張海燕，吳紅芳，王靜，張冬云

1南陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校第一附屬醫(yī)院病理科，河南 南陽(yáng) 473000 2南陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校病理教研室，河南 南陽(yáng) 473000

在惡性腫瘤相關(guān)死亡中，胰腺癌死亡的占比日益提高，患者的5年生存率很低，且在過(guò)去幾十年中改善有限，胰腺癌高病死率歸因于早期診斷困難、缺乏對(duì)可疑胰腺腫塊進(jìn)行評(píng)估的標(biāo)準(zhǔn)和胰腺癌生物學(xué)標(biāo)志物[1]。近年來(lái)，隨著分子醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展，探討胰腺癌發(fā)生、進(jìn)展、侵襲相關(guān)的靶點(diǎn)和調(diào)控通路可能有助于為腫瘤治療開(kāi)辟新的道路。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，星形膠質(zhì)細(xì)胞上調(diào)基因-1（astrocyte elevated gene-1，AEG-1）、性別決定區(qū)Y框蛋白2（sex determining region Y-box 2，SOX2）在多種惡性腫瘤中具有重要作用[2-4]。但相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子對(duì)胰腺癌進(jìn)展、侵襲的影響仍需進(jìn)一步研究。同時(shí)，腫瘤細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)依賴于新生血管生成[5]。研究發(fā)現(xiàn)，胰腺癌組織中微血管密度（microvessel density，MVD）明顯高于癌旁組織，且MVD與胰腺癌的病理類(lèi)型、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、腫瘤分化程度密切相關(guān)[6]。本研究探討胰腺癌組織中AEG-1和SOX2的表達(dá)情況及與患者臨床特征和MVD的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2018年1月至2020年12月經(jīng)手術(shù)治療的胰腺癌患者的病歷資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合原發(fā)性胰腺癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]，經(jīng)病理檢查確診為原發(fā)性胰腺癌；②接受手術(shù)治療；③術(shù)前未接受過(guò)放化療等抗腫瘤治療；④年齡＞18歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他惡性腫瘤；②既往有胰腺手術(shù)史；③使用過(guò)抗血管生成藥物。依據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，本研究共納入80例患者。其中，男59例，女21例；年齡44～70歲，平均（58.36±9.21）歲；導(dǎo)管腺癌57例，腺泡細(xì)胞癌10例，腺鱗癌5例，膠樣癌3例，黏液性囊腺癌2例，印戒細(xì)胞癌2例，未分化癌1例；腫瘤部位：胰頭39例，胰體17例，胰尾24例。收集患者的胰腺癌組織80例和癌旁組織80例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過(guò)，所有患者均知情并簽署知情同意書(shū)。

1.2 免疫組織化學(xué)染色方法

采用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)胰腺癌組織和癌旁組織中AEG-1、SOX2的表達(dá)情況和MVD。制作石蠟組織切片，二甲苯脫蠟4次，依次采用95%、90%、85%、70%梯度乙醇水化，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）沖洗；3%過(guò)氧化氫室溫孵育20 min，消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性；采用0.125%胰蛋白酶抗原修復(fù)液微波下進(jìn)行抗原修復(fù)，PBS沖洗；滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗（兔抗人AEG-1抗體/兔抗人SOX2抗體），對(duì)照組以PBS代替一抗，37℃孵育60 min，4℃孵育過(guò)夜，室溫放置30 min，PBS沖洗；加入二抗，室溫放置30 min，PBS沖洗后，滴加即配顯色劑顯色，顯色時(shí)間為5～10 min，出現(xiàn)背景色時(shí)終止顯色，自來(lái)水充分沖洗；蘇木素復(fù)染8 s，自來(lái)水沖洗，鹽酸乙醇分化2 s，氨水返藍(lán)1 s，脫水透明，中性樹(shù)膠封片。采用血管內(nèi)皮標(biāo)志物CD34進(jìn)行染色，應(yīng)用Weidner法計(jì)數(shù)，將棕黃色的內(nèi)皮細(xì)胞（簇）視為單個(gè)計(jì)數(shù)血管。

1.3 結(jié)果判定

AEG-1蛋白位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，陽(yáng)性顆粒呈棕黃色；SOX2蛋白位于細(xì)胞核內(nèi)，陽(yáng)性顆粒呈棕黃色。在200倍光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)觀察5個(gè)視野。根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞比例評(píng)分：陽(yáng)性細(xì)胞比例＜5%為0分，5%≤陽(yáng)性細(xì)胞比例＜25%為1分，25%≤陽(yáng)性細(xì)胞比例＜50%為2分，50%≤陽(yáng)性細(xì)胞比例＜75%為3分，陽(yáng)性細(xì)胞比例≥75%為4分。根據(jù)染色強(qiáng)度評(píng)分：無(wú)色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕色為3分?？偡?陽(yáng)性細(xì)胞比例評(píng)分+染色強(qiáng)度評(píng)分，總分＜2分為陰性（-），2～3分為弱陽(yáng)性（+），4～5分為陽(yáng)性（++）、6～7分為強(qiáng)陽(yáng)性（+++），陽(yáng)性和強(qiáng)陽(yáng)性為高表達(dá)[8-9]。在100倍光學(xué)顯微鏡下尋找5個(gè)血管密度最高的區(qū)域，在400倍光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)血管密度，取平均值即為MVD。

