嚴雅 何東儀 聶紅 馮偉 沈逸 姜婷 連艷玲 丁琴

摘 要 目的：探討LLDT-8對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎骨破壞的作用機制。方法：收集取類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的外周血和關(guān)節(jié)滑液，分離外周血單個核細胞（PBMC）和關(guān)節(jié)滑液單個核細胞（SFMC）。PBMC用RANKL和M-CSF分別誘導(dǎo)后加入不同濃度LLDT-8干預(yù)，于24、48、72 h和14 d進行抗酒石酸酸性磷酸酶染色，顯微鏡下對Trap（+）細胞計數(shù)，同時收集上清檢測RANKL、RANK、OPG，比較組間差異。PBMC、SFMC用不同濃度LLDT-8干預(yù)后，用ELISA方法檢測不同標(biāo)本中RANKL、OPG、VEGF的分泌，另外用實時PCR檢測不同標(biāo)本PBMC中 RANKL、OPG、VEGF、MMP-9的表達，以了解LLDT-8對骨破壞相關(guān)因子的影響。結(jié)果：LLDT-8減少PBMC向破骨樣細胞的轉(zhuǎn)化，促進破骨樣細胞的凋亡；LLDT-8抑制VEGF的表達，上調(diào)OPG mRNA表達，同時下調(diào)VEGF、RANKL和MMP-9的表達。結(jié)論：LLDT-8促進破骨樣細胞的凋亡，抑制OC的分化，降低RANKL/OPG比值，下調(diào)VEGF的表達，延緩骨破壞。

關(guān)鍵詞 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎；LLDT-8；骨破壞；細胞因子

中圖分類號：R2 文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：1006-1533（2022）08-0019-06

引用本文 嚴雅， 何東儀， 聶紅， 等. LLDT-8對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎單核細胞向破骨樣細胞轉(zhuǎn)化的作用機制研究[J]. 上海醫(yī)藥， 2022， 43（8）： 19-24， 41.

Study of the mechanism of Leitengshu on the transformation of rheumatoid arthritis monocytes into osteoclast like cells

YAN Ya1， HE Dongyi2， NIE Hong3， FENG Wei4， SHEN Yi2， JIANG Ting2， LIAN Yanling5， DING Qin2（1.General Practice Department of Wujing Community Health Service Center of Minhang District， Shanghai 200241， China； 2. Department of Arthritis of Guanghua Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine Hospital， Shanghai 200052， China； 3. Shanghai Institute of Immunology of Medical School of Shanghai Jiao Tong University， Shanghai 200025， China； 4. Shanghai University of Traditional Chinese Medicine， Shanghai 201203， China； 5. Tianlin Community Health Service Center of Xiuhui District， Shanghai 200032， China）

ABSTRACT Objective： To explore the mechanism of Leitengshu（LLDT-8） on bone destruction in rheumatoid arthritis. Methods： Peripheral blood and synovial fluid were collected from patients with rheumatoid arthritis， Peripheral blood mononuclear cells（PBMC） and synovial fluid mononuclear cells（SFMC） were isolated. PBMCs were induced with RANKL and M-CSF， respectively， and then intervened with different concentrations of LLDT-8， tartrate-resistant acid phosphatase staining was performed at 24， 48， 72 h and 14 d， and Trap（+） cells were counted under a microscope， at the same time， the supernatant was collected to detect RANKL， RANK， and OPG， and the differences between groups were compared. After PBMC and SFMC were intervened with different concentrations of LLDT-8， the secretion of RANKL， OPG and VEGF in different samples was detected by Elisa method， in addition， real-time PCR was used to detect the expressions of RANKL， OPG， VEGF and MMP-9 in PBMC of different specimens to understand the effect of LLDT-8 on bone destruction-related factors. Results： LLDT-8 reduced the transformation of PBMCs into osteoclast-like cells and promoted the apoptosis of osteoclast-like cells； LLDT-8 inhibited the expression of VEGF， up-regulated the expression of OPG mRNA， and down-regulated the expression of VEGF， RANKL and MMP-9. Conclusion： LLDT-8 promotes the apoptosis of osteoclast-like cells， inhibits the differentiation of OC， decreases the RANKL/OPG ratio， down-regulates the expression of VEGF， and delay bone destruction.75F94995-6749-439D-AA8D-1B194A60BA7F

