張美玉 謝彥軍 曹永慧
(山東魯抗舍里樂藥業(yè)有限公司高新區(qū)分公司,山東 濟寧 272000)
硫酸黏菌素又名硫酸黏桿菌素,克里斯?。–olistin Sulfate)、多黏菌素(PolymyxinE)、抗敵素等,它是1950 年由日本的小山抗浮從福島縣土壤中分離到的1 株多黏芽孢桿菌抗敵素變株的培養(yǎng)液中提取的一種鎖環(huán)狀多肽類抗生素,為白色粉末,易溶于水,耐熱,消化道不易吸收,排泄迅速,毒性小,無副作用,不易產生耐藥菌株,是最安全的抗生素之一,幾乎對所有的革蘭氏陰性菌有效,對綠膿桿菌有顯著作用。治療時常與抗革蘭氏陽性菌的桿菌肽鋅合用。其含量測定《中國獸藥典》2020 版規(guī)定為生物效價測定方法,但其方法具有操作步驟復雜、檢驗周期長、影響因素多等缺點,隨著獸藥的發(fā)展和檢驗制度的完善,為了滿足生產的需要,提高檢驗效率及檢驗準確度,該文采用高效液相色譜法檢測原理,建立快速、準確的HPLC 測定獸藥硫酸黏菌素的含量檢測方法。
Agilent 1260 Infinity II,硫酸黏菌素標準品(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所),乙腈(色譜純),無水硫酸鈉(分析純),其余試劑為分析純,硫酸黏菌素原料。10%硫酸黏菌素可溶性粉,10%硫酸黏菌素預混劑均為山東魯抗舍里樂藥業(yè)有限公司高新區(qū)分公司生產(均已用生物效價法測定含量)。
C18 鍵合硅膠色譜柱,檢測波長215nm,流速1.0mL/min,柱溫30℃,進樣量20uL,流動相0.1mol/L 無水硫酸鈉溶液∶乙腈=4 ∶2,用磷酸調酸堿度至pH 為2.4 左右。
溶液的制備 對照品溶液:精密稱定標準品25mg,置50mL 的容量瓶中,加流動相稀釋至相應刻度,搖勻,制成含硫酸黏菌素0.5mg/mL 的對照品溶液。供試品溶液:精密稱定硫酸黏菌素可溶性粉250mg,置50ml 的容量瓶中,加流動相稀釋至相應刻度,搖勻,制成含硫酸黏菌素0.5mg/mL的硫酸黏菌素可溶性粉溶液。
精密稱定硫酸黏菌素預混劑250mg,置50mL 的容量瓶中,加流動相適量超聲助溶5min,冷卻,定容至刻度,制成含硫酸黏菌素0.5mg/mL 的硫酸黏菌素預混劑溶液。
系統(tǒng)適用性溶液:取硫酸黏菌素對照品溶液,精密量取對照品溶液各20μL,分別注入液相色譜儀,記錄色譜圖。
系統(tǒng)適用性要求:系統(tǒng)適用性溶液色譜圖中,相鄰峰間的分離度應大于1.5,各峰的拖尾因子不得大于1.5。
系統(tǒng)適用性結果:相鄰峰間的分離度均大于1.5,各峰的拖尾因子小于1.5,見表1。
表1 系統(tǒng)適用性試驗
通過對流動相、波長、溶劑、進樣量等條件進行選擇,確定最佳試驗條件。
為了考察乙腈對檢測結果的影響,分別選擇流動相為無水硫酸鈉溶液、無水硫酸鈉溶液∶乙腈=40 ∶20、無水硫酸鈉溶液∶乙腈=45 ∶15,無水硫酸鈉溶液均為0.1 mol/L,結果表明,當無水硫酸鈉溶液∶乙腈=40 ∶20 時,色譜圖中各峰的峰形較好,分離度良好;為了考察無水硫酸鈉溶液濃度的影響,固定乙腈的比例,分別比較當磷酸鹽濃度為0.1mol/L 和0.2 mol/L 的檢測結果,發(fā)現0.1mol/L 的無水硫酸鈉溶液時,峰形對稱性好且流動相中含鹽濃度低,對色譜柱壽命影響相對較小,更符合方法學要求。
采用紫外可見光檢測器,對硫酸黏菌素對照品、原料及其制劑溶液在200nm~400nm 波長內進行掃描,評價硫酸黏菌素的紫外吸收行為。測得在215nm 處均有較明顯吸收,故選擇215 nm 為測定波長是合理的。
硫酸黏菌素原料,易溶于水,分別采用水和流動相作為空白溶劑,比較硫酸黏菌素制劑的色譜行為。試驗表明,以水做空白溶劑時,可溶性粉溶解性良好而硫酸黏菌素預混劑溶解性很差,而且出現倒峰,選流動相作為溶劑,不會出現倒峰,對預混劑來說,由于輔料及工藝原因導致溶解性稍差,必須經過5min 超聲處理才能溶解,綜合分析選用流動相作為溶劑。
