張 凱，張明明，謝 曦，王 蓉，胡文婷

( 1.海南大學(xué) 藥學(xué)院，熱帶生物資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?570228； 2.康芝藥業(yè)股份有限公司，海南 海口 570311 )

溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)數(shù)量居海水類弧菌之首，是海洋環(huán)境中和海洋動(dòng)物體內(nèi)的正常菌群[1]。然而，溶藻弧菌作為條件致病菌可引起海水養(yǎng)殖魚類、蝦蟹類和貝類暴發(fā)性疾病，給海水養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2-4]。對(duì)海水養(yǎng)殖動(dòng)物流行病調(diào)查結(jié)果表明，溶藻弧菌是凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvanname)、點(diǎn)帶石斑魚(Epinepheluscoioides)、鮭點(diǎn)石斑魚(E.fario)、雜色鮑(Haliotisdiversicolor)等養(yǎng)殖品種的主要致病菌之一[5-9]。

恩諾沙星是國(guó)家批準(zhǔn)使用的一種喹諾酮類漁用藥物，由于其殺菌譜廣、可以人工合成、抗菌力強(qiáng)、價(jià)格低廉，成為水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物弧菌感染癥防治常用藥物之一[10]。細(xì)菌產(chǎn)生喹諾酮耐藥多發(fā)生在藥物使用過(guò)程中，藥物誘導(dǎo)是形成耐藥的重要原因之一。調(diào)查顯示，水產(chǎn)養(yǎng)殖中喹諾酮類藥物的過(guò)量使用甚至濫用導(dǎo)致多省區(qū)水域交叉耐藥弧菌的種類和數(shù)量增加[11-14]。漁用藥物恩諾沙星在海水養(yǎng)殖動(dòng)物中的不規(guī)范使用加大了水產(chǎn)動(dòng)物疫病的防控難度，嚴(yán)重影響?zhàn)B殖產(chǎn)品質(zhì)量和養(yǎng)殖區(qū)生態(tài)環(huán)境。深入探究恩諾沙星使用中引起溶藻弧菌耐藥性的問(wèn)題，對(duì)預(yù)防耐藥菌的產(chǎn)生和合理有效使用抗生素具有重要意義。筆者以海水養(yǎng)殖源的致病性溶藻弧菌為研究對(duì)象，對(duì)恩諾沙星敏感野生株進(jìn)行短期體外誘導(dǎo)，研究其耐藥性和交叉耐藥性的形成，為弧菌病防控及抗菌藥物合理使用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株

30株溶藻弧菌從海南省水產(chǎn)養(yǎng)殖基地患病水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)、池塘水和底泥中分離獲得。藥敏試驗(yàn)質(zhì)控菌株大腸桿菌(Escherichiacoli)ATCC25922 購(gòu)自蘇州達(dá)麥迪生物醫(yī)學(xué)科技有限公司。

1.2 主要試劑

恩諾沙星(純度≥98%)、諾氟沙星(純度≥98%)、環(huán)丙沙星(純度≥98%)、氟苯尼考(純度≥98.5%)購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所?；前粪奏?純度≥99%)、硫酸新霉素(純度≥98%)、四環(huán)素(純度≥98%)購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司。

胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(TSA)、胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)購(gòu)自O(shè)xoid公司，MH肉湯、MH瓊脂培養(yǎng)基購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 藥物敏感性檢測(cè)

將溶藻弧菌接種于TSA瓊脂平板，于28 ℃培養(yǎng) 12 h 后挑選單菌落接種于50 mL的TSB培養(yǎng)基，于28 ℃以120 r/min 轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)24 h。將菌液稀釋成0.5麥?zhǔn)媳葷岬木鷳乙?，用MH培養(yǎng)液對(duì)菌懸液稀釋100倍，采用微量肉湯稀釋法測(cè)定藥物最低抑菌質(zhì)量濃度，以大腸桿菌ATCC 25922作為質(zhì)控菌株。

藥敏試驗(yàn)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)參考美國(guó)臨床與實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，每個(gè)菌株3個(gè)平行。恩諾沙星敏感、中介和耐藥判定折點(diǎn)分別為≤4 μg/mL、8 μg/mL和≥16 μg/mL。

1.3.2 體外誘導(dǎo)和遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)

依次采用1/4最小抑菌質(zhì)量濃度、1/2最小抑菌質(zhì)量濃度、最小抑菌質(zhì)量濃度等逐步兩倍提高藥物劑量，當(dāng)細(xì)菌生長(zhǎng)抑制時(shí)可用同一質(zhì)量濃度或降低其質(zhì)量濃度再次進(jìn)行培養(yǎng)。同時(shí)將受試菌株在不含藥液的培養(yǎng)基中同步傳代培養(yǎng)作為對(duì)照，每隔5代測(cè)定誘導(dǎo)菌株的最小抑菌質(zhì)量濃度，調(diào)整誘導(dǎo)藥物質(zhì)量濃度，連續(xù)誘導(dǎo)30代，并將每代菌株-80 ℃低溫保藏。

