馮萬(wàn)宇 陳亮 苗艷 張艷 蘭世捷 沈思思 李丹 張蕾 武曉東 王麗坤 金振華 王巖

摘 要：為研究恩諾沙星懸乳劑在來(lái)航雞體內(nèi)的動(dòng)力學(xué)，以肌注給藥后利用RP-HPLC法測(cè)定雞血漿中恩諾沙星濃度，恩諾沙星Ci-Ti數(shù)據(jù)采用MCPKP藥物動(dòng)力學(xué)計(jì)算機(jī)程序進(jìn)行處理。肌注恩諾沙星后的Ci-Ti數(shù)據(jù)符合一級(jí)吸收二室開(kāi)放性模型，其藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)T1/2α、T1/2β、Vd、CLB和AUC分別為0.25±0.04 h、5.26±0.81 h、4.53±1.07 L/kg、0.61±0.11 L/kg·h、17.39±3.92 μg/mL·h;試驗(yàn)結(jié)論顯示雞注射恩諾沙星后，在體內(nèi)分布廣泛，血藥維持時(shí)間長(zhǎng)、消除緩慢，有較好的臨床應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：恩諾沙星;懸乳劑;藥代動(dòng)力學(xué);雞

恩諾沙星屬畜禽專用的第三代氟喹諾酮類(lèi)抗菌藥物，具有廣譜抗菌、強(qiáng)力殺菌、作用迅速和在動(dòng)物體內(nèi)分布廣的優(yōu)點(diǎn)，與其它抗生素之間無(wú)交叉耐藥，已被廣泛應(yīng)用于國(guó)內(nèi)外家禽、家畜及水產(chǎn)漁業(yè)等動(dòng)物臨床領(lǐng)域[1，2]。目前，臨床應(yīng)用的多為普通注射液，每日多次用藥給臨床應(yīng)用帶來(lái)許多不必要的麻煩，研制長(zhǎng)效制劑是獸醫(yī)臨床用藥之所需[3，4]。

懸乳劑是固體懸浮體與乳狀液混合形成的懸浮乳狀體系，也有人稱其為三相混合物或者懸浮體系[5，6]，通過(guò)緩控藥物釋放來(lái)發(fā)揮其長(zhǎng)效作用[7，8]，其研究始于20世紀(jì)80年代后期。

本研究選擇恩諾沙星懸乳劑為模型藥物，考察恩諾沙星懸乳劑特性，并以來(lái)航雞為動(dòng)物模型來(lái)研究恩諾沙星懸乳劑的藥代動(dòng)力學(xué)特征，克服現(xiàn)有劑型用藥次數(shù)多、作用時(shí)間短及易產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)等方面存在的不足，打破傳統(tǒng)給藥方式的束縛，為獸用藥物新劑型的研發(fā)提供技術(shù)參考，也為恩諾沙星懸乳劑實(shí)現(xiàn)臨床用藥提供理論依據(jù)[9～12]。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 120日齡健康來(lái)航雞10只，購(gòu)于訥河天禹禽業(yè)有限公司，平均體重（1.54 ±0.43）kg。

1.1.2 藥品與儀器 藥品：恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品，凈含量100%，批號(hào)H201501，購(gòu)于中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所;恩諾沙星粉劑，浙江新昌國(guó)幫獸藥廠，批號(hào)141108-2，凈含量99%;恩諾沙星懸乳劑，規(guī)格5 mL：500 mg，批號(hào)20200716，本研究室自制;乙腈為色譜純，磷酸、氫氧化鈉和三乙胺為分析純。

儀器：Agilent 1200液相色譜儀，日本santec公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 試驗(yàn)動(dòng)物給藥 將10只120日齡健康來(lái)航雞預(yù)飼7 d后，取恩諾沙星懸乳劑搖勻，肌肉注射，注射劑量為20 mg/kg·bw。

1.2.2 血樣采集 分別在給藥后0、0.0833、0.5、0.75、1、2、4、6、8、12、24、36、48 h和60 h采取血樣1.5～2 mL，置于裝有適量肝素的試管中，搖勻，經(jīng)4 000 r/min離心15 min，分離后取出血漿，置于-20 ℃冰箱冷凍保存、備用。