精密稱取原料、10%硫酸黏菌素可溶性粉、10%硫酸黏菌素預混劑適量進行方法適用性試驗,各樣品含硫酸黏菌素在一個水平,各精密稱定6 份樣品,每份樣品各進2 針,取其峰面積平均值,圖1~圖4 表明對照品、原料、10%硫酸黏菌素可溶性粉、10%硫酸黏菌素預混劑色譜圖中均含有這5 種主要物質,而且這5 種物質在不同時間出峰,分別命名為1~5。硫酸黏菌素原料及制劑中這5 種物質出峰時間和硫酸黏菌素標準品出峰時間保持一致,色譜圖峰形很好。而且拖尾因子均小于1.5,說明所測物質相同,各峰分離度良好,達到完全分離,根據峰面積計算含量結果與《中國獸藥典》2020 版生物等效法測定值一致,見表2 和表3,說明結果穩(wěn)定可靠,影響因素少。
表2 生物效價法測定結果
表3 高效液相色譜法測定結果
圖1 硫酸黏菌素標準品色譜圖
圖2 硫酸黏菌素原料色譜圖
圖3 10%硫酸黏菌素可溶性粉色譜圖
圖4 10%硫酸黏菌素預混劑色譜圖
精密稱取對照品適量,置合適的容量瓶中,用流動相稀釋至刻度,配制成0.5mol/L 的硫酸黏菌素標準品溶液,將其標準品溶液連續(xù)進樣6 針,記錄峰面積值,并計算相對標準偏差。
結果表明相對標準偏差為0.3%,說明精密度良好,數據可靠,儀器狀態(tài)良好。
配制標準濃度為2.0mg/mL 的標準溶液,精密量取1mL、2mL、3mL、5mL、6mL、7mL、8mL、9mL 置10mL 容量瓶中,配制成濃度為0.2mg/mL~1.8mg/mL 的標準溶液。各取20uL 進樣,記錄色譜圖,橫坐標為樣品濃度,縱坐標為樣品峰面積做線性回歸,濃度在0.3mg/mL~1.6mg/mL 和峰面積呈線性相關,線性回歸方程為=2568425.6(=0.9999)。表明樣品檢測濃度為0.5mg/mL 在線性范圍內。
分別取原料、10%硫酸黏菌素可溶性粉、10%硫酸黏菌素預混劑適量和可溶性粉混合配制成樣品濃度為0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL、0.6mg/mL、0.7mg/mL 的溶液,每個濃度做兩次重復并計算平均回收率。結果表明,當樣品濃度在0.5mg/mL 時,回收率高于98.0%,說明試驗結果穩(wěn)定可靠,方法正確,準確度高,見表4。
表4 回收率試驗結果
通過改變柱溫、流速、檢測波長、流動相pH 值、流動相比例等參數,來評估色譜條件有微小變動時,測定結果不受影響的影響程度。
根據表5,改變色譜條件后,取空白溶液、對照品溶液、原料、可溶性粉以及預混劑進行測定。試驗要求當色譜條件有微小變化后,各峰的分離度大于1.5,含量結果RSD 不得超過2.0%。
表5 耐用性試驗表
在流速、柱溫、流動相比例、流動相pH 及不同色譜柱等色譜條件有微小變動時,分離度均符合要求見表6,各條件下,測得硫酸黏菌素的含量的RSD 值均小于2.0%見表7。表明該方法耐用性良好。
表6 對照品溶液的各峰分離度結果
表7 含量測定方法驗證-耐用性試驗結果
取硫酸黏菌素對照品溶液,采用逐步稀釋的方法,信噪比(/=10)的樣品濃度即為定量限濃度,測定6 次,信噪比(/=3)的溶液濃度即為檢測限。結果定量限溶液的濃度為0.012mg/mL,檢測限溶液的濃度為 3.63μg/mL,6 份定量限溶液峰面積的RSD 為2.53%。
在不同時間,2 位分析員分別用不同儀器配制6 份原料供試品溶液和2 份硫酸黏菌素對照品溶液。取配制溶液各20μL 分別進樣分析,結果表明,2 位分析員6 次測定重復性的RSD 分別為:1.53%、1.32%,不同分析員12 次測定中間精密度的RSD 為1.47%,結果重復性及中間精密度良好。
該試驗通過建立高效液相色譜法檢驗硫酸黏菌素的含量,能夠高效測定獸藥硫酸黏菌素及其制劑的含量,方法可靠、穩(wěn)定性好,和生物效價法相比較,縮短了檢驗周期,實現批量檢驗,能夠為獸藥生產質量提供有力的保障。