1.4 觀察指標(biāo)

比較胰腺癌組織和癌旁組織中AEG-1、SOX2的表達(dá)情況，分析胰腺癌組織中AEG-1、SOX2表達(dá)與胰腺癌患者臨床特征和MVD的關(guān)系。分析胰腺癌組織中AEG-1、SOX2高表達(dá)的影響因素。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，等級(jí)資料的比較采用秩和檢驗(yàn)；兩個(gè)變量的相關(guān)性采用Spearman相關(guān)性分析；采用二元Logistic回歸分析法進(jìn)行多因素分析；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胰腺癌組織和癌旁組織中AEG-1、SOX2表達(dá)情況的比較

胰腺癌組織和癌旁組織中AEG-1、SOX2表達(dá)情況比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=4.171、7.218，P＜0.01）。（表1、2）

表1 胰腺癌組織和癌旁組織中AEG-1表達(dá)情況[n（%）]

表2 胰腺癌組織和癌旁組織中SOX2表達(dá)情況[n（%）]

2.2 不同臨床特征胰腺癌患者胰腺癌組織中AEG-1、SOX2高表達(dá)率的比較

不同年齡、腫瘤直徑、腫瘤部位、TNM分期胰腺癌患者胰腺癌組織中AEG-1、SOX2高表達(dá)率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移胰腺癌患者胰腺癌組織中AEG-1高表達(dá)率分別高于中高分化、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.389、5.056，P＜0.05）；低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移胰腺癌患者胰腺癌組織中SOX2高表達(dá)率分別高于中高分化、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7.020、4.297，P＜0.05）。（表 3）

表3 不同臨床特征胰腺癌患者胰腺癌組織中AEG-1、SOX2高表達(dá)情況

2.3 胰腺癌組織中AEG-1、SOX2高表達(dá)影響因素的多因素分析

Logistic回歸分析結(jié)果顯示，低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均是SOX2高表達(dá)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（OR=1.347，95%CI：1.073～1.691，P=0.011；OR=2.202，95%CI：1.754～2.763，P=0.000）；低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均不是AEG-1高表達(dá)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（OR=1.958，95%CI：0.790～4.852，P=0.147；OR=2.989，95%CI：0.599～14.913，P=0.182）。

2.4 不同AEG-1、SOX2表達(dá)情況胰腺癌組織中MVD的比較

AEG-1、SOX2高表達(dá)胰腺癌組織中MVD均明顯高于AEG-1、SOX2低表達(dá)的胰腺癌組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。（表4）

表4 不同AEG-1、SOX2表達(dá)情況胰腺癌組織中MVD的比較

2.5 AEG-1、SOX2表達(dá)與MVD的相關(guān)性分析

Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示，AEG-1、SOX2表達(dá)均與MVD呈正相關(guān)（r=0.513、0.486，P＜0.01）。

3 討論

AEG-1是一種能夠強(qiáng)烈促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展的腫瘤蛋白，然而AEG-1促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展的具體機(jī)制仍不確定。研究顯示，AEG-1能夠通過(guò)與C-Jun氨基末端激酶和乙酰轉(zhuǎn)移酶P300復(fù)合物相互作用，促進(jìn)C-Jun乙?；腿旧|(zhì)重塑，從而促進(jìn)血管生成和膠質(zhì)瘤細(xì)胞存活[10]。Ding等[11]研究顯示，AEG-1在非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，且與腫瘤新生血管生成密切相關(guān)。因此，AEG-1可能具有介導(dǎo)腫瘤新生血管生成的作用。SOX2是位于染色體3q26.3-q27的胚胎轉(zhuǎn)錄因子，它在維持多能干細(xì)胞的分化和自我更新中具有重要作用，且與多種惡性腫瘤相關(guān)[12]。研究顯示，SOX2過(guò)表達(dá)會(huì)顯著上調(diào)細(xì)胞周期蛋白D1水平，維持肺鱗狀細(xì)胞癌的生長(zhǎng)[13]。腫瘤生長(zhǎng)和侵襲均與腫瘤新生血管生成關(guān)系密切，因此本研究采用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)胰腺癌組織中AEG-1、SOX2的表達(dá)情況，并通過(guò)血管內(nèi)皮標(biāo)志物CD34探討AEG-1、SOX2與血管生成的關(guān)系。