1.2.3 血漿樣品處理 吸取血漿100 μL，加入0.5 mL乙腈，漩渦振蕩混合1 min，以15 000 r/min離心10 min，取上清液于60 ℃恒溫水浴鍋中氮?dú)獯蹈?。?.5 mL流動(dòng)相，漩渦混合1 min，15 000 r/min離心10 min，棄去沉淀，以0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾上清液，取樣品20 μL進(jìn)行測(cè)定。

1.2.4 色譜條件 固定相Wasters-C18反相柱（250mm×4.6mm，5μm）;流動(dòng)相0.05 mol/L H3PO4溶液/三乙胺-乙腈（82∶18，體積比）;檢測(cè)器激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為450 nm;柱溫20 ℃;流速1.0 mL/min;進(jìn)樣量20 μL;最低檢測(cè)限0.01 μg/mL;用外標(biāo)法測(cè)定;流動(dòng)相使用前經(jīng)0.5 μm濾膜濾過(guò)，超聲振蕩15 min。

1.3 方法確證

1.3.1 方法專屬性 取空白血漿100μL，按照1.2.3項(xiàng)操作處理，處理后的樣品用高效液相色譜儀進(jìn)行檢測(cè)，可得空白血漿色譜圖;取空白血漿100μL，加入恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品10 μg，用0.03 mol/L氫氧化鈉溶液稀釋，使其恩諾沙星含量為10 μg/mL，按照1.2.3項(xiàng)操作處理，處理后的樣品用高效液相色譜儀進(jìn)行檢測(cè)，可得含恩諾沙星的血漿標(biāo)準(zhǔn)色譜圖;取肌注4 h恩諾沙星待檢血漿樣品，按照1.2.3項(xiàng)操作處理，處理后的樣品用高效液相色譜儀進(jìn)行檢測(cè)，可得恩諾沙星待檢樣品血漿色譜圖。

1.3.2 恩諾沙星血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍 稱取50 mg恩諾沙星對(duì)照品，用0.03 mol/L氫氧化鈉稀釋為濃度1 mg/mL儲(chǔ)備液為母液，4 ℃保存?zhèn)溆?。各離心管中加入0.5 mL空白血漿，將恩諾沙星對(duì)照品母液加入其中，使各藥物濃度為0.02、0.05、0.1、0.5、1.0、3.0 μg/mL和5.0 μg/mL，依1.2.3項(xiàng)處理后，從低濃度到高濃度作HPLC分析。每個(gè)濃度作3次重復(fù)，用重復(fù)性試驗(yàn)好的數(shù)據(jù)，以縱坐標(biāo)為峰面積、橫坐標(biāo)為質(zhì)量濃度，求線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)，并制作血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)相關(guān)系數(shù)，對(duì)血漿中恩諾沙星線性范圍進(jìn)行估測(cè)。

1.3.3 回收率測(cè)定 取空白血漿，將恩諾沙星對(duì)照品母液加入其中，使其濃度為0.1、0.5、1.5 μg/mL，依1.2.3項(xiàng)處理后進(jìn)行HPLC數(shù)據(jù)分析，并以恩諾沙星血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算其濃度，以其濃度和加入量進(jìn)行比較，同時(shí)計(jì)算不同濃度恩諾沙星回收率，每個(gè)作3次重復(fù)。

1.3.4 方法精密度的測(cè)定 在空白血漿中加入恩諾沙星母液，使?jié)舛确謩e為0.1、0.5、1.5 μg/mL，按1.2.3項(xiàng)處理后，測(cè)得恩諾沙星峰面積，每個(gè)濃度日內(nèi)作3次重復(fù)，共作3個(gè)批次。計(jì)算批間及批內(nèi)峰面積離散系數(shù)CV，估算本定量方法的精密度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Mintab 17軟件處理，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示;藥-時(shí)數(shù)據(jù)采用MCPKP藥物動(dòng)力學(xué)計(jì)算機(jī)程序軟件進(jìn)行計(jì)算、統(tǒng)計(jì)和擬合模型，并通過(guò)相關(guān)系數(shù)判斷擬合模型好壞，同時(shí)計(jì)算出藥動(dòng)學(xué)有關(guān)參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法確證數(shù)據(jù)與分析

2.1.1 恩諾沙星專屬性分析 在本色譜條件下，恩諾沙星保留時(shí)間為5.24～5.27 min，與雜峰分離良好。空白血漿色譜圖見(jiàn)圖1，空白血漿+恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖見(jiàn)圖2，待檢血漿樣品恩諾沙星色譜圖見(jiàn)圖3。