KEY WORDS rheumotoid arthritis； Leitengshu； bone destruction； cytokine

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是臨床上常見的慢性、全身性自身免疫性疾病，病理基礎(chǔ)為滑膜炎，主要表現(xiàn)為對稱性、多發(fā)性、反復(fù)發(fā)作性關(guān)節(jié)炎[1]。雷公藤用于治療RA已有30多年歷史，有大量的臨床和實驗室研究證明其具有肯定的抗炎止痛、免疫調(diào)節(jié)等藥理作用[2]。但雷公藤因為諸多的毒副作用使臨床應(yīng)用受限，故現(xiàn)在提取雷公藤的有效成分以提高其療效和減低毒副作用[3]。LLDT-8，又名雷藤舒或（5R）-5-hydroxytriptolide，是中國科學(xué)院上海藥物研究所對先導(dǎo)化合物雷公藤內(nèi)酯醇進行結(jié)構(gòu)修飾優(yōu)化后所得的全新化合物。前期研究表明，母體雷公藤內(nèi)酯醇在小鼠體外細胞毒性較LLDT-8升高122倍，在小鼠體內(nèi)急性毒性升高約10倍，LLDT-8對小鼠RA模型具有優(yōu)異的治療作用[4]。在體外實驗中發(fā)現(xiàn)，LLDT-8在25 nmol/L和50 nmol/L時可明顯抑制植物血凝素（Phytohemagglutinin，PHA）抗原誘導(dǎo)的T細胞增殖，降低混合性淋巴細胞活性；同時減少PHA-Sac刺激的外周血單個核細胞（Peripheral Blood Mononuclear Cell，PBMC）產(chǎn)生干擾素-g（IFN-g），白細胞介素-2（IL）-2和腫瘤壞死因子-a（TNF-a）等細胞因子[5]。骨破壞是RA的突出表現(xiàn)，骨破壞的機制尚未完全闡明。目前認為，在炎癥通路的啟動、活化和最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)破壞的過程中，破骨細胞起著重要作用[6]。在RA的骨侵蝕中，核因子κB受體活化因子配體（Receptor activator of nuclear factor-κB Ligand，RANKL）和骨保護素（osteoprotegerin，OPG）的參與已經(jīng)得到證實[7]。本研究以RANKL、RANK、OPG和血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）為研究靶點，探討LLDT-8預(yù)防治療RA骨破壞的作用機制。

1 材料與方法

1.1 一般資料

實驗對象為光華醫(yī)院的RA住院患者，其中內(nèi)科患者男性5例，女性25例，年齡（51.58±15.24）歲，病程（12.51±8.08）年；外科手術(shù)患者男性4例，女性8例，年齡（59.33±10.73）歲，病程（16.12±10.77）年。診斷均符合1987年美國風(fēng)濕病學(xué)會診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]。抽取關(guān)節(jié)內(nèi)科30例患者的外周血和12例關(guān)節(jié)外科手術(shù)患者的關(guān)節(jié)滑液。

1.2 實驗方法

將實驗分為NC組（細胞+1640培養(yǎng)液）、CD3/ cytokine組（細胞+1640培養(yǎng)液+CD3單抗）、MTX組（細胞+1640培養(yǎng)液+CD3單抗+MTX 5 μg/mL）和LLDT-8組[細胞+1640培養(yǎng)液+CD3單抗+LLDT-8（LLDT-8濃度分別12.5、25、50 nmol/L）]。

1.2.1 單個核細胞（PBMC或SFMC）懸液的制備

無菌取RA患者外周血（或滑液）10 mL[9]置于肝素抗凝管，加PBS（含2% FBS）對倍稀釋后鋪于預(yù)置5 mL淋巴細胞分離液的離心管中，2 500轉(zhuǎn)/min（離心半徑13.5 cm）離心20 min；予吸管吸取上層白色云霧狀液體（單個核細胞）入另一干凈的離心管中；加PBS 3倍稀釋，2 000轉(zhuǎn)/min（離心半徑13.5 cm）離心10 min后棄上清，加5 mL PBS稀釋并細胞計數(shù)；1 500轉(zhuǎn)/min（離心半徑13.5 cm）離心5 min加10% FBS 1640稀釋至需要濃度。

