袁 琪，陶惟一，羊亞平，李 霜

(1.南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院,江蘇 南京 211800；2.江蘇亞邦強(qiáng)生藥業(yè)有限公司，江蘇 金壇 213100)

過氧乙酸具有強(qiáng)氧化性，是一種廣譜、高效、環(huán)保型消毒劑，其工作質(zhì)量濃度為1.0～5.0 g/L[1]，但由于其對金屬、織物和石材的強(qiáng)烈腐蝕性，限制了過氧乙酸的使用范疇。

傳統(tǒng)工業(yè)法生產(chǎn)過氧乙酸，是用冰醋酸和高質(zhì)量濃度H2O2(300 g/L)為底物，以硫酸為催化劑，在常溫下反應(yīng)24～48 h可獲得150～200 g/L的過氧乙酸溶液，使用時(shí)將其稀釋至工作濃度[2]。由于15%～20%的過氧乙酸及其底物中的高濃度H2O2均不穩(wěn)定，導(dǎo)致過氧乙酸在運(yùn)輸和儲(chǔ)存過程中易發(fā)生爆炸，安全隱患極大[3]。

近年來，利用生物酶催化乙酸酯的過水解反應(yīng)來制備過氧乙酸得到了學(xué)術(shù)界和產(chǎn)業(yè)界的廣泛關(guān)注[4-8]。酶法制備過氧乙酸的優(yōu)點(diǎn)在于反應(yīng)迅速、溫和，不需要高濃度過H2O2等底物，可以解決運(yùn)輸和儲(chǔ)存等問題。而商業(yè)化酶催化產(chǎn)生過氧乙酸的濃度較低(0.007～0.07%，質(zhì)量分?jǐn)?shù))[9]，達(dá)不到最低消毒濃度(0.1%)。

筆者所在課題組的田倩倩等[10]發(fā)現(xiàn)來源于枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)CICC 20034的乙?；揪厶酋ッ?AXE)具有良好的過水解催化活力，游離酶和固定化酶可催化甘油三乙酸酯和H2O2反應(yīng)，獲得濃度高達(dá)150 mmol/L的過氧乙酸，但是酶的用量較大。酶制劑AXE是酶法制備過氧乙酸的重要成本之一。因此，本文中，筆者重點(diǎn)探討降低酶制劑用量，合成更有成本優(yōu)勢的過氧乙酸，并考察酶法制備過氧乙酸的穩(wěn)定性及金屬腐蝕性，以期為后期開發(fā)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

出發(fā)菌株為大腸桿菌(Escherichiacoli)BL21/pET-CAH[10]。蛋白胨、酵母粉，OXOID公司；NaCl、乳糖、NaHPO4、Na2HPO4、NaOH、甘油三乙酸酯、30%H2O2、戊二醛，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

ZQQZY-75AN型恒溫振蕩培養(yǎng)箱，上海知楚儀器有限公司；3-30K型低溫高速離心機(jī)，Sigma公司；MD190型酶標(biāo)儀，Molecular Devices公司；AH100B型超高壓破碎儀，ATS Engineering 公司；SW-CJ-1CU型生物凈化工作臺，蘇凈安泰AIRTECH公司；GI54DWS型滅菌鍋，ZEALWAY公司；DHG-907385型恒溫鼓風(fēng)干燥箱，新苗公司；GNP-9160型恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；BS 124 S型萬分之一天平，Sartorius公司；DK-8D型恒溫水浴鍋，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 AXE游離酶的制備

1)種子培養(yǎng)。出發(fā)菌株為大腸桿菌(Escherichiacoli)BL21/pET-CAH[11]，LB培養(yǎng)基：酵母粉5 g/L、蛋白胨10 g/L、NaCl 10 g/L；培養(yǎng)條件：250 mL的三角瓶，裝液量為50 mL，培養(yǎng)溫度為37 ℃，搖床轉(zhuǎn)速為200 r/min，培養(yǎng)時(shí)間為12 h。

2)發(fā)酵培養(yǎng)。培養(yǎng)基組成：酵母粉25 g/L、蛋白胨15 g/L、NaCl 10 g/L、甘油0.1%(體積分?jǐn)?shù))、葡萄糖2 g/L、乳糖2 g/L。5L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)：裝液量為3 L，接種量為3.3%(體積分?jǐn)?shù))，發(fā)酵溫度為30 ℃，攪拌速度為200 r/min，通氣量2 vvm，pH 7.0，發(fā)酵時(shí)間為16 h[9]。

