宋銀都，曾萌冬，周昊天，周云紅，張成碩，趙金良

( 上海海洋大學(xué)，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點試驗室，水產(chǎn)動物遺傳育種中心上海市協(xié)同創(chuàng)新中心，水產(chǎn)科學(xué)國家級試驗教學(xué)示范中心，上海 201306 )

養(yǎng)殖池塘溶解氧主要來源于浮游生物光合作用[1]。由于光合作用的周期循環(huán)，當(dāng)池塘生物體(如細(xì)菌、動物和植物)的耗氧率超過浮游植物光合產(chǎn)氧率時，池塘的溶解氧開始消耗[2]。夜晚池塘溶解氧水平隨時間的推移而逐漸降低，達(dá)到一定溶解氧水平時魚類面臨低氧脅迫[3-4]。在實際的養(yǎng)殖中，水體缺氧是一個動態(tài)的過程。目前低氧對魚類呼吸代謝的研究一般停留在特定溶解氧條件下的耐受性研究，如黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)在溶解氧水平0.7 mg/L下脅迫6.5 h[5]，大口黑鱸(Micropterussalmoides)分別在溶解氧水平3.5 mg/L、1.2 mg/L下脅迫24 h[6]，大黃魚(Larimichthyscrocea)在溶解氧水平1.5 mg/L下脅迫48 h[7]。試驗中呼吸代謝的變化與低氧持續(xù)時間和設(shè)置的低氧水平有關(guān)，靜態(tài)試驗設(shè)計很難反映現(xiàn)實養(yǎng)殖過程中的動態(tài)變化[8]。

鱖(Sinipercachuatsi)是我國重要淡水經(jīng)濟魚類，喜歡在昏暗的環(huán)境下捕食[9-10]，夜間高強度活動，加大了池塘溶解氧的消耗。且鱖夜間耗氧率大于白天[11]，鱖窒息點為0.56～0.75 mg/L[11-13]，與常規(guī)養(yǎng)殖魚類相比窒息點較高，如鯽(Carassiusauratus)為0.1 mg/L[14]，鰱(Hypophthalmichthysmolitrix)為0.51 mg/L，鳙(Aristichthysnobilis)為0.46 mg/L，草魚(Ctenopharyngodonidellus)為0.39 mg/L[12]。因此，在夜間池塘溶解氧變化過程中鱖發(fā)生低氧的可能性會增加。筆者在溶解氧水平持續(xù)下降的過程中測定不同溶解氧含量下鱖呼吸代謝相關(guān)酶[乳酸脫氫酶(LDH)活性、丙酮酸脫氫酶(PDH)]活性變化及相關(guān)基因(LDH-A、PDH-E1α)的表達(dá)量，旨在進一步探討低氧條件下鱖進行有氧呼吸、無氧呼吸的作用機理。

1 材料與方法

1.1 試驗用魚

試驗魚來自安徽省滁州市長江水產(chǎn)良種場。體質(zhì)量(10.2±2.2) g、體長(9.5±1.0) cm。在試驗室內(nèi)水族箱暫養(yǎng)7 d以適應(yīng)環(huán)境，投喂體質(zhì)量(0.40±0.06) g，體長(2.8±0.2) cm的草魚魚苗。每日早晚各投喂1次，投喂量為魚體質(zhì)量的5%。

1.2 試驗設(shè)計及樣品采集

試驗前24 h停止投喂，盡量排空糞便并吸出。試驗在硅膠密閉的塑料箱(55 cm×40 cm×31.5 cm，試驗水體為55 L)中進行，試驗前將塑料箱注水倒置，不滲水則表示密封性好。試驗設(shè)置5個處理組，溶解氧質(zhì)量濃度分別為5、4、3、2、1 mg/L，每組3個平行，每個箱內(nèi)隨機放入10尾魚，共計150尾。試驗用水為充分曝氣的自來水，水溫(25.3±0.2) ℃，溶解氧質(zhì)量濃度為(7.36±0.52) mg/L。本試驗采用靜態(tài)呼吸室法，通過試驗魚呼吸作用逐漸消耗水中氧氣，每隔30 min測量箱中的溶解氧質(zhì)量濃度，試驗持續(xù)時間為12 h，整個試驗過程中鱖行為正常且無死魚；試驗所用儀器為梅特勒托利特公司 S9 Seven2GoTMpro便攜式溶解氧儀(飽和空氣校正)。