將恩諾沙星誘導(dǎo)產(chǎn)生的各耐藥菌株在無(wú)抗菌藥物的培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)20次，測(cè)定菌株的最小抑菌質(zhì)量濃度。

1.3.3 交叉耐藥性

測(cè)定誘導(dǎo)得到的各耐藥菌株對(duì)非誘導(dǎo)藥物的最小抑菌質(zhì)量濃度，并比較誘導(dǎo)前后的最小抑菌質(zhì)量濃度變化。交叉耐藥的判定標(biāo)準(zhǔn)為藥物誘導(dǎo)后菌株對(duì)非誘導(dǎo)藥物的最小抑菌質(zhì)量濃度比誘導(dǎo)前升高逾4倍。以交叉耐藥比率表示某一溶藻弧菌菌株對(duì)全部所測(cè)試抗生素的耐藥情況，以耐藥比率表示全部溶藻弧菌菌株對(duì)某種抗生素的耐藥情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 溶藻弧菌恩諾沙星敏感株的篩選

利用肉湯倍數(shù)稀釋法，測(cè)定自海南省水產(chǎn)養(yǎng)殖基地分離的30株溶藻弧菌對(duì)恩諾沙星的最小抑菌質(zhì)量濃度，結(jié)果見(jiàn)表 1 。參照美國(guó)臨床與實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，篩選出對(duì)恩諾沙星敏感菌株24株，中介菌株3株，耐藥菌株3株。將敏感菌株依次命名為HNVA01、HNVA02、HNVA03……HNVA24。

表1 溶藻弧菌敏感菌株經(jīng)恩諾沙星誘導(dǎo)傳代的最小抑菌質(zhì)量濃度

2.2 溶藻弧菌耐藥株的誘導(dǎo)和遺傳穩(wěn)定性

采用亞抑菌質(zhì)量濃度藥物誘導(dǎo)24株溶藻弧菌恩諾沙星敏感菌株，供試菌株在藥物中連續(xù)傳代培養(yǎng)30次，隨傳代次數(shù)增加耐藥性逐步增加，結(jié)果見(jiàn)表2。傳代5次時(shí)，多數(shù)菌株耐藥性出現(xiàn)增加；傳代至10次時(shí)，所有菌株耐藥性均表現(xiàn)為明顯增強(qiáng)；傳代15至20次時(shí)，多數(shù)菌株的耐藥性大幅度增加；傳代至20次后，耐藥性增長(zhǎng)速率減慢。最終所有敏感株經(jīng)誘導(dǎo)均獲得了耐藥性，共得到24株耐藥株，最低抑菌質(zhì)量濃度是誘導(dǎo)前的64～1024倍，將誘導(dǎo)獲得的耐藥株依次命名為HNVA01R、HNVA02R、HNVA03R……HNVA24R。所有對(duì)照組在未加藥物的培養(yǎng)基中經(jīng)過(guò)30代培養(yǎng)后最小抑菌質(zhì)量濃度未發(fā)生變化，未產(chǎn)生耐藥。

誘導(dǎo)耐藥株在無(wú)藥物的TSA 固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)20代后，其中21株對(duì)恩諾沙星的最小抑菌質(zhì)量濃度值無(wú)明顯改變，僅有HNVA11、HNVA15、HNVA17 3株菌的耐藥性降低為誘導(dǎo)后的1/2，表明誘導(dǎo)菌株具有較好的遺傳穩(wěn)定性。

2.3 交叉耐藥

誘導(dǎo)產(chǎn)生的耐藥株對(duì)非誘導(dǎo)藥物的最小抑菌質(zhì)量濃度變化見(jiàn)表 2，對(duì)各藥物的耐藥比見(jiàn)圖1。菌株耐藥后對(duì)同為喹諾酮類藥物的環(huán)丙沙星和諾氟沙星耐藥性提高較大。各誘導(dǎo)株對(duì)諾氟沙星和環(huán)丙沙星均出現(xiàn)了交叉耐藥現(xiàn)象，耐藥性至少為原來(lái)的32倍，交叉耐藥率達(dá)到100%。非喹諾酮類的藥物中，大多數(shù)菌株對(duì)四環(huán)素耐藥性提高較大，耐藥性為原來(lái)的4～16倍，耐藥比為66.67%；對(duì)氟苯尼考和磺胺嘧啶耐藥性提高幅度較小，部分菌株耐藥性為原來(lái)的2～4倍，表現(xiàn)出一定的耐藥性增強(qiáng)，耐藥比分別為12.50%和16.67%；對(duì)硫酸新霉素的耐藥性影響不明顯，個(gè)別菌株出現(xiàn)耐藥性下降。恩諾沙星誘導(dǎo)耐藥株的交叉耐藥現(xiàn)象明顯，各菌株對(duì)6種非誘導(dǎo)藥物的交叉耐藥比見(jiàn)圖2，14株溶藻弧菌誘導(dǎo)耐藥株的交叉耐藥比逾50%，其中菌株HNVA21的交叉耐藥比最高，達(dá)83.3%。

