過(guò)氧乙酸協(xié)同次氯酸鈉對(duì)植物乳桿菌噬菌體的復(fù)合滅活效果

郭蛇，李偉娜，馬瑞瑞，朱含芳，陳霞

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室農(nóng)業(yè)農(nóng)村部奶制品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)蒙古自治區(qū)乳品生物技術(shù)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特 010018）

0 引言

植物乳桿菌是定殖人體腸道的原籍菌，擁有降低膽固醇，調(diào)節(jié)腸道菌群紊亂等多種益生功效[1-3]。該菌株常被用在發(fā)酵制品中發(fā)揮其益生作用。然而，在發(fā)酵過(guò)程中，噬菌體污染是導(dǎo)致產(chǎn)品發(fā)酵失敗的主要原因之一。目前，乳制品加工行業(yè)常用的殺菌措施是使用化學(xué)殺菌劑進(jìn)行處理。在工廠(chǎng)中使用的化學(xué)殺菌劑必須符合濃度低、殘留量少、對(duì)人體無(wú)害的標(biāo)準(zhǔn)，需要通過(guò)特定的殺菌測(cè)試才被允許使用[4-5]。過(guò)氧乙酸是一種綠色且分解產(chǎn)物無(wú)毒的化學(xué)殺菌劑，但其單獨(dú)使用時(shí)，對(duì)真菌或病毒的滅活效果并不顯著[6-7]。近年來(lái)將化學(xué)殺菌劑復(fù)配使用已成為一個(gè)研究熱點(diǎn)，大量研究表明，化學(xué)殺菌劑復(fù)配使用可提高對(duì)微生物的滅活效果，降低其不良作用[8]。

噬菌體P1、P2 均分離自植物乳桿菌IMAU10120異常發(fā)酵液，前期研究表明單獨(dú)使用0.45%過(guò)氧乙酸處理60 min 仍不能使這兩株噬菌體完全滅活[9-10]。因此，本研究將過(guò)氧乙酸與其他化學(xué)殺菌劑復(fù)配使用，評(píng)估常見(jiàn)化學(xué)消毒劑復(fù)配對(duì)噬菌體的滅活效果，為工業(yè)生產(chǎn)中噬菌體防治措施的建立提供一定的數(shù)據(jù)支持和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及噬菌體

宿主菌植物乳桿菌IMAU10120 及噬菌體P1、P2均保藏于內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)“乳品生物技術(shù)與工程”教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備

UV-1700 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，日本島津株式會(huì)社分析儀器部；DHP-9272 電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；SX-500 高壓蒸汽滅菌鍋，日本Tomy Digital Biology；DL-CJ-2F 超凈工作臺(tái)，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；EP pendorf 5810R 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Hambury 公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株活化

將宿主菌植物乳桿菌IMAU10120 以2%接種量接種于5 mL MRS 液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，連續(xù)3 天傳代活化，置于4 ℃冰箱備用。

1.2.2 噬菌體增殖

將活化3 代的宿主菌IMAU10120 以2%的接種量接入5 mL MRS 液體培養(yǎng)基中，置于37 ℃培養(yǎng)至OD600約為0.5 時(shí)，按感染復(fù)數(shù)5 加入噬菌體裂解液，加入CaCl2至終濃度為10 mmol/L，充分混勻后置于37 ℃培養(yǎng)3～4h 至菌液清澈，將其移入滅菌后的離心管中，8000 rpm 離心5 min，用0.22 μm 的濾菌膜過(guò)濾，置于4 ℃保存?zhèn)溆?。采用雙層平板法對(duì)噬菌體效價(jià)進(jìn)行測(cè)定。

1.2.3 過(guò)氧乙酸協(xié)同次氯酸鈉對(duì)植物乳桿菌的滅活效果

（1）過(guò)氧乙酸與次氯酸鈉直接混合對(duì)宿主菌的滅活效果。將2.25 mL 不同濃度次氯酸鈉與2.25 mL 0.3%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）過(guò)氧乙酸溶液直接混合后，搖勻，加入500 μL 的宿主菌混勻，室溫培養(yǎng)10 min，采用平板活菌計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)，37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h 計(jì)算其活菌數(shù)。