3)粗酶液的提取。將發(fā)酵液離心，收集菌泥懸浮于0.1 mol/L的PBS緩沖液(濃縮12倍)，采用高壓細(xì)胞破碎法，壓力加至600 Pa以上，破碎菌液，液體變得透明黏稠即破碎完全。將細(xì)胞破碎液再次離心去掉細(xì)胞碎片雜質(zhì)，上清液即為游離粗酶液，4 ℃保存。

1.2.2 AXE酶活測定

參照酯酶的酶活測定方法[11]，使用對硝基苯酚乙酸酯(p-NPA)為底物，進(jìn)行酶活測定。1個(gè)酶活單位(U)定義：在一定反應(yīng)條件下，每分鐘釋放1.0 μmol/L乙酸對硝基苯酚(p-NP)所需的酶量。重組菌E.coliBL21/pET-CAH發(fā)酵16 h，濃縮破胞后獲得粗酶液的酶活性達(dá)3 480 U/mL。

1.2.3 蛋白含量測定

參照文獻(xiàn)[12]測定粗酶的蛋白含量。測得濃縮酶的蛋白含量為7.92 mg/mL。

1.2.4 游離酶的固定化

參照文獻(xiàn)[9]，先將丙烯氨基樹脂MI-BS1進(jìn)行戊二醛活化，然后將蛋白含量為0.1 g的粗酶液加入50 mL 100 mol/L的Tris-HCl 緩沖溶液(pH 7.4)，與10 g活化后的樹脂混合，在35 ℃下反應(yīng)6 h，將含有固定化酶的樹脂進(jìn)行過濾干燥備用。經(jīng)丙烯氨基樹脂MI-BS1固定化后，固定化酶的酶活為350 U/g樹脂。

1.2.5 AXE酶催化甘油三乙酸酯過水解反應(yīng)制備過氧乙酸

設(shè)置50 mL反應(yīng)體系，以40 mmol/L的磷酸鹽(pH 7.8)為緩沖液，底物H2O2濃度為1.0 mol/L或0.35 mol/L，甘油三乙酸酯濃度分別為0.3 mol/L或0.1 mol/L；先將甘油三乙酸酯和磷酸鹽緩沖液振蕩均勻，再加入H2O2振蕩均勻，最后加入不同量的AXE酶液(游離酶)或固定化酶，室溫振蕩5 min，迅速加入MnO2終止反應(yīng)，離心取上清測過氧乙酸含量[13]。

1.2.6 化學(xué)催化法制備過氧乙酸

購買市售AB液包裝的過氧乙酸產(chǎn)品，其中A液為高濃度冰醋酸和濃硫酸，B液為30%H2O2。使用時(shí)按說明書進(jìn)行1∶ 1體積比混合，25 ℃靜置24～48 h。

1.2.7 過氧乙酸含量的測定

過氧乙酸含量的測定參照文獻(xiàn)[14]進(jìn)行。

1.2.8 酶法/化學(xué)催化法過氧乙酸穩(wěn)定性比較

分別用酶法和化學(xué)法制備過氧乙酸，用無菌水調(diào)整至相同質(zhì)量濃度(10和3.5 g/L)，25 ℃放置一周，每天測過氧乙酸質(zhì)量濃度[3,15]。

1.2.9 酶法/化學(xué)催化法過氧乙酸腐蝕性比較

分別用酶法和化學(xué)法制備過氧乙酸，調(diào)整過氧乙酸質(zhì)量濃度至3.5 g/L，浸泡碳鋼、不銹鋼、鋁和銅金屬片，每天換液并稱4種金屬片的質(zhì)量，連續(xù)一周。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同反應(yīng)體系中過氧乙酸含量的測定

2.1.1 游離酶催化三乙酸甘油酯底物制備過氧乙酸

由于底物H2O2具有強(qiáng)氧化性，能導(dǎo)致酶發(fā)生變性，破壞酶的活性，常用的醫(yī)用雙氧水消毒劑的工作質(zhì)量濃度為30 g/L左右，因此設(shè)定反應(yīng)體系中H2O2最高濃度為1 mol/L(34 g/L)。考慮到甘油三乙酸酯的過水解反應(yīng)需要過量的H2O2，因此，將H2O2和甘油三乙酸酯的摩爾比設(shè)為10∶ 3；此時(shí)，反應(yīng)體系中含有65 g/L(0.3 mol/L)甘油三乙酸酯，考察不同游離酶用量對反應(yīng)的影響，結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知：當(dāng)粗酶的添加量(蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度)為1.0 g/L時(shí)，室溫反應(yīng)5 min即可獲得高達(dá)11.6 g/L(152 mmol/L)的過氧乙酸，底物甘油三乙酸酯的過水解反應(yīng)占比為16.7%；進(jìn)一步增加酶的用量，不能再提高產(chǎn)物過氧乙酸的產(chǎn)量。