表2 菌株誘導(dǎo)前/后對(duì)幾種非誘導(dǎo)藥物的最小抑菌質(zhì)量濃度

圖1 誘導(dǎo)產(chǎn)生的耐藥株對(duì)非誘導(dǎo)藥物的耐藥比

圖2 誘導(dǎo)獲得的各耐藥株對(duì)非誘導(dǎo)藥物的交叉耐藥比

3 討 論

3.1 恩諾沙星體外誘導(dǎo)溶藻弧菌耐藥

耐藥是微生物對(duì)環(huán)境脅迫產(chǎn)生的適應(yīng)性機(jī)制，臨床發(fā)現(xiàn)的耐藥菌可能是藥物在體內(nèi)不斷作用于細(xì)菌而誘導(dǎo)產(chǎn)生的[15]。研究表明，肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)、大腸桿菌、嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)、鮑曼不動(dòng)桿菌(Acinetobacterbaumannii)等多種細(xì)菌在喹諾酮藥物的誘導(dǎo)下耐藥水平均得到快速提升，美國(guó)臨床與實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)文件規(guī)定葡萄球菌屬(Staphylococcus)使用喹諾酮類藥物治療3～4 d后需要分離細(xì)菌重新進(jìn)行藥敏試驗(yàn)[16-19]。恩諾沙星是常用的喹諾酮類漁藥，致病性弧菌對(duì)喹諾酮類藥物易產(chǎn)生適應(yīng)性耐藥，導(dǎo)致水產(chǎn)動(dòng)物弧菌病治療失敗。筆者通過(guò)梯度質(zhì)量濃度的恩諾沙星以體外連續(xù)誘導(dǎo)方式獲得的耐藥株均表現(xiàn)為隨誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)耐藥程度逐漸提高。周維[20]對(duì)哈維氏弧菌(V.harveyi)的喹諾酮類藥物體外誘導(dǎo)研究表明，在獲得高度耐藥性的過(guò)程中，首先表現(xiàn)為喹諾酮耐藥決定區(qū)靶基因gyrA 和 parC 逐漸產(chǎn)生突變。本試驗(yàn)中，溶藻弧菌在被恩諾沙星誘導(dǎo)的初期耐藥提升較快，隨后逐漸減緩。獲得的誘導(dǎo)耐藥株在無(wú)藥物的培養(yǎng)基中進(jìn)行多次傳代培養(yǎng)，耐藥性無(wú)明顯的下降趨勢(shì)，表明環(huán)境中藥物誘導(dǎo)產(chǎn)生的耐藥性在一定時(shí)間內(nèi)具有遺傳穩(wěn)定性。因此，推測(cè)耐藥決定區(qū)的基因突變是溶藻弧菌早期耐藥性迅速增強(qiáng)的主要原因，突變的基因位點(diǎn)和形成的順序仍需進(jìn)一步研究。

3.2 恩諾沙星誘導(dǎo)溶藻弧菌交叉耐藥

由于藥物主體結(jié)構(gòu)相似，長(zhǎng)期使用任何一種喹諾酮類藥物可引起細(xì)菌對(duì)其他藥物的敏感性降低，誘發(fā)交叉耐藥和多重耐藥[21-22]。溶藻弧菌誘導(dǎo)耐藥株對(duì)諾氟沙星和環(huán)丙沙星呈現(xiàn)嚴(yán)重的交叉耐藥現(xiàn)象，說(shuō)明可在長(zhǎng)期持續(xù)接觸低劑量同類藥物時(shí)產(chǎn)生高度耐藥株，甚至多重耐藥菌株?；【?jīng)誘導(dǎo)對(duì)喹諾酮類藥物的耐藥機(jī)制非常復(fù)雜，除了經(jīng)典的喹諾酮耐藥決定區(qū)突變外，還包括膜通透性降低、主動(dòng)外排系統(tǒng)、雙組分系統(tǒng)與鞭毛組裝等調(diào)節(jié)機(jī)制，耐藥性的形成往往是同時(shí)兩種或兩種以上方式綜合作用的結(jié)果[20,23-24]。這與本試驗(yàn)中誘導(dǎo)的耐藥株對(duì)喹諾酮類藥物諾氟沙星和環(huán)丙沙星顯著增強(qiáng)結(jié)果相一致，也與菌株間交叉耐藥性的改變差異較大現(xiàn)象相吻合。