1.2.2 檢測PBMC向破骨樣細胞誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化

將分離出的PBMC按細胞數(shù)1′106/mL種入12孔板，加入1640培養(yǎng)液、35 ng/mL RANKL和25 ng/mL巨噬細胞集落刺激因子（macrophage colony-stimulating factor，M-CSF）誘導(dǎo)，再加入MTX 5 μg/mL及不同濃度LLDT-8（上海醫(yī)藥集團提供，12.5、25和50 nmol/L），每孔終體積200 uL，每隔24 h用倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)并拍照，將培養(yǎng)14 d的細胞行酒石酸酸性磷酸酶染色，再隨機選取5個鏡下視野進行酒石酸酸性磷酸酶（tartaric acid phosphatase，TRAP）陽性細胞計數(shù)。

1.2.3 檢測LLDT-8對細胞因子RANKL、RANK、OPG分泌的影響

將分離出的PBMC和SFMC分別按細胞數(shù)2×105/孔種板，加入CD3 0.4 μL/孔（終濃度為2 μg/mL刺激，再加入MTX 5 μg/mL及不同濃度LLDT-8（0、12.5、25和50 nmol/L），每孔終體積200 μL，將細胞培養(yǎng)48 h；收取細胞上清用ELISA法檢測細胞因子RANKL、RANK、OPG水平（操作參照試劑盒說明書）。

1.2.4實時（realtime）PCR檢測PBMC中RANKL、OPG、VEGF、MMP-9的表達

將分離出的PBMC按細胞數(shù)2×105/孔種板，加入 CD3 0.4 μL/孔（終濃度為2 μg/mL）刺激，再加入MTX 5 μg/mL及不同濃度LLDT-8（0、12.5、25、50 nmol/L），每孔終體積200 μL，將細胞培養(yǎng)48 h；收取細胞上清加入Trizol 0.5 mL/孔，再加100 uL氯仿，將上層水相RNA（約250 uL）加入等量異丙醇，吸棄上清，晾干，加入15 mL焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC）水，檢測RNA量。取一RNA free管，加試劑液混勻后加標(biāo)本（RNA）11 μL（總體積為20 uL）孵育后停止反應(yīng)，-20℃凍存。配制引物（10 μmol/L），cDNA加DEPC水稀釋，96孔板每孔加cDNA 4.85 μL，熒光染料5 μL，引物0.15 μL，貼膜后上機檢測。 實時PCR引物序列見表1。75F94995-6749-439D-AA8D-1B194A60BA7F

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 17.0分析數(shù)據(jù)，Students t檢驗分析組間差異。先用單因素方差分析，再用雙側(cè)配對或非配對的Students t檢驗。計量資料用x±SE表示。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PBMC向破骨樣細胞誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化

鏡下觀察PBMC經(jīng)RANKL和M-CSF誘導(dǎo)向破骨樣細胞轉(zhuǎn)化的過程中發(fā)現(xiàn)，該方法成功率遠小于大鼠骨髓細胞向破骨樣細胞轉(zhuǎn)化。PBMC直至約培養(yǎng)5 d后才出現(xiàn)少量細胞貼壁，見圖1B。貼壁細胞體積逐漸增大，有偽足，細胞外形出現(xiàn)各種變化，同一個視野里可見圓形、橢圓形、梭形、星狀體形等形狀，細胞生長速度加快，逐漸出現(xiàn)破骨樣細胞形成，細胞體積較大，細胞核分裂、增多，由單核變成多核，細胞形狀不規(guī)則，輪廓清晰，鏡下細胞核較細胞質(zhì)明顯。此后，破骨樣細胞形成增多，細胞體積進一步增大，細胞核也相應(yīng)增多2～20個不等，形態(tài)較前相比更為清楚，易于觀察。7 d時破骨樣細胞數(shù)量最多，達到頂峰，往后細胞開始死亡，細胞膜破裂，細胞質(zhì)流失，細胞形態(tài)改變，失去正常結(jié)構(gòu)，留下異常的細胞輪廓，破骨樣細胞數(shù)量逐漸減少，見圖1C。培養(yǎng)14 d后行TRAP染色，出現(xiàn)少量細胞紅染，見圖1D、1E。行TRAP（+）細胞計數(shù)后發(fā)現(xiàn)，CD3組陽性細胞數(shù)最多（41.33±2.36）個，與之相比NC組（4.33±1.25）個、MTX組（20±4.49）個、LLDT-8 25 nmol/L組（9.33±7.58）個、LLDT-8 50 nmol/L組（13±4.55）個，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），而LLDT-8 12.5 nmol/L組（24±5.71），組間亦存在統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）。從而發(fā)現(xiàn)，LLDT-8抑制PBMC向破骨樣細胞轉(zhuǎn)化，減少OC的形成。