當(dāng)5 mg/L處理組箱中溶解氧降至該水平時立即停止試驗，每箱隨機取出3尾共9尾用1%間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽麻醉后，立即解剖，采集心臟、腦、肝臟、肌肉組織，并用液氮迅速冷凍，放入-80 ℃保存。當(dāng)4、3、2、1 mg/L處理組箱中溶解氧水平降至該質(zhì)量濃度時用相同方法采集樣品。

1.3 耗氧率計算

試驗過程中計算每個溶解氧水平的耗氧率[R，mg/(g·h)]。

式中，ρ0、ρ1為試驗前后水體的溶解氧質(zhì)量濃度(mg/L)，V為水體體積(L)，t為試驗持續(xù)時間(h)，m為魚體總質(zhì)量(g)。

1.4 生化指標(biāo)測定

取試驗魚心臟、腦、肝臟和肌肉組織，用預(yù)冷的磷酸緩沖鹽溶液(0.01 mol/L，pH 7.4)沖洗組織，去除殘留黏液，取適量組織按1∶9質(zhì)量比加入磷酸緩沖鹽溶液，各組織冰浴勻漿5 min，4 ℃下2000 r/min(離心半徑8.86 cm)冷凍離心20 min，取離心上清液用于生化測定。丙酮酸脫氫酶、乳酸脫氫酶活性和乳酸含量采用酶標(biāo)儀(Synergy H1，BioTek)測定，試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技公司，按照試劑盒說明書檢測方法操作。

1.5 實時熒光定量PCR

用Trizol法提取各組織總RNA，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，用OD-1000+分光光度計(Onedrop)檢測RNA濃度和純度。測定RNA在260 nm和280 nm的吸光度[D(260 nm)、D(280 nm)]，取D(260 nm)/D(280 nm)為1.9～2.1的樣本，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser，TaKaRa)將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，-20 ℃保存。

根據(jù)本實驗室鱖轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，用Primer Express 5.0 軟件設(shè)計LDH-A、PDH-E1α引物序列，引物由金維智(蘇州)生物科技有限公司合成。

表1 呼吸代謝相關(guān)基因的引物序列

根據(jù)所設(shè)計的引物，以β-actin為內(nèi)參基因進行熒光定量PCR。反應(yīng)體系為20 μL：TB Green Premix Tap Ⅱ 10 μL；正、反引物各0.8 μL；cDNA模板1.6 μL；無菌水6.8 μL。反應(yīng)程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，58 ℃ 30 s，40個循環(huán)；95 ℃ 10 s，65 ℃ 5 s。以β-actin為內(nèi)參，用2-△△Ct計算不同溶解氧水平下各組織mRNA的相對表達(dá)量。

1.6 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)結(jié)果均使用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)分析用SPSS 18.0軟件進行單因素方差分析，用GraphPad Prism 8.01作圖。

2 結(jié) 果

2.1 不同溶解氧水平下呼吸代謝酶活性及基因的表達(dá)水平

2.1.1 呼吸代謝酶活性及乳酸變化

隨著溶解氧水平的降低，鱖心臟、腦、肝臟、肌肉組織中丙酮酸脫氫酶活性呈下降趨勢(圖1)。其中，心臟和腦組織中丙酮酸脫氫酶活性在溶解氧下降期間無顯著變化(P>0.05)，溶解氧質(zhì)量濃度為1 mg/L時，組織中丙酮酸脫氫酶活性相較于5 mg/L時分別下降3.06%、5.82%；溶解氧3 mg/L時，肝臟和肌肉中丙酮酸脫氫酶活性顯著下降(P<0.05)，分別下降12.92%、23.44%，1 mg/L時肝臟和肌肉中丙酮酸脫氫酶活性最低，分別下降21.73%、28.79%(P<0.01)。

圖1 不同溶解氧水平下鱖心臟(a)、腦(b)、肝臟(c)、肌肉(d)呼吸代謝酶活性和乳酸含量的變化

心臟、腦、肝臟、肌肉中乳酸脫氫酶活性隨溶解氧下降而上升，肌肉中乳酸脫氫酶活性在溶解氧質(zhì)量濃度為3 mg/L時上升13.23%(P<0.05)，心臟、腦、肝臟在2 mg/L時分別上升14.43%、20.19%、17.65%(P<0.01)。各組織活性在溶解氧為1 mg/L時最高(P<0.01)。

