溶液50mL 與0.2mol/L 的HCl 溶液21.9mL 混勻，稀釋至200mL。于試管中分別加入0.05mol/L 的Tris-HCL溶液（pH 值8.2）4.5mL，置于25℃水浴20min。加入不同質(zhì)量濃度的多酚溶液2mL 和25℃保溫過的鄰苯三酚（10mol/LHCl 配置）0.08mL，加入后快速搖勻，25℃恒溫水浴4min 后，立即加入2 滴8mol/L 的HCl，終止反應，并測定325nm 波長下的吸光值，用Vc 作為陽性對照。O2·清除率（4）計算公式為：

3 結(jié)果與分析

3.1 紫葉李葉片總多酚提取的單因素試驗結(jié)果

3.1.1 料液比對總多酚提取的影響。由圖1 可知，隨著料液比的減小，紫葉李葉片總多酚得率在1∶60～1∶80 相對平緩地增加，但當料液比到達1∶90 時，總多酚得率達到峰值，此時總多酚得率為2.56mg/g。當料液比超過1∶90 后，總多酚得率下降，可能是因為在1∶90 總多酚的溶解率達到飽和。故選取1∶90 為宜。

圖1 料液比對紫葉李葉片總多酚得率的影響

3.1.2 乙醇體積分數(shù)對總多酚提取的影響。由圖2 可知，紫葉李葉片總多酚得率在乙醇體積分數(shù)為30%～40%時上升較快，在乙醇體積分數(shù)為40%～60%時上升緩慢，當乙醇體積分數(shù)超過60%時，總多酚得率達到峰值，為2.03mg/g。繼續(xù)提高乙醇體積分數(shù)，得率降低。在提取的溶液含量過高時，由于某些化合物如醇溶性雜質(zhì)等成分溶出量增多，導致總多酚不易溶出，從而引起總多酚得率降低，還增加了成本，考慮到提取得率和成本，最后確定乙醇體積分數(shù)為60%為佳。

圖2 乙醇體積分數(shù)對紫葉李葉片總多酚得率的影響

3.1.3 超聲提取時間對總多酚提取的影響。由圖3 可知，當超聲波提取時間為20～40min 時，得率隨著提取時間的延長而增加，當提取時間達到40min 時，最高為1.97mg/g。當提取時間超過40min 時，得率緩慢下降。這可能是因為總多酚具有多酚羥基，很容易被空氣中的氧氣氧化。長時間加熱后會分解，得率降低。因此，最佳提取時間為40min。

圖3 超聲提取時間對紫葉李葉片總多酚得率的影響

3.1.4 提取溫度對總多酚提取的影響。由圖4 可知，當提取溫度為30～40℃時，得率迅速增加，在40℃時達到最大值，為2.12mg/g。當提取溫度超過40℃時，得率緩慢下降。但當提取溫度過高時，總多酚的結(jié)構(gòu)容易被氧化破壞，乙醇容易揮發(fā)。同時，雜質(zhì)的溶解也會增加，導致總多酚的減少，得率下降。因此，最佳萃取溫度為40℃。

圖4 提取溫度對紫葉李葉片總多酚得率的影響

3.2 紫葉李葉片總多酚提取的正交試驗結(jié)果

由表2 中的極差R 數(shù)據(jù)分析得知，正交試驗提取條件中的4 個因素，對總多酚物質(zhì)提取率的影響程度依次為D＞A＞C＞B，即料液比＞乙醇體積分數(shù)＞水浴提取溫度＞超聲提取時間。從實測值差異顯著性數(shù)據(jù)k1～k3可以得出，紫葉李中總多酚的超聲最佳提取工藝條件參數(shù)為A2B2C2D1，即乙醇體積分數(shù)為60%、料液比為1∶80g/mL、水浴提取溫度為40℃和超聲提取時間為40min。對得到的最佳工藝提取條件進行驗證試驗，測得3 次總多酚得率的平均值為4.75mg/g，相對標準偏差RSD 為1.16%，表明此工藝是有效的。