圖1 高濃度反應(yīng)體系下AXE用量對過氧乙酸濃度的影響

該反應(yīng)體系中，底物H2O2為34 g/L，相當(dāng)于其作為消毒劑使用的工作濃度，是可接受的安全范圍；底物甘油三乙酸酯可作為日用化學(xué)品定香劑使用，具有微弱果香氣味；反應(yīng)條件溫和，反應(yīng)速度快，僅反應(yīng)5 min即可達(dá)到高于消毒劑使用濃度的過氧乙酸。因此，利用酶法催化過氧乙酸的合成具有安全和快速的特點(diǎn)。

考慮到H2O2對AXE酶的氧化毒性，降低H2O2濃度將有利于酶活性功能的發(fā)揮。將反應(yīng)體系中H2O2降至12 g/L(0.35 mol/L)，底物甘油三乙酸酯降至22 g/L(0.1 mol/L)，減少AXE游離酶的使用量，結(jié)果如圖2所示。

圖2 低濃度反應(yīng)體系下AXE用量對過氧乙酸濃度的影響

由圖2可知：當(dāng)AXE粗酶液的添加量為75 mg/L時(shí)，反應(yīng)5 min產(chǎn)生過氧乙酸質(zhì)量濃度最高達(dá)到3.5 g/L；AXE粗酶液的添加量為45 mg/L時(shí)，反應(yīng)5 min產(chǎn)生的過氧乙酸也可以達(dá)到3.0 g/L左右。這一數(shù)據(jù)表明，在含有低濃度H2O2的反應(yīng)體系中，AXE酶催化甘油三乙酸酯的過水解反應(yīng)占比仍能達(dá)到15.3%。該反應(yīng)體系中的過氧乙酸(3.0～3.5 g/L)已滿足消毒使用的有效劑量，相比高濃度H2O2的反應(yīng)體系，達(dá)到相同工作質(zhì)量濃度(3 g/L)的過氧乙酸所需的用酶量可大幅降低近80%，有效節(jié)約制備成本。

2.1.2 固定化酶催化甘油三乙酸酯底物制備過氧乙酸

考慮到酶在過氧乙酸制備中占據(jù)了較大成本，采用固定化酶催化制備過氧乙酸可進(jìn)一步降低酶的成本。此前，Tao等[9]采用固定化酶用量為1 g/mL時(shí)，可獲得濃度達(dá)142.5 mmol/L的過氧乙酸(11 g/L)，固定化酶重復(fù)使用10批次仍可獲得95.5 mmol/L過氧乙酸(7.3 g/L)。將反應(yīng)體系中H2O2和甘油三乙酸酯的質(zhì)量濃度分別降低到12 g/L(0.35 mol/L)和22 g/L(0.1 mol/L)時(shí)，固定化酶用量分別為50和100 mg/mL，結(jié)果如圖3所示。

圖3 固定化酶反應(yīng)批次

由圖3可知：固定化酶用量為100 mg/mL時(shí)，過氧乙酸可達(dá)到3.9 g/L，固定化酶重復(fù)利用5批次時(shí)，過氧乙酸產(chǎn)量依然可達(dá)2.4 g/L；降低固定化酶使用量到50 mg/mL時(shí)，過氧乙酸可達(dá)到3.6 g/L，固定化酶重復(fù)利用5批次后，過氧乙酸為1.8 g/L。因此，固定化酶用量為50 mg/mL是更為經(jīng)濟(jì)的用量。

2.2 酶法制備與市售過氧乙酸的穩(wěn)定性

將游離酶、固定化酶和化學(xué)反應(yīng)法制備的過氧乙酸溶液質(zhì)量濃度分別設(shè)置為10和3.5 g/L，在室溫條件下靜置一周，每24 h測一次過氧乙酸的含量，結(jié)果如圖4和圖5所示。