（2）過(guò)氧乙酸與次氯酸鈉依次處理對(duì)宿主菌的滅活效果。將0.3%過(guò)氧乙酸溶液分裝2.25 mL 于試管中，加入500 μL 宿主菌混勻，室溫培養(yǎng)5 min 后，再加入2.25 mL 不同濃度次氯酸鈉溶液，混合搖勻，繼續(xù)培養(yǎng)5 min 后取出，采用平板活菌計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)，37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h 計(jì)算其活菌數(shù)。

（3）次氯酸鈉與過(guò)氧乙酸依次處理對(duì)宿主菌的滅活效果。將不同濃度次氯酸鈉溶液分裝2.25 mL 于試管中，加入500 μL 宿主菌混勻后，室溫培養(yǎng)5 min 后，加入2.25 mL 0.3%過(guò)氧乙酸溶液，混合均勻，繼續(xù)培養(yǎng)5 min 后取出，采用平板活菌計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)，37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h 計(jì)算其活菌數(shù)。

（4）對(duì)照實(shí)驗(yàn)。將0.3%過(guò)氧乙酸及不同濃度次氯酸鈉溶液分裝4.5 mL 于試管，接入500 μL 的宿主菌，混合均勻后室溫培養(yǎng)10 min，采用平板活菌計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)，37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h 計(jì)算其活菌數(shù)。

1.2.4 過(guò)氧乙酸協(xié)同次氯酸鈉對(duì)噬菌體的滅活效果

（1）過(guò)氧乙酸與次氯酸鈉直接混合對(duì)噬菌體的滅活效果。將450 μL 不同濃度次氯酸鈉溶液與450 μL 0.3%過(guò)氧乙酸溶液直接混合后分裝于1.5 mL 的EP 管中，搖勻后加入100 μL 噬菌體混勻，室溫培養(yǎng)10 min，10 倍梯度稀釋后采用雙層平板法對(duì)處理后的噬菌體計(jì)數(shù)（計(jì)數(shù)過(guò)程控制在3 min 內(nèi)完成），37 ℃培養(yǎng)24 h，計(jì)算其滅活效果。

（2）過(guò)氧乙酸與次氯酸鈉依次處理對(duì)宿主菌的滅活效果。將0.3%過(guò)氧乙酸溶液分裝450 μL 于1.5 mL的EP 管中，分別加入100 μL 噬菌體裂解液混勻，室溫培養(yǎng)5 min 后，分別加入450 μL 不同濃度次氯酸鈉溶液，混合搖勻，繼續(xù)培養(yǎng)5 min 取出，10 倍梯度稀釋后采用雙層平板法對(duì)處理后的噬菌體計(jì)數(shù)（計(jì)數(shù)過(guò)程控制在3 min 內(nèi)完成），37 ℃培養(yǎng)24 h，計(jì)算其滅活效果。

（3）次氯酸鈉與過(guò)氧乙酸依次處理對(duì)宿主菌的滅活效果。將不同濃度次氯酸鈉溶液分裝450 μL 于1.5 mL EP 管中，分別加入100 μL 噬菌體裂解液后充分混勻，室溫培養(yǎng)5 min 后，分別加入0.3%過(guò)氧乙酸溶液，混合均勻，繼續(xù)培養(yǎng)5 min 后取出，10 倍梯度稀釋后采用雙層平板法對(duì)處理后的噬菌體計(jì)數(shù)，37 ℃培養(yǎng)24 h，計(jì)算其滅活效果。

（4）對(duì)照實(shí)驗(yàn)。將不同濃度次氯酸鈉溶液分裝900 μL 于1.5 mL 的EP 管中，并加入100 μL 的噬菌體裂解液，混勻，室溫培養(yǎng)10 min 后，10 倍梯度稀釋后采用雙層平板法對(duì)處理后的噬菌體進(jìn)行計(jì)數(shù)（計(jì)數(shù)過(guò)程需在3 min 內(nèi)完成），37 ℃培養(yǎng)24 h，計(jì)算滅活效果。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