本研究結(jié)果顯示，胰腺癌組織和癌旁組織中AEG-1、SOX2表達(dá)情況比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移胰腺癌患者胰腺癌組織中AEG-1、SOX2高表達(dá)率分別高于中高分化、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均是SOX2高表達(dá)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05），表明AEG-1、SOX在胰腺癌發(fā)展和侵襲中均具有重要意義。本研究中，低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均不是AEG-1高表達(dá)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，推測(cè)其原因是本研究納入的樣本量有限，胰腺癌組織中AEG-1低表達(dá)者例數(shù)較少，造成研究結(jié)果偏倚。腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤重要的生物學(xué)特征，低分化腫瘤細(xì)胞的惡性程度高、增殖能力強(qiáng)，其侵襲和轉(zhuǎn)移能力更強(qiáng)[14]。體外實(shí)驗(yàn)顯示，AEG-1表達(dá)水平與基質(zhì)金屬蛋白酶2和基質(zhì)金屬蛋白酶9表達(dá)水平相關(guān)，下調(diào)AEG-1的表達(dá)可明顯抑制胰腺癌細(xì)胞系A(chǔ)sPC-1細(xì)胞的侵襲和體外成瘤能力[15]。因此，在胰腺癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，AEG-1高表達(dá)患者的基質(zhì)金屬蛋白酶水平上升，胰腺癌細(xì)胞更具有侵襲性，更易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。黃仕靈等[16]研究顯示，AEG-1能夠通過(guò)上調(diào)細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白的表達(dá)，導(dǎo)致腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)升高。而SOX2作為一種轉(zhuǎn)錄因子能夠協(xié)同誘導(dǎo)成纖維干細(xì)胞向多能干細(xì)胞轉(zhuǎn)化，從而調(diào)控腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，參與胰腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程[17]。還有研究發(fā)現(xiàn)，SOX2通過(guò)誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶和磷脂酰肌醇-3-羥激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）/蛋白激酶 B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）/雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of rapamycin kinase，MTOR）信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移[18]。SOX2能夠結(jié)合snail家族轉(zhuǎn)錄抑制因 子 1（snail family transcriptional repressor 1，SNAIL）的啟動(dòng)子區(qū)域，促進(jìn)腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)，并顯著抑制上皮鈣黏素的表達(dá)，從而促進(jìn)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移[19]。劉揚(yáng)帆等[20]研究顯示，下調(diào)微小RNA（microRNA，miRNA）-135a的表達(dá)能夠抑制SOX2的表達(dá)，從而抑制人喉癌上皮細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為，使其增殖活性、細(xì)胞集落數(shù)、遷移與侵襲能力均顯著降低。因此，AEG-1與SOX2可能是胰腺癌侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中多條信號(hào)通路的靶蛋白，抑制AEG-1與SOX2的表達(dá)有助于使胰腺癌患者獲益。

本研究結(jié)果還顯示，AEG-1高表達(dá)的胰腺癌組織中MVD更高，AEG-1能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞微血管生成，為腫瘤細(xì)胞的增殖、成瘤提供條件，其具體機(jī)制可能與AEG-1激活核因子κB（nuclear factorκB，NF-κB）信號(hào)通路有關(guān)，NF-κB是Toll樣受體3（toll like receptor 3，TLR3）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的關(guān)鍵因子，可上調(diào)多種下游靶基因的表達(dá)，產(chǎn)生多種功能蛋白，參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、代謝、凋亡、血管生成等生物學(xué)功能[21]。本研究結(jié)果顯示，AEG-1表達(dá)與胰腺癌組織中MVD呈正相關(guān)。八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子4是誘導(dǎo)和維持細(xì)胞多能性的主要調(diào)節(jié)因子，SOX2與八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子4表達(dá)異常與多種惡性腫瘤的生物學(xué)行為密切相關(guān)[22]。SOX2-八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子4復(fù)合體共同形成了核心轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)系統(tǒng)，也是WNT/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路的必要因素，因此當(dāng)SOX2高表達(dá)時(shí)，各類(lèi)黏膜上皮分化失去穩(wěn)態(tài)，促進(jìn)腫瘤發(fā)生，同時(shí)也會(huì)導(dǎo)致腫瘤微血管生成和腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)等[23]。本研究中，SOX2高表達(dá)的胰腺癌組織中MVD更高，且與MVD呈正相關(guān)，支持上述結(jié)論。本研究雖獲得一定結(jié)論，但僅是一項(xiàng)單中心研究，且僅做免疫組織化學(xué)檢測(cè)，對(duì)于AEG-1、SOX2與MVD的關(guān)系及其分子機(jī)制還需進(jìn)一步研究予以驗(yàn)證。

綜上所述，胰腺癌組織中AEG-1、SOX2高表達(dá)，且與胰腺癌的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有關(guān)，AEG-1、SOX2表達(dá)與MVD均呈正相關(guān)。