由圖4和圖5可知：二元反應(yīng)法制備的過氧乙酸，每天分解約10%～15%；高濃度游離酶制備的過氧乙酸溶液最不穩(wěn)定，10 g/L過氧乙酸室溫放置24 h后濃度降低50%，48 h后過氧乙酸濃度降低75%左右，64 h后過氧乙酸全部分解，可能與溶液中含有高濃度蛋白質(zhì)有關(guān)。過氧乙酸具有強(qiáng)氧化性，使得蛋白質(zhì)被氧化導(dǎo)致變性失活的同時(shí)也導(dǎo)致過氧乙酸自身的不穩(wěn)定。利用游離酶制備過氧乙酸體系中，10 g/L的過氧乙酸反應(yīng)體系中酶的用量遠(yuǎn)大于3.5 g/L的反應(yīng)體系，使得其穩(wěn)定性最差；而固定化酶反應(yīng)體系中，反應(yīng)結(jié)束后固定化酶的樹脂被取出，過氧乙酸溶液中僅殘留少量游離蛋白質(zhì)，產(chǎn)物過氧乙酸的穩(wěn)定性更好。75 mg/L游離酶制備3.5 g/L過氧乙酸，其穩(wěn)定性得到大幅提升，與固定化酶催化制備的過氧乙酸體系的穩(wěn)定性基本一致，表明過氧乙酸溶液中蛋白質(zhì)類有機(jī)物是影響溶液穩(wěn)定的關(guān)鍵因素。

圖4 過氧乙酸(10 g/L)穩(wěn)定性

圖5 過氧乙酸的穩(wěn)定性(3.5 g/L)

2.3 酶法制備和市售過氧乙酸的腐蝕性

將固定化酶制備過氧乙酸和市售過氧乙酸的質(zhì)量濃度均用無菌水調(diào)整至3.5 g/L，測得兩種過氧乙酸溶液的pH分別為4.45和1.98，表明市售過氧乙酸中由于含有濃硫酸催化劑，在同等工作濃度下的pH更低。以銅、不銹鋼、碳鋼和鋁片為檢測材料，浸泡上述4種金屬片，每天換液一次，稱質(zhì)量考察二者對金屬材料的腐蝕性，結(jié)果如圖6所示。

圖6 過氧乙酸溶液浸泡4種金屬片質(zhì)量變化

由圖6可知：市售的化學(xué)法制備過氧乙酸對銅和碳鋼的腐蝕性較強(qiáng)，使銅片5 d內(nèi)質(zhì)量下降30%，達(dá)到重度腐蝕，使碳鋼質(zhì)量下降5%，形成輕度腐蝕；用酶法制備的過氧乙酸對這4種金屬基本無腐蝕作用。

圖7為過氧乙酸金屬浸泡液的結(jié)果。由圖7可以直觀看出，化學(xué)法制備的過氧乙酸對金屬材料的腐蝕程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于酶法制備的過氧乙酸。

圖7 過氧乙酸浸泡四種金屬片

3 結(jié)論

制備同等總量的低濃度過氧乙酸可大幅節(jié)約酶用量且增加了過氧乙酸的穩(wěn)定性。游離酶和固定化酶的用量分別為75 mg/L和50 g/L時(shí)，即可催化22 g/L(0.1 mol/L)甘油三乙酸酯和12 g/L(0.35 mol/L)H2O2發(fā)生過水解反應(yīng)，獲得3.5 g/L的過氧乙酸，酶的用量分別降低了80%和90%；該濃度下的過氧乙酸在25 ℃下每天分解率約為20%，同等條件下化學(xué)法制備的過氧乙酸每天分解約15%。

酶法制備的過氧乙酸消毒溶液對金屬腐蝕性更低。3.5 g/L的酶法制備和市售過氧乙酸，其pH分別為4.45和1.98；該濃度下的市售過氧乙酸溶液對銅達(dá)到重度腐蝕，對碳鋼形成輕度腐蝕；而該濃度下酶法制備的過氧乙酸均無腐蝕性。

以酶法生產(chǎn)過氧乙酸，能夠解決傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝和運(yùn)輸、儲(chǔ)存過程的高危險(xiǎn)性問題，并降低金屬腐蝕性，拓展應(yīng)用領(lǐng)域。但由于該方法目前還不成熟，酶制劑的制備成本及穩(wěn)定性等工藝問題有待進(jìn)一步深入研究。