以單一化學(xué)試劑處理的噬菌體裂解液作為對(duì)照，所有獨(dú)立試驗(yàn)均進(jìn)行3 次平行試驗(yàn)。數(shù)據(jù)均采用Origin 2018 軟件作圖分析。使用SPSS 軟件(IBM Corp., Armonk, NY)，采用單向方差分析，比較數(shù)據(jù)間顯著性差異（p< 0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 過(guò)氧乙酸與次氯酸鈉復(fù)合處理對(duì)植物乳桿菌IMAU10120 的滅活效果

過(guò)氧乙酸具有強(qiáng)氧化性及易揮發(fā)的特性，食品工業(yè)中常使用的滅菌濃度為0.2%～0.5%，其通過(guò)破壞細(xì)胞膜，氧化蛋白質(zhì)，損傷核酸等方式使微生物滅活[11-12]。對(duì)照試驗(yàn)表明，0.3%過(guò)氧乙酸單獨(dú)處理植物乳桿菌10 min后，植物乳桿菌的存活率為10.06%。0.3%過(guò)氧乙酸與不同濃度次氯酸鈉復(fù)配處理植物乳桿菌IMAU10120 的滅菌效果如圖1 所示。

圖1 0.3%過(guò)氧乙酸與不同濃度次氯酸鈉溶液復(fù)合處理植物乳桿菌的存活率

由圖1 可知，單獨(dú)使用次氯酸鈉處理宿主菌，隨著次氯酸鈉濃度增加，植物乳桿菌IMAU10120 的存活率顯著降低（p＜0.05）。次氯酸鈉濃度為800 mg/kg時(shí)，先加次氯酸鈉處理5 min 后，再加0.3%過(guò)氧乙酸處理5 min 對(duì)宿主菌的滅菌效果最強(qiáng)，宿主菌的存活率為0.38%。當(dāng)次氯酸鈉濃度為400 mg/kg 時(shí)，除直接混合處理方式，其余復(fù)合滅活效果均優(yōu)于對(duì)照組。當(dāng)次氯酸鈉濃度為100 mg/kg、200 mg/kg 時(shí)，次氯酸鈉處理5 min 后，再加0.3%過(guò)氧乙酸處理5 min 的滅活效果較同濃度的其他處理方式好，宿主菌的存活率分別為12.21%，12.16%。

2.2 過(guò)氧乙酸與次氯酸鈉復(fù)合處理對(duì)噬菌體P1 的滅活效果

噬菌體P1 的初始效價(jià)為8.16 lg PFU/mL。單獨(dú)使用0.3%過(guò)氧乙酸處理10 min 噬菌體P1 后，其效價(jià)下降1.05 個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)，滅活效果有限，故評(píng)價(jià)0.3%過(guò)氧乙酸與不同濃度次氯酸鈉復(fù)合使用后對(duì)噬菌體滅活效果的影響有積極意義。0.3%過(guò)氧乙酸和不同濃度次氯酸鈉復(fù)合處理對(duì)噬菌體P1 的滅活結(jié)果如表1 所示。