由于外排泵和膜蛋白的選擇性不強(qiáng)，適應(yīng)性耐藥的產(chǎn)生往往不僅使細(xì)菌對(duì)同類藥物產(chǎn)生耐藥和交叉耐藥性，對(duì)其他類藥物的耐藥性也經(jīng)常出現(xiàn)增強(qiáng)的現(xiàn)象[25]。誘導(dǎo)后的溶藻弧菌耐藥株對(duì)四環(huán)素的交叉耐藥性與對(duì)恩諾沙星的耐藥性之間呈現(xiàn)出相關(guān)性，提示耐藥株對(duì)這兩類抗生素可能存在著相似的耐藥途徑。誘導(dǎo)產(chǎn)生的溶藻弧菌耐藥株對(duì)磺胺嘧啶和氟苯尼考耐藥性表現(xiàn)出一定程度的增強(qiáng)。細(xì)菌對(duì)磺胺類和喹諾酮類的耐藥質(zhì)粒可被多種抗生素所誘導(dǎo), 這可能是造成耐藥株交叉耐藥現(xiàn)象產(chǎn)生的原因之一[26]。氟苯尼考的交叉耐藥結(jié)果與馮世文等[27]對(duì)豬源大腸桿菌的誘導(dǎo)結(jié)果一致，可能與質(zhì)粒介導(dǎo)和細(xì)胞膜表面蛋白的改變有關(guān)。在本試驗(yàn)中，溶藻弧菌的誘導(dǎo)耐藥株對(duì)硫酸新霉素未出現(xiàn)交叉耐藥現(xiàn)象，表明對(duì)這兩類藥物存在不同的耐藥方式。

3.3 體外誘導(dǎo)耐藥分析的意義

溶藻弧菌是海水環(huán)境中常見(jiàn)菌，是海水養(yǎng)殖動(dòng)物弧菌病中危害最大的病原菌之一，常給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2,28]。恩諾沙星在海水動(dòng)物養(yǎng)殖中的大量不規(guī)范使用可造成水環(huán)境污染，導(dǎo)致溶藻弧菌產(chǎn)生適應(yīng)性耐藥，耐藥溶藻弧菌感染的問(wèn)題將愈加突出[29]。溶藻弧菌是人畜共患病的病原菌，對(duì)弧菌造成的人類嚴(yán)重創(chuàng)面感染，喹諾酮類藥物是僅有的幾種可用藥物之一[30]。環(huán)境和水產(chǎn)品中的耐藥溶藻弧菌可以感染人體或通過(guò)水平傳播將耐藥基因轉(zhuǎn)移至人體病原菌，會(huì)給臨床抗感染治療帶來(lái)巨大的困難[31]。通過(guò)藥物體外誘導(dǎo)構(gòu)建耐藥菌株模型是預(yù)測(cè)臨床上細(xì)菌對(duì)藥物耐藥性產(chǎn)生、發(fā)展和研究耐藥機(jī)制的一種常用手段[32]。筆者采用人工體外誘導(dǎo)耐藥的方法，實(shí)現(xiàn)溶藻弧菌菌株由敏感向耐藥的轉(zhuǎn)變，從而成功獲得了體外誘導(dǎo)耐藥菌株，為探討耐藥機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。后期仍需結(jié)合分子生物學(xué)和組學(xué)技術(shù)等方法繼續(xù)進(jìn)一步研究其產(chǎn)生過(guò)程，以期能夠采取有效措施干預(yù)耐藥的發(fā)生與傳播，尋求安全高效的耐藥弧菌感染控制方法。

4 結(jié) 論

長(zhǎng)時(shí)間低于抑菌劑量的恩諾沙星刺激可誘導(dǎo)溶藻弧菌產(chǎn)生對(duì)該抗生素的耐藥性，并對(duì)一些非誘導(dǎo)藥物產(chǎn)生交叉耐藥性，體外獲得性耐藥具有較好的穩(wěn)定性?；谏鲜鲅芯拷Y(jié)果，建議在養(yǎng)殖過(guò)程中發(fā)生弧菌病害時(shí)，用藥應(yīng)盡量避免恩諾沙星長(zhǎng)療程、低劑量的使用。若恩諾沙星治療溶藻弧菌感染無(wú)效，不應(yīng)再使用另一種同類抗生素。在使用四環(huán)素、磺胺嘧啶和氟苯尼考時(shí)，應(yīng)及時(shí)關(guān)注細(xì)菌的耐藥變化，合理選擇和使用抗菌藥物避免產(chǎn)生耐藥而造成治療失敗。