2.1.2 恩諾沙星血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定及線性范圍測(cè)定 將恩諾沙星對(duì)照品添加至血漿中制成不同濃度溶液進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果如表1所示。以峰面積x對(duì)恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)液濃度Y求得回歸方程：Y=94020x+4579.0，構(gòu)建的恩諾沙星血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖4。相關(guān)系數(shù)r=0.9994，表明待測(cè)樣品中恩諾沙星濃度在0.02～5.0 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系，最低檢測(cè)限為0.02 μg/mL。

2.1.3 回收率試驗(yàn)結(jié)果 血漿樣品中恩諾沙星的回收結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可見(jiàn)，在0.1～1.5 μg/mL范圍內(nèi)，血漿樣品中恩諾沙星平均回收率為89.53%，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確，符合藥動(dòng)學(xué)要求，方法可行。

2.2 恩諾沙星懸乳劑在雞體內(nèi)藥物動(dòng)力學(xué)分析

雞注射恩諾沙星懸乳劑后，血中藥物濃度隨時(shí)間變化情況見(jiàn)表4。經(jīng)藥動(dòng)學(xué)軟件分析進(jìn)行濃度-時(shí)間擬合，結(jié)果表明恩諾沙星懸乳劑在雞體內(nèi)的消除符合一級(jí)吸收二室開(kāi)放模型，動(dòng)力學(xué)參數(shù)見(jiàn)表5。藥物-時(shí)間曲線圖見(jiàn)圖5。

3 討論

恩諾沙星特點(diǎn)之一是起效快，但從體內(nèi)排出去也快，常規(guī)注射劑型一般需要用藥2次/d。已有試驗(yàn)研究證實(shí)，應(yīng)用恩諾沙星混懸液治療人工誘發(fā)動(dòng)物大腸桿菌病，應(yīng)用療效確實(shí)可行，給藥一次即可控制病情[11，12];對(duì)重癥動(dòng)物或頑固細(xì)菌感染疾病，療效也相當(dāng)滿意[13，14]。研究長(zhǎng)效恩諾沙星注射液肌注后在豬體內(nèi)的藥物動(dòng)力學(xué)，研究結(jié)果表明，經(jīng)5.64 h達(dá)到最高濃度4.86 μg/mL，吸收半衰期和消除半衰期分別為2.42 h和19.47 h，有效濃度維持時(shí)間為128.73 h，AUC為166.96 mg/L·h，

吸收半衰期顯著延長(zhǎng)，達(dá)峰時(shí)間極顯著推遲（p<0.01），消除半衰期也顯著長(zhǎng)于恩諾沙星注射液[15-16]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)來(lái)航雞肌注20mg/kg恩諾沙星懸乳劑后在體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)顯示，在雞體內(nèi)能迅速達(dá)到較高濃度，血漿達(dá)峰濃度Cmax為2.702 μg/mL，吸收半衰期和消除半衰期分別為0.25 h和5.26 h，AUC為17.39 μg/mL·h，這說(shuō)明恩諾沙星制成懸乳劑后具有一定的緩釋作用，肌注后藥物從血中消除的速率（0.611 h）明顯慢于普通注射劑[17-19]，而且肌注24 h后血漿藥物濃度（0.118～0.851 μg/mL）明顯高于最低抑菌濃度0.08～0.75μg/mL[20-21]，血藥濃度維持時(shí)間也長(zhǎng)達(dá)60 h以上。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，恩諾沙星懸乳劑在雞體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)特征優(yōu)良，血藥濃度維持時(shí)間也較長(zhǎng)，可減少臨床用藥次數(shù)。此外，由于恩諾沙星懸乳劑工廠化生產(chǎn)工藝比較簡(jiǎn)單，制作成本相對(duì)低，非常容易實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。因此，恩諾沙星懸乳劑是一種具有廣泛開(kāi)發(fā)和應(yīng)用前景的獸醫(yī)臨床可用的新型抗菌藥劑。

參考文獻(xiàn)：

[1] 張航俊，周芷錦，侯軒，等.恩諾沙星、氟苯尼考和泰萬(wàn)菌素在雞蛋中殘留消除規(guī)律研究[J].食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào)，2021，12（19）：7851-7856.