表1 0.3%過(guò)氧乙酸與不同濃度次氯酸鈉復(fù)合處理噬菌體P1 的存活數(shù) lg PFU/mL

由表1 可知，當(dāng)次氯酸鈉濃度為100 mg/kg 時(shí)，3種復(fù)合處理方式對(duì)噬菌體P1 的滅活效果均優(yōu)于對(duì)照組，其中先加次氯酸鈉處理5 min 后，加0.3%過(guò)氧乙酸再處理5 min 對(duì)噬菌體P1 的滅活效果最佳，與對(duì)照組相比下降了1.79 個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)；當(dāng)次氯酸鈉的濃度為200 mg/kg時(shí)，先加次氯酸鈉處理5 min 后，再加0.3%過(guò)氧乙酸處理5 min 與先加0.3%過(guò)氧乙酸處理5 min，再加次氯酸鈉處理5 min 對(duì)噬菌體P1 的滅活效果無(wú)顯著性差異（p＞0.05）；當(dāng)次氯酸鈉濃度為400 mg/kg 時(shí)，除先加0.3%過(guò)氧乙酸處理5 min 后，再加入次氯酸鈉處理5 min噬菌體的滅活效果較對(duì)照組差，其余復(fù)合滅活效果都優(yōu)于對(duì)照組。推測(cè)滅活效果較對(duì)照組差的原因可能是，添加過(guò)氧乙酸溶液后再加次氯酸鈉溶液，使次氯酸分解濃度增加，有效氯濃度減少，影響滅活效果[13]。當(dāng)次氯酸鈉濃度為800 mg/kg 時(shí)，直接混合的滅活效果最佳，處理10 min后可使噬菌體P1 完全失活。

2.3 過(guò)氧乙酸與次氯酸鈉復(fù)合處理對(duì)噬菌體P2 的滅活效果

噬菌體P2 的初始效價(jià)為8.77 lg PFU/mL。單獨(dú)使用0.3%過(guò)氧乙酸處理10 min 噬菌體P2 后，噬菌體P2的存活率為55.83%，僅使其下降1.11 個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)。表2 為0.3%過(guò)氧乙酸與不同濃度次氯酸鈉復(fù)合處理噬菌體P2的滅活效果。

表2 0.3%過(guò)氧乙酸與不同濃度次氯酸鈉復(fù)合處理噬菌體P2 的的存活數(shù) lg PFU/mL

由表2 可知，同一處理方式，隨著次氯酸鈉的濃度升高，對(duì)噬菌體P2 的滅活作用增強(qiáng)。同一濃度不同處理方式的滅活效果存在顯著差異（p<0.05）。當(dāng)次氯酸鈉濃度為100 和200 mg/kg 時(shí)，直接滅活的噬菌體P2 效價(jià)顯著低于其他滅活方式（p<0.05），并且相較單一滅活的效價(jià)分別降低0.24 和0.49 個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)，與其他濃度相比，低濃度（100 mg/kg 和200 mg/kg）次氯酸鈉對(duì)噬菌體P2 的滅活效果較弱；而當(dāng)次氯酸鈉濃度為400 和800 mg/kg 時(shí)，先加次氯酸鈉處理5 min 后，加入過(guò)氧乙酸處理5 min 對(duì)噬菌體P2 顯示出最佳的滅活效果，噬菌體P2 效價(jià)較單一滅活分別降低了1.16 和0.91 個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)。綜合以上結(jié)果，表明次氯酸鈉的濃度及使用順序?qū)κ删wP2 的滅活效果有影響。

3 討 論

在乳制品和肉制品的發(fā)酵生產(chǎn)中，噬菌體侵染是導(dǎo)致發(fā)酵失敗的最常見(jiàn)原因，這不僅會(huì)給工廠(chǎng)造成經(jīng)濟(jì)損失，還可能導(dǎo)致食源性疾病。因此，研究控制噬菌體侵染的方法，尤其是在開(kāi)發(fā)包括功能性食品在內(nèi)的新型發(fā)酵產(chǎn)品方面顯得尤為重要。使用單一化學(xué)殺菌劑對(duì)噬菌體進(jìn)行滅活是目前工業(yè)上普遍采用的限制噬菌體侵染的重要措施，但是單一化學(xué)殺菌劑的使用對(duì)一些噬菌體滅活效果并不理想。有研究表明，將不同化學(xué)殺菌劑進(jìn)行復(fù)配使用，可增加其對(duì)噬菌體的滅活效果。過(guò)氧乙酸在消毒劑中占有重要的地位，具有廣譜的殺菌能力，是應(yīng)用較廣的消毒劑之一[14]，可作為復(fù)配的化學(xué)殺菌劑使用。