2.2 LLDT-8對細胞因子VEGF、OPG、RANKL分泌的影響

由圖2、3結(jié)果得出，RA患者PBMC及SFMC經(jīng)CD3刺激培養(yǎng)后，各組間VEGF、OPG、RANKL的分泌量基本相等，與CD3組相比，NC組和MTX、LLDT-8不同藥物濃度干預(yù)組組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

2.3 實時PCR檢測標(biāo)本中OPG、RANKL、VEGF、MMP-9的表達

根據(jù)圖4各組的變化趨勢可見，RA患者PBMC經(jīng)CD3刺激培養(yǎng)后，LLDT-8不同藥物濃度干預(yù)組對OPG、RANKL的表達分別有上調(diào)及下調(diào)趨勢，但與CD3組相比，NC組和MTX組、LLDT-8不同藥物濃度干預(yù)組間均差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。MTX組及LLDT-8 25 nmol/L與CD3組比較，VEGF的表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），而NC組、LLDT-8 12.5 nmol/L及50 nmol/L組與CD3組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。而在MMP-9表達上，NC組、MTX組、LLDT-8不同藥物濃度組與CD3組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。表明LLDT-8下調(diào)VEGF和MMP-9的表達，但與不同藥物濃度組間無明顯劑量相關(guān)性。

3 討論

1998年Matsuzaki等[10]報道RANKL可誘導(dǎo)人外周血PBMC生成破骨樣細胞，這為培養(yǎng)人破骨樣細胞提供了新思路。2005年Husheem等[11]報道，利用免疫磁珠性細胞分離技術(shù)從人外周血中分離CD14（+）、CD11b（+）和CD61（+）的單核細胞，用RANKL、M-CSF、TNF-a和地塞米松刺激培養(yǎng)14 d，生成的破骨樣細胞數(shù)目分別是對照組的90、30和20倍。顧淑珠等[12]報道，分離臍血中的PBMC，經(jīng)1，25（OH）2D3誘導(dǎo)培養(yǎng)13 d，可生成多核、TRAP陽性，但沒有骨吸收功能的細胞。破骨細胞含有高水平的抗酒石酸酸性磷酸酶，組織蛋白酶K，基質(zhì)金屬蛋白酶-9等，這些特征性標(biāo)記產(chǎn)物可用于鑒別破骨細胞[13]。

RANKL、RANK和OPG是近年來發(fā)現(xiàn)的與骨吸收和重建密切相關(guān)的細胞因子。RANKL主要表達于破骨細胞前體細胞表面，是參與破骨細胞分化、激活、存活和淋巴結(jié)形成的主要介質(zhì)[14]。巨噬細胞和PBMC轉(zhuǎn)化成破骨細胞依賴于粒細胞集落刺激因子（M-CSF）、RANKL與其膜受體c-Fms和RANK結(jié)合[15]。RANK與RANKL結(jié)合后促進破骨細胞及其前體細胞分化成熟和活化，并阻止破骨細胞凋亡。OPG主要由成骨細胞合成，是RANKL的天然阻滯受體，可阻斷其與RANK的結(jié)合，抑制破骨細胞增殖活化。有研究表明，RANKL/OPG比值可能是骨吸收和重建的重要影響因素[16]。