表2 紫葉李葉片總多酚提取的正交設計及結(jié)果

3.3 紫葉李葉片總多酚對3 種自由基清除能力測定分析

3.3.1 紫葉李葉片總多酚對DPPH·清除率的測定結(jié)果。由圖5 可知，紫葉李葉片總多酚和Vc 對DPPH·均具有一定清除效果，隨著質(zhì)量濃度的增加，清除率逐漸提高。當質(zhì)量濃度大于0.03mg/mL 時，Vc 對DPPH·的清除率的上升趨勢緩慢，0.03、0.04mg/mL 時，二者清除率分別增加8.5%和10.5%，紫葉李葉片總多酚上升趨勢較Vc 快；當質(zhì)量濃度為0.04mg/mL 時，二者對DPPH·的清除能力均達到頂峰，此時紫葉李葉片總多酚的清除率達到53.3%，Vc 的清除率達到72.7%。與同一質(zhì)量濃度的Vc 相比，紫葉李葉片總多酚對DPPH·具有一定的清除能力。

圖5 紫葉李葉片總多酚對DPPH·的清除作用

3.3.2 紫葉李葉片總多酚對·OH 清除率的測定結(jié)果。由圖6 可知，紫葉李葉片總多酚和Vc 對·OH 的清除效果，都隨著其質(zhì)量濃度的增加而呈上升趨勢。當質(zhì)量濃度為0.04mg/mL 時，二者對·OH 的清除能力達到頂峰，紫葉李葉片總多酚的清除率達到70.7%，Vc 的清除率達到86.7%。與同等質(zhì)量濃度的Vc 相比，紫葉李葉片總多酚對·OH 具有一定的清除能力。

圖6 紫葉李葉片總多酚對·OH 的清除作用

3.3.3 紫葉李葉片總多酚對O2·清除率的測定結(jié)果。由圖7 可知，當質(zhì)量濃度為0.02mg/mL 時，紫葉李葉片總多酚和Vc 的清除率分別為70.0%和87.8%；質(zhì)量濃度大于0.02mg/mL 時，紫葉李葉片總多酚和Vc 對O2·的清除能力趨于穩(wěn)定上升。質(zhì)量濃度為0.04mg/mL 時，二者對O2·的清除能力達到最大，紫葉李葉片總多酚的清除率為78.67%，Vc 的清除率為90.48%。與同一質(zhì)量濃度的Vc 相比，紫葉李葉片總多酚對O2·具有良好的清除能力。

圖7 紫葉李葉片總多酚對O2·的清除作用

4 討論與結(jié)論

汪洪濤等[1]對紫葉李果實總多酚提取工藝的研究結(jié)果表明，在最佳工藝下提取的總多酚得率為18.13mg/g；高劍等[7]報道，紫葉李皮中總多酚在最優(yōu)提取工藝下的得率為55.3mg/g；Song W[13]等測定紫葉李葉片中提取的總多酚得率為（117.8±8.8）mg/g，枝條中提取的總多酚得率為（100.04±1.9）mg/g；而本研究發(fā)現(xiàn)紫葉李不同部位的總多酚含量存在一定的差異，并且紫葉李總多酚的含量受栽培類型、提取方法、成熟度、生長環(huán)境、生長季節(jié)、生長地區(qū)等的影響。

茹巧美等[14]研究表明，紫蘇葉多酚對DPPH·、·OH和O2·的IC50 分別為70.81，60.21，73.44μg/mL；李芬芳等[15]研究表明，當草莓多酚濃度為0.16mg/mL 時，對DPPH·的清除率達到93.33%，對·OH 抑制率達78.68%，抗超氧陰離子能力達165.16U/L；楚紅英等[16]抗氧化試驗結(jié)果表明,當金錢草多酚濃度為500μg/mL時，對DPPH·、·OH 和O2-·的清除率分別為68.3%、87.6%、88.0%。通過比較分析得出，紫葉李葉片多酚提取物具有良好的抗氧化能力，對O2·的清除能力較好，與同一質(zhì)量濃度的Vc 相比，清除能力稍低，并且總多酚的抗氧化能力受多酚濃度、植物種類、提取方法和提取部位等的影響。這為紫葉李多酚的進一步研究及應用提供依據(jù)和參考。