含氯消毒劑可溶于水產(chǎn)生次氯酸類(lèi)消毒劑，次氯酸分子量小，能較好的吸附和穿透微生物細(xì)胞壁，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，直接氧化微生物細(xì)胞內(nèi)含硫基的丙氨酸、色氨酸等，從而控制微生物蛋白質(zhì)的合成以導(dǎo)致微生物死亡[15]。2002年，Suárez 等的研究結(jié)果顯示，100 mg/kg次氯酸鈉可使乳球菌噬菌體001 和QF12 在5 min 內(nèi)完全滅活。噬菌體046 和QP4 經(jīng)100 mg/kg 次氯酸鈉處理后，T99值分別為32.7 和8.8 min，300 mg/kg 和200 mg/kg的次氯酸鈉可使它們分別在45 min、30 min 后表現(xiàn)出完全失活[16]。由此可知，次氯酸鈉可有效滅活上述乳球菌噬菌體。2009年，Marcó 等研究發(fā)現(xiàn)，800 mg/kg 次氯酸鈉對(duì)噬菌體活力的影響最大，15 min 時(shí)可使植物乳桿菌噬菌體B2 完全失活，30 min 時(shí)可使噬菌體B1、FAGK1、FAGK2 完全失活。400 mg/kg 的次氯酸鈉效果略差，5 min 內(nèi)使4 種噬菌體達(dá)到99%滅活；200 mg/kg 的次氯酸鈉對(duì)噬菌體滅活效果不佳，達(dá)到99%滅活的時(shí)間均大于45 min[17]。由此可知，用低濃度次氯酸鈉單獨(dú)對(duì)噬菌體進(jìn)行滅活，可能由于其對(duì)蛋白酶活性的影響力較差，從而導(dǎo)致滅活效果不顯著，隨著次氯酸鈉濃度增加對(duì)噬菌體滅活效果越好，但具體失活所用的時(shí)間主要取決于噬菌體特性。本團(tuán)隊(duì)前期的研究結(jié)果顯示，當(dāng)次氯酸鈉的濃度為800 mg/kg時(shí)，可在60 min 使噬菌體P1 完全滅活[10]；當(dāng)次氯酸濃度為800 mg/kg 時(shí)，在30 min 使噬菌體P2 完全失活[18]。而在本實(shí)驗(yàn)中，800 mg/kg 次氯酸鈉與0.3%過(guò)氧乙酸直接混合處理10 min 可使噬菌體P1 完全滅活，由此可知該種處理方式可有效提高噬菌體P1 的滅活效果。對(duì)于噬菌體P2，依次使用800 mg/kg 次氯酸鈉和過(guò)氧乙酸處理5 min，雖未使其完全失活，但仍使其效價(jià)下降5.05 個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)。Marcó 和本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果可知，噬菌體的分離源和宿主菌相同，但其對(duì)次氯酸鈉的耐受能力存在差異。

植物乳桿菌烈性噬菌體P1、P2 均分離自L(fǎng).plantarum IMAU10120 的異常發(fā)酵液，兩株噬菌體具有高度同源性，但在尾部纖維蛋白、假定蛋白方面存在差異。Maillard 等認(rèn)為次氯酸鈉可能通過(guò)尾蛋白的聚集導(dǎo)致噬菌體失活，或者可能導(dǎo)致其衣殼的結(jié)構(gòu)改變，可能將核酸釋放到周?chē)慕橘|(zhì)中，從而導(dǎo)致噬菌體失活[19]。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示P1 對(duì)次氯酸鈉的耐受力低于P2，所以我們推測(cè)尾部纖維蛋白是導(dǎo)致耐受差異的主要原因。

4 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，依次使用800 mg/kg 次氯酸鈉和0.3%過(guò)氧乙酸處理植物乳桿菌5 min 后，菌株存活率為0.38%；0.3%過(guò)氧乙酸與800 mg/kg 次氯酸鈉直接混合可使噬菌體P1 在10 min 內(nèi)完全失活；依次使用800 mg/kg 次氯酸鈉和過(guò)氧乙酸處理5 min 后，可噬菌體P2 下降5.05 個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)。說(shuō)明過(guò)氧乙酸可以有效提高次氯酸鈉的滅活效果。