VEGF具有誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞增殖、促進血管生成和增加毛細血管滲透性等的作用。近期，人們發(fā)現(xiàn)VEGF在風(fēng)濕性疾病的血管病變中起著重要作用，尤其是RA[17]。許多因素影響VEGF的表達，RA PBMC分泌的VEGF被TGF-b和TNF-a上調(diào)，被IL-4、IL-10下調(diào)，而在滑膜中上調(diào)VEGF的因子是TNF-a[18]。Niida等[19]研究證實，VEGF對骨質(zhì)疏松鼠可促進破骨細胞分化、成熟，維持骨髓功能，且達到類似于巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF）的作用，VEGF表達在破骨細胞或前體細胞中，作用為促進其增殖、分化、成熟為破骨細胞。

基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinases，MMP）是MMPs家族成員之一，MMP-9在骨吸收破骨細胞和破骨前體細胞中高水平表達，MMP9對RA關(guān)節(jié)的破壞作用至少有2條途徑。①白細胞介素（IL）-1、腫瘤壞死因子（TNF）-a與RANKL協(xié)同促進MMP-9 mRNA在破骨細胞中表達并增加破骨細胞在骨代謝微環(huán)境及病理條件下的骨吸收活性直接降解軟骨和骨質(zhì)[20]。②MMP9幫助內(nèi)皮細胞分解微血管基底膜和間質(zhì)這兩個屏障，促進血管再生，使RA關(guān)節(jié)滑膜和軟骨交接處滑膜增厚，血管和細胞成分顯著增多，形成血管翳，侵入軟骨，構(gòu)成血管翳/軟骨結(jié)合[21]。75F94995-6749-439D-AA8D-1B194A60BA7F

目前認為破骨細胞增殖的信號傳導(dǎo)有三個途徑：第一個是RANKL/RANK/NF-kB或蛋白激酶JAK（janus kinase）通路，第二個是IL-1等炎癥因子的非RANKL/ RANK依賴通路。兩個通路之間有著密切的聯(lián)系。主要途徑中RANKL與破骨細胞表面的RANK結(jié)合后，激活得RANK將信號傳入細胞內(nèi)，與腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子（TNF receptor associated factors，TRAFs）中的TRAF1、2、3、5及6結(jié)合，可激活轉(zhuǎn)錄因子NF-kB和JAK，從而促進破骨細胞的增殖、分化、成熟。第二個途徑中由RA滑膜和血管翳組織產(chǎn)生的細胞因子例如IL-1、TNF-a，均可誘導(dǎo)單核巨噬細胞系分化為功能性破骨細胞，進而促進骨吸收。第三個途徑考慮為單核細胞可以分泌VEGF，而破骨細胞前體細胞膜上具有VEGF受體，VEGF與VEGF受體結(jié)合使局部黏附激酶（FAK）中的酪氨酸磷酸化，激活破骨細胞的胞外基質(zhì)、整和素FAK的信號傳導(dǎo)通道，促進其不斷增殖、趨化，并募集前體細胞，最終融合形成破骨細胞[22]。

本研究表明，用PBMC誘導(dǎo)向破骨樣細胞的轉(zhuǎn)化方法不如骨髓細胞誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化成熟。LLDT-8能抑制PBMC向破骨樣細胞轉(zhuǎn)化，減少OC細胞的生成。實時PCR結(jié)果顯示LLDT-8能下調(diào)RANKL、VEGF和MMP-9的表達，上調(diào)OPG的表達，降低RANKL/OPG的比值，抑制破骨細胞的增殖活化。而ELISA結(jié)果顯示LLDT-8對PBMC和SFMC VEGF、RANKL和OPG的分泌并無影響。我們推斷，LLDT-8對破骨細胞的抑制作用，可能是直接作用促進其凋亡，而RANKL主要由OC分泌，破骨細胞產(chǎn)生減少，從而影響RANKL的分泌水平；另一方面，LLDT-8可能通過阻斷OC活化的第二、第三途徑達到對OC的抑制作用，由此可以推測，LLDT-8通過減少炎癥因子的釋放，使OC前體細胞失去激活的信號，從而阻斷了OC的活化。

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