心臟、腦和肌肉乳酸濃度隨溶解氧下降而逐漸上升，溶解氧質(zhì)量濃度為1 mg/L時，乳酸濃度達(dá)最高值(P<0.05)，而肝臟中乳酸濃度無顯著變化(P>0.05)。

2.1.2 呼吸代謝酶基因的表達(dá)水平

隨著溶解氧水平降低，各組織中的PDH-E1α基因相對表達(dá)量均呈下降趨勢(圖2)，心臟中的相對表達(dá)量無顯著變化(P>0.05)，腦和肌肉中的相對表達(dá)量在溶解氧質(zhì)量濃度為3 mg/L時變化顯著(P<0.001)，肝臟中的PDH-E1α基因相對表達(dá)量在2 mg/L時顯著下降(P<0.05)。腦和肝臟中的PDH-E1α基因相對表達(dá)量在溶解氧2 mg/L時降至最低，肌肉中的相對表達(dá)量在溶解氧1 mg/L時降至最低，分別為5 mg/L組的44.70%、56.58%、62.49%。

各組織中的LDH-A基因相對表達(dá)量呈上升趨勢，溶解氧質(zhì)量濃度為3 mg/L時，心臟、肝臟和肌肉中的LDH-A基因相對表達(dá)量有顯著變化(P<0.01)；溶解氧質(zhì)量濃度為1 mg/L時，心臟、腦、肝臟、肌肉中的LDH-A基因相對表達(dá)量較高，分別為5 mg/L時的12.68、1.33、10.97、8.37倍。

2.2 不同溶解氧水平下鱖耗氧率變化

隨著溶解氧質(zhì)量濃度的下降，鱖耗氧率表現(xiàn)為逐漸下降趨勢(表2)。溶解氧質(zhì)量濃度降至3 mg/L時耗氧率與5 mg/L時相比減少30.95%(P<0.01)；溶解氧繼續(xù)降至1 mg/L時耗氧率減少57.14%(P<0.001)。

表2 不同溶解氧水平下鱖的耗氧率

3 討 論

3.1 不同溶解氧水平對鱖呼吸代謝酶及基因相對表達(dá)量的影響

機體從有氧呼吸到無氧呼吸的轉(zhuǎn)變是魚類低氧耐受的關(guān)鍵適應(yīng)機制[15-16]，通常，丙酮酸進入線粒體，經(jīng)丙酮酸脫氫酶復(fù)合體后才能進行有氧呼吸，其中，丙酮酸脫氫酶是丙酮酸脫氫酶復(fù)合體中的主要成員[17]，是機體有氧呼吸關(guān)鍵酶之一，所以丙酮酸脫氫酶活性的下降標(biāo)志著機體有氧呼吸的減少[18]。乳酸脫氫酶是無氧呼吸的關(guān)鍵酶，其活性變化可以反映無氧呼吸的水平，乳酸為無氧呼吸的產(chǎn)物[19]。

本試驗中，設(shè)置的溶解氧最低質(zhì)量濃度為1 mg/L，接近于鱖窒息點0.66～0.75 mg/L[11-13]。從正常溶解氧質(zhì)量濃度降至1 mg/L過程中，丙酮酸脫氫酶活性逐漸下降，而乳酸脫氫酶活性逐漸上升，呼吸代謝酶基因相對表達(dá)水平與之類似，同時無氧呼吸產(chǎn)物乳酸的濃度也逐漸上升。這些結(jié)果表明，從常氧水平降至低氧水平的過程中，鱖根據(jù)環(huán)境溶解氧水平變化增加無氧呼吸，抑制有氧呼吸，逐漸調(diào)整機體的呼吸代謝水平，呼吸方式由有氧呼吸為主過渡到以無氧呼吸為主。無氧代謝能快速提供能量，降低機體耗氧量，因此，呼吸方式的轉(zhuǎn)變是魚類面對缺氧環(huán)境，特別是急性低氧環(huán)境的適應(yīng)機制。