[2] 趙琳，張瑞英，孫向東，等.產(chǎn)前飼喂模式下恩諾沙星在初產(chǎn)蛋中的殘留規(guī)律及膳食暴露評(píng)估[J].食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào)，2021，12（18）：7473-7479.

[3] 單祥保，方龍香，施羽露，等.利用多介質(zhì)環(huán)境逸度模型比較典型抗生素磺胺甲噁唑和恩諾沙星在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的環(huán)境歸趨[J].生態(tài)與農(nóng)村環(huán)境學(xué)報(bào)，2021，37（08）：1059-1065.

[4] 朱曉漫，劉永濤，楊秋紅，等.恩諾沙星乳在羅非魚(yú)體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)及組織分布[J].淡水漁業(yè)，2021，51（04）：42-48.

[5] 戴燕彬.恩諾沙星及其代謝產(chǎn)物在珍珠龍膽石斑魚(yú)（Epinephelus fuscoguttatus ♀×Epinephelus lanceolatus ♂）體內(nèi)的代謝及消除規(guī)律[J].漁業(yè)研究，2021，43（03）：299-306.

[6] 王美紅. 恩諾沙星可溶性粉混飲給藥在雛雞的藥動(dòng)學(xué)特征[D].揚(yáng)州：揚(yáng)州大學(xué)，2021.

[7] 張佩，劉雪松，姜巖，等.恩諾沙星在比格犬體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2020，41（12）：132-136.

[8] 許穎，邱陽(yáng)陽(yáng)，沈悅，等.恩諾沙星納米乳的制備及噴霧給藥的藥效學(xué)評(píng)價(jià)[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2021，42（01）：42-48.

[9] 唐敏敏，朱磊，欒楓婷，等.恩諾沙星在雪山雞不同組織中殘留消除規(guī)律研究[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2020，48（21）：215-219.

[10] 侯軒，周煒，陳勇，等.HPLC-MS/MS法研究恩諾沙星在雞蛋中殘留消除規(guī)律[J].畜牧與飼料科學(xué)，2020，41（05）：46-51.

[11] 黃銖玉，方龍香，宋超，等.抗生素恩諾沙星在漁業(yè)中的研究進(jìn)展[J].農(nóng)學(xué)學(xué)報(bào)，2019，9（11）：57-62.

[12] 杜昕悅，楊哲敏，趙宇，等.恩諾沙星與其他氟喹諾酮類(lèi)藥聯(lián)合對(duì)畜禽常見(jiàn)病原菌抑菌效果探討[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2019（20）：140-143.

[13] 王玉萬(wàn)，潘貞德，戴曉曦.含阿維菌素類(lèi)抗寄生蟲(chóng)藥物的長(zhǎng)效注射劑：中國(guó)，ZlL031568769[P]. 2006-05-22.

[14] 肖田安，尹燁華，梁眷衡，等.恩諾沙星長(zhǎng)效注射液肌注后在豬體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)研究[J].中國(guó)獸藥雜志，2002（04）：21-23.

[15] 肖田安，陳杖榴.氟喹諾酮類(lèi)藥物在動(dòng)物體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)研究進(jìn)展[J].中國(guó)獸藥雜志，2000（01）：59-61.

[16] 孫紅洋，白玉惠，尹暉，等.高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)雞蛋和雞組織中恩諾沙星、環(huán)丙沙星殘留的研究[J].中國(guó)家禽，2020，42（07）：54-58.

[17] 王旗，余永濤，馬春芳，等.恩諾沙星可溶性粉中有效成分含量的HPLC測(cè)定[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2020，41（09）：41-45.

[18] 邱陽(yáng)陽(yáng).禽用恩諾沙星納米乳的制備及藥效學(xué)評(píng)估[D].廣州華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2019.

[19] 劉婉玉，Tadiyose G B，趙洪霞.恩諾沙星在鯽魚(yú)肝微粒體中的代謝及代謝關(guān)鍵酶[J].生態(tài)毒理學(xué)報(bào)，2020，15（03）：64-70.

[20] 羅晶晶，張秀珍，宋懌，等.不同水溫條件下恩諾沙星及其代謝物在俄羅斯鱘體內(nèi)的代謝及消除規(guī)律[J].食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào)，2020，11（06）：1749-1757.

[21] 鄭育基，全家興，霍皓遠(yuǎn)，等.恩諾沙星及其代謝物在1日齡雞體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)研究[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2019，40（11）：59-62.