在溶解氧質(zhì)量濃度為3 mg/L時，肝臟和肌肉中的PDH-E1α和LDH-A基因相對表達(dá)水平有明顯的上升和下降，同時丙酮酸脫氫酶活性較溶解氧質(zhì)量濃度為5 mg/L時分別下降12.92%、23.44%，乳酸脫氫酶活性較5 mg/L時上升13.23%、17.65%。表明此溶解氧階段對鱖呼吸代謝水平影響較大，在此溶解氧水平下，鱖可能已經(jīng)處于低氧脅迫狀態(tài)；肌肉中LDH-A mRNA水平及其酶活性的升高導(dǎo)致乳酸的積累，但肝臟中乳酸濃度一直處于穩(wěn)定水平，這可能與肝臟中糖異生作用有關(guān)[20]。鱖心臟中的PDH-E1α基因表達(dá)相對穩(wěn)定且丙酮酸脫氫酶活性在整個試驗中僅下降了3.06%，而羅非魚(Oreochromis)在低氧暴露4 h后心臟中丙酮酸脫氫酶活性下降30%～35%[21]；同時心臟中的LDH-A基因相對表達(dá)水平和乳酸脫氫酶活性依然升高，表明鱖心臟中丙酮酸脫氫酶活性不受溶解氧水平的影響，有氧呼吸不變的同時又增強了無氧呼吸。在腦中，PDH-E1α基因的相對表達(dá)量顯著下降，但丙酮酸脫氫酶活性僅下降5.82%。LDH-A基因相對表達(dá)量、乳酸脫氫酶活性和乳酸濃度相對穩(wěn)定，這與Yang等[6]的結(jié)果相似，這可能由于腦為機體中樞神經(jīng)器官，氧優(yōu)先供應(yīng)給這些關(guān)鍵的需氧組織，雖然鱖腦中有氧呼吸酶基因相對表達(dá)下降，但丙酮酸脫氫酶仍然有較高活性，維持有氧呼吸以避免無氧呼吸，規(guī)避大量的乳酸積累[22]。

3.2 不同溶解氧水平對鱖耗氧率的影響

溶解氧質(zhì)量濃度在5 mg/L以上，有利于魚的生長和提高飼料利用效率，隨著溶解氧水平的下降，魚呼吸和攝食活動也隨之降低，低氧會對魚的生理或代謝活動產(chǎn)生不利影響[23]。低氧通常指水體溶解氧質(zhì)量濃度低于2 mg/L的現(xiàn)象，但由于耗氧率和窒息點因魚種類而異，因此魚類低氧含量不能定義為統(tǒng)一的數(shù)值。李澤健等[24]指出，當(dāng)水體溶解氧水平高于某個臨界值，水生生物的耗氧率不再隨著溶解氧水平的下降而變化，該數(shù)值就可以作為判斷該生物是否受到低氧脅迫的指標(biāo)。中華絨鰲蟹(Eriocheirsinensis)[25]在20～35 ℃時的溶解氧臨界值為1.92～3.47 mg/L，瓦氏黃顙魚(Peltebagrusvachelli)[26]的為1.16 mg/L。也有其他學(xué)者將魚類低氧水平定義為魚類的行為或者生理變化受到顯著影響時的溶解氧水平[27]。耗氧率既可反映生物的生理狀態(tài)，又能體現(xiàn)生物體生理活動受環(huán)境條件的影響[28]。耗氧率的減少表明生物體已受到環(huán)境的影響[29-30]。本試驗中每個階段的耗氧率隨溶解氧質(zhì)量濃度的下降而降低，試驗結(jié)果與呼吸代謝酶的結(jié)果相符，表明有氧呼吸酶與無氧呼吸酶的變化影響機體的耗氧率，水中溶解氧質(zhì)量濃度下降時，鱖改變呼吸代謝類型減少耗氧率從而降低機體的需氧量。當(dāng)溶解氧質(zhì)量濃度降至3 mg/L時，鱖耗氧率顯著降低，說明這一階段鱖受溶解氧水平影響較大。

4 結(jié) 論

當(dāng)水體溶解氧逐漸下降，鱖根據(jù)溶解氧質(zhì)量濃度的變化抑制有氧呼吸酶，增加無氧呼吸酶，以調(diào)整機體呼吸方式來降低耗氧率。溶解氧質(zhì)量濃度降至3 mg/L時，鱖呼吸代謝酶及相關(guān)基因的相對表達(dá)量有顯著變化，對鱖呼吸代謝影響較大，表明此溶解氧質(zhì)量濃度下鱖可能已受